Summary
Biz üç basit in vitro tahliller-uzun mesafe göç tahlil, co-kültür göç tahlil ve kemo-attraction tahlil-topluca insan kök hücre perisiyitli endotel hücreleri ve bunların işlevlerini değerlendirmek GABAerjik internöronlar ile etkileşim.
Abstract
Beyin hastalıklarının sinir sistemi gelişiminde ve etiyolojisinde beyin vaskülatürünün rolü giderek daha fazla dikkat çekmaktadır. Bizim son çalışmalar vasküler hücrelerin özel bir popülasyon tespit ettik, periventriküler endotel hücreleri, embriyonik gelişim sırasında ön beyin GABAerjik internöronların göçü ve dağılımında kritik bir rol oynamaktadır. Bu, hücre özerk fonksiyonları ile birleştiğinde, şizofreni, epilepsi ve otizm gibi nöropsikiyatrik bozuklukların patolojiperiventriküler endotel hücrelerinin yeni rolleri ima eder. Burada, biz topluca periventriküler endotel hücrelerinin fonksiyonlarını ve GABAerjik internöronlar ile etkileşimini değerlendirmek üç farklı in vitro tahliller tarif ettik. Bu tahlillerin, özellikle de insan bağlamında kullanılması, periventriküler endotel hücreleri ile beyin bozuklukları arasındaki bağlantıyı belirlememize olanak sağlayacaktır. Bu tahliller basit, düşük maliyetli ve tekrarlanabilir ve herhangi bir bağlı hücre türüne kolayca uyarlanabilir.
Introduction
Endotel hücreleri kan damarlarının astarı oluşturur ve damar duvarı geçirgenliğinin sürdürülmesi, kan akışının düzenlenmesi, trombosit agregasyonu ve yeni kan damarlarının oluşumu nu içeren önemli işlevlere aracılık eder. Beyinde, endotel hücreleri sıkı beyin ve kandolaşımı1 arasındaki malzeme alışverişini sıkı bir şekilde kontrol kritik bir kan-beyin bariyerinin bir parçası nı oluşturur. Sonon yılda çalışmalarımız beyin gelişimi vedavranışı2,3,4,5için önemli etkileri olan beyin endotel hücrelerinin yeni nörojenik rolleri tespit var. Biz fare embriyonik ön beynin damarların iki farklı alt tipleri, pial damarlar ve periventriküler damarlar, anatomi farklı tarafından vaskülarize olduğunu göstermiştir, kökeni, ve gelişimprofili2. Bu iki damar alt tipini kaplayan endotel hücreleri gen ekspresyonu profillerinde belirgin farklılıklar göstermektedir. Pial endotel hücreleri çoğunlukla inflamasyon ve immün yanıt ile ilgili genleri ifade ederken, periventriküler endotel hücreleri yaygın nörogenez, nöronal göç, kemotaksis ve akson rehberlik ile ilişkili genlerin ekspresyonu nda benzersiz zenginleştirilmiş3. Periventriküler endotel hücreleri de geleneksel nöronal GABA sinyal yolu farklı bir yeni GABA sinyal yolu ev5. Gen ekspresyonu ile birlikte, periventriküler endotel hücreleri gelişmekte olan neokortekste GABAerjik internöronların göçünü ve dağılımını düzenleyen bulunmuştur. Embriyonik gelişim sırasında, periventriküler endotel hücreleri periventriküler vasküler ağ kurmak için bir ventral-dorsal gradyan boyunca uzun mesafe göç geçmesi2,3. Bu göç yolu bir gün sonra internöronlar tarafından yansıtılır. Göç eden internöronlar önceden oluşturulmuş periventriküler vasküler ağ ile fiziksel olarak etkileşime girerek neokorteksteki son hedeflerine ulaşmak için bir kılavuz olarak kullanırlar. Fiziksel bir substrat olarak hareket ek olarak, periventriküler endotel hücreleri göç nöronlar için navigasyon ipuçları kaynağı olarak hizmet vermektedir. Periventriküler endotel hücre salgılanan GABA internöron göç kılavuzları ve son dağılım desenleri düzenler4. İnternöron göçü ve dağılımındaki bozukluklar otizm, epilepsi, şizofreni ve depresyon gibi nöropsikiyatrik bozukluklarla ilişkilidir6,7,8,9,10. Bu nedenle, periventriküler endotel hücre fonksiyonlarının incelenmesi ve insan bağlamında internöron göçü üzerindeki etkileri bu bozuklukların patogenezi ele almak için kritik hale gelir.
Biz laboratuvar11insan embriyonik kök hücrelerinden insan periventriküler benzeri endotel hücreleri ürettik , indüklenen pluripotent kök hücre kullanarak (iPSC) teknolojisi12,13. İnsan periventriküler endotel hücrelerinin fare periventriküler endotel hücrelerini sadakatle taklit edip etmediğini doğrulamak ve internöron göçü üzerindeki etkilerini nicel olarak değerlendirmek için üç in vitro tahlil geliştirdik: uzun mesafeli göç tahlilleri, ortak kültür göç tahlilleri ve bir kemo-attraction tahlil. Burada ayrıntılı olarak bu tahliller için protokolleri açıklar. Her üç tahliller hücre-serbest alan ile çevrili hücrelerin küçük bir dikdörtgen yama (sabit boyutlarda) oluşturmak için silikon kültür eklerin kullanımına dayanmaktadır. Göç mesafesi, 0. Uzun mesafeli göç testinde, insan periventriküler endotel hücreleri 35 mm'lik bir kabın ortasında yama olarak tohumlanır ve hücrelerin uzun bir zaman aralığında kat ettiği mesafeler hesaplanır. Eş-kültür göç analizinde, insan periventriküler endotel hücreleri 35 mm çanak bir yama olarak insan internöronlar ile birlikte tohumlu. Bu kurulum, bu iki hücre türünün doğrudan fiziksel etkileşimlerinin internöronların geçiş hızı üzerindeki etkisinin incelenmesini sağlar. Kemo-attraction test insan periventriküler endotel hücreleri tarafından salgılanan kemo-çekici ipuçlarıyanıt olarak internöronlerin göç ölçer. İnternöronlar dikdörtgen yama olarak tohumlanır, insan periventriküler endotel hücreleri ile ve kontrol olmayan periventriküler endotel hücreleri her iki tarafta benzer büyüklükte yamalar olarak tohumlu. Hücre yamaları her biri 500 μm hücresiz bir boşluk ile ayrılır.
Bu tahliller insan periventriküler endotel hücre fonksiyonları ve internöron göçü üzerindeki etkileri sağlam bir değerlendirme sağlar. Uzun mesafe lisyon analizi ve ortak kültür göç analizinin yeni kurulumu, uzun mesafeli göçün algılanmasına olanak sağlamak için santimetre (~1-1,5 cm) aralığında hücresiz alan sağlar. Diğer popüler tahlillere göre tahlillerimizin özelliklerinin bir özeti Tablo 1'desunulmuştur. Topluca, burada açıklanan tahliller şizofreni, otizm veya epilepsi gibi beyin bozukluklarının inpscs oluşturulan "hastalıklı" periventriküler endotel hücreleri ve internöronlar değerlendirmek için bir platform olarak hizmet edecektir. Bu tahliller aynı zamanda farklı koşulların (örn. inhibitörler, ligandlar, RNAi) hücre göçlerini nasıl etkilediğini belirlemek için de kullanılabilir. Son olarak, bu tahliller uzun mesafe göç, kemo-attraction veya hücre-hücre aracılı geçiş ölçmek için diğer hücre türleri için optimize edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kültür ve İnsan Periventriküler Endotel Hücrelerinin Depolanması
- 37 °C ve %5 CO2'de(50 ng/mL VEGF-A içeren E6 orta- ibaratif) 6-iyi plakalar olan bodrum membran matris kaplı (Bkz. Malzeme Tablosu)üzerinde insan periventriküler endotel hücrelerini koruyun. Her alternatif gün orta değiştirin.
- 4 °C'de çözülür ve soğuk DMEM/F12 ortamda seyrelterek 1:100 çözeltisi yapın. 1 mL matris çözeltisi ile 6 kuyulu bir plakanın her kuyusunu kaplayın. Kullanmadan önce en az 1 saat boyunca 37 °C'de kuluçka plakaları.
- İnsan periventriküler endotel hücrelerinin %80-90 arasında bir kesişme düzeyine ulaşmasına izin verin. Kuyudan aspire ortamı. Kuyuları her kuyuda 1 mL steril 1x PBS ile bir kez yıkayın.
- Hücreleri her kuyubaşına 1 mL hücre dissosyasyon çözeltisi ekleyerek ayırın (Bkz. Malzeme Tablosu). 37 °C'de 5 dk kuluçkaya yatırın. 5 dk sonra, periventriküler endotel hücreli orta 1 mL ekleyin. Hücre çözeltisini 15 mL konik tüpe aktarın.
NOT: Bölüm 3 ve 4'teki TrypLE'nin aksine, burada hücre bölünmesi için Accutase kullanıyoruz. - Oda sıcaklığında 5 dk için 500 x g centrifuge hücreleri, supernatant aspire ve periventriküler endotel hücreli orta 1 mL hücre pelet resuspend.
- Trypan mavi dışlama yöntemini kullanarak canlı hücreleri sayın. 1.2 x 105 hücre/cm2yoğunlukta taze matris kaplı tabaklarda tohum hücreleri. 37 °C ve %5 CO2'dekuluçkaya yatırın.
- Donma ortamda kriyomuhafaza ederek insan periventriküler endotel hücrelerini saklayın (%90 periventriküler endotel hücreli orta ve %10 DMSO).
- Yukarıdaki 1.3 ve 1.4 adımlarını izleyerek hücreleri ayırın ve toplayın. Trypan mavi dışlama yöntemi ile çözeltideki hücreleri sayın.
- Oda sıcaklığında 5 dk için 500 x g santrifüj hücreleri. Supernatant aspire ve donma ortamı5 x 106 hücreleri / mL hücre pelet resuspend.
- Cryovial başına 1 mL donma ortamı artı hücreler dağıtın. Şişeleri izopropanol dolu hazneye yerleştirin ve -80 °C'de 1 °C/dk. Şişeleri uzun süreli depolama için ertesi gün sıvı nitrojen tankına aktarın.
2. İnsan Periventriküler Endotel Hücrelerinin Test için Hazırlanması
- İnsan periventriküler endotel hücrelerinin %70-80 biraraya gelmesine izin verin.
- Yukarıda açıklandığı gibi 1.3-1.5 adımlarını izleyerek hücreleri ayırın. Trypan mavi dışlama yöntemini kullanarak hücreleri sayın.
3. Araştırma için İnsan GABAerjik Internöronların Hazırlanması
NOT: İnsan indüklenen pluripotent kök hücre (iPSC)-türetilmiş GABAerjik internöronlar ve nöronal ortam ticari olarak satın alınmıştır (Bkz. Malzeme Tablosu). Nöronlar üretici tarafından geliştirilen bir protokol aşağıdaki bir insan fibroblast türetilmiş iPSC hattı ayırt tarafından oluşturulur. Hücreler üreticinin protokolüne göre çözülmüş ve kültürlenmiştir.
- Çözülme insan GABAerjik internöronlar ve kültür 12-iyi plaka iki hafta boyunca% 70-80 bir araya.
- Tüzüntasyon gününde, sıcak hücre dissosiyasyon çözeltisi (Bkz. Malzemeler Tablosu)ve kullanmadan önce 10 dakika boyunca 37 °C'de nöronal ortamın aliquot'u.
- Hücreleri içeren her kuyudan aspire ortamı. Hücreleri 1 mL steril 1x PBS ile iyi yıkayın.
- Hücreleri kuyu başına 0,5 mL önceden ısıtılmış ayrıştırma çözeltisi ekleyerek ayırın ve 37 °C'de 5 dk. Kuyu başına 1 mL nöronal ortam ekleyin. Hücre çözeltisi 15 mL konik tüpe aktarın. Hücre kümelerini birbirinden ayırmaya hafifçe trituat.
- Oda sıcaklığında 5 dakika için 380 x g centrifuge hücreleri, supernatant aspire ve nöronal ortamda 1 mL hücre pelet resuspend. Trypan mavi dışlama yöntemini kullanarak canlı hücreleri sayın.
4. Kontrol İnsan Endotel Hücrelerinin Kontrolün Hazırlanması
NOT: Kontrol insan iPSC kaynaklı endotel hücreleri ve endotel hücre ortamı ticari olarak satın alınmıştır (Malzeme Tablosu). Bu endotel hücreleri, üretici tarafından geliştirilen bir protokol uyarınarak insan fibroblastı türetilmiş iPSC hattını endotel kaderine ayırarak oluşturulur. Hücreler üreticinin protokolüne göre Fibronectin substratı üzerinde çözülmüş ve kültürlenmiştir. İmalatçı protokolüne göre fibronektin kaplamalı plakalar hazırlandı.
- Çözülme kontrol insan endotel hücreleri ve kültür 6-iyi plaka içinde% 80-90 bir araya.
- Tüzüntasyon gününde, sıcak hücre dissosiyasyon çözeltisi (Bkz. Malzemeler Tablosu)ve kullanmadan önce 10 dakika boyunca 37 °C'de endotel ortasının aliquot'u.
- Hücreleri içeren her kuyudan ortam aspire edin. Hücreleri 1 mL steril 1x PBS ile iyi yıkayın.
- Hücreleri, önceden ısıtılmış dissosiasyon çözeltisi başına 0,5 mL ekleyerek ayırın. 5 dk. Ayrıştırma çözeltisini nötralize etmek için her kuyubaşına 1 mL endotel hücreli orta ekleyin. Hücre çözeltisi 15 mL konik tüpe aktarın.
- Oda sıcaklığında 5 dk için 200 x g santrifüj hücreleri. Aspire supernatant ve endotel hücreli orta 1 mL hücre pelet resuspend. Trypan mavi dışlama yöntemini kullanarak canlı hücreleri sayın.
5. Tek Kuyulu Kültür Eklerin Hazırlanması
- Oda sıcaklığında veya geceleme 4 °C'de 1 mg/mL laminin çözeltisi çözülme.
- %0,01 poli-L-ornitin çözeltisi (çanak başına 1 mL) ile uygun sayıda 35 mm çanak katlayın. En az 1 saat oda sıcaklığında bulaşıkları kuluçkaya yatırın.
- Kullanmadan hemen önce steril suda 1 mg/mL laminin çözeltisini 3.3 g/mL'lik son konsantrasyona seyreltin.
- Her yemekten tamamen poli-L-ornitin aspire edin. Poli-L-ornitin kaynaklı hücre toksisitesini önlemek için her yemeği steril su yla 3 kat iyice durulayın ve tamamen aspire edin.
- Her çanağa 1 mL 3,3 g/mL laminin çözeltisi ekleyin ve bir gecede 37 °C'de veya en az 1 saat. Kullanımdan hemen önce lamine çözeltisini yemekten çıkarın.
NOT: Alternatif olarak, laminin içeren yemekleri 4 °C'de saklayabilirsiniz. Kullanmadan önce 37 °C'lik hücre kültürü kuluçka makinesinde bulaşıkları dengeleyin. - İki kuyulu silikon kültür kesici bir kuyunun üç tarafını kesin(Şekil 1A) steril bir bıçak kullanarak tek kuyulu bir kesici uç üretirler (Şekil 1B).
NOT: İki kuyulu kesici ucunu, düzgün bir kesim sağlamak ve kesici uç yapışkanlığını korumak için parçalarken orijinal ambalajın yüzeyine sıkıca bağlı tutun. - Bulaşıklardan aspire laminin çözeltisi.
NOT: Lamina inkübasyonundan sonra bulaşıkları steril PBS veya su ile yıkamayın. Islönme yüzeyler kültür ekinin sıkı yapışmasını önler. - Steril cımbızla tek kuyulu kesici yi çıkarın ve poli-L-ornitin/laminin kaplı yemeğin ortasına yerleştirin. Yemeğin yüzeyine sabitlemek için kesici uç kenarları boyunca bastırın.
- Kesici ucun sıkıca yapışmış olduğundan doğrulamak için yemeği dikkatlice ters çevirin.
- Çanak baş aşağı tutun ve ultra ince ucu ile kalıcı bir siyah marker kullanarak kesici uç bölmesi sınırını işaretleyin(Şekil 1C).
6. Uzun Mesafe Göç Teşrisi
- Askıya insan GABAerjik internöronlar bir konsantrasyonda 3 x 104 hücre/70 μL nöronal orta. Her bir iyi kültür eklemek içinde hücre çözeltisi Tohum 70 μL.
NOT: İnternöronların tohumlama yoğunluğu üreticinin tavsiyesine göre dir. - Periventriküler endotel hücreli ortamın 3 x 104 hücre/70 μL konsantrasyonunda insan periventriküler endotel hücrelerini askıya alın. Her bir iyi kültür eklemek içinde hücre çözeltisi Tohum 70 μL.
NOT: Tohumlu nöronların sayısı ile 1:1 oranında tohumlanmış insan periventriküler endotel hücrelerinin sayısı. - Kesici uç çevresindeki alanı doldurmak ve kaplamanın kurumasını önlemek için nöron kabına 1 mL nöronal ortam ekleyin. Benzer şekilde, periventriküler endotel hücreli çanak periventriküler endotel hücreli orta 1 mL ekleyin.
NOT: Kesici uç rahatsız olmasın diye yemeğin kenarı boyunca orta yıyavaşça ekleyin. - Hücrelerin kesici uç bölmesinden sızmadığını doğrulamak için mikroskop altında kontrol edin.
- 37 °C'de 24 saat ve %5 CO2'dekuluçka hücreleri . 24 saat kuluçkadan sonra, hücrelerin düzgün bağlı olduğunu ve bir gecede sızıntı olmadığını doğrulamak için mikroskop altında kontrol edin.
- 48 saat tohumlamadan sonra, serti steril bir cızırtıcı kullanarak hafifçe çıkarın. Hücre tabakasının bozulmadan kaldığını doğrulamak için mikroskop altında kontrol edin (gün 0).
- Nöron çanak orta çıkarın ve taze nöronal orta 1 mL ekleyin. Benzer şekilde, periventriküler endotel hücreli çanak orta çıkarın ve taze periventriküler endotel hücreli orta 1 mL ekleyin.
NOT: Gün 0 görüntüler için gerekli sayıda yemeği bir kenara koyun ve %4 PFA ile düzeltin. - 37 °C'de 5 gün ve %5 CO2'deinküler. 5 gün sonra orta yıkayın, 10 dakika boyunca %4 PFA ile hücreleri düzeltin ve 1x PBS ile 3x yıkayın.
- Anti-insan β-Tubulin veya anti-insan MAP2 antikor ile leke nöronlar, ve anti-insan CD31 antikor ile endotel hücreleri. İmmünoboyama sonunda, her çanağa 1 mL antifade montaj ortamı ekleyin.
7. Ortak Kültür Göç Analizi
- Co-askıya 3 x 104 GABAerjik internöronlar ve 3 x 104 insan periventriküler endotel hücreleri 70 μL co-kültür ortamı (%50 periventriküler bakım ortamı GABA ve% 50 nöronal orta olmadan). Bu hücre çözeltisini tek kuyudaki kesici uç bölmesinin içine yerleştirin. Bu tür bir adaçayı yemekleri uygun sayıda hazırlayın.
NOT: GABA göç üzerinde eksojen GABA etkisini dışlamak için ortak kültür orta eklenmedi. - Hücrelerin kesici uç bölmesinden sızmadığını doğrulamak için mikroskop altında kontrol edin.
- Kaplamanın kurumasını önlemek için yemeğin yan tarafına yavaşça 1 mL co-kültür ortamı ekleyin.
NOT: Kesici uç rahatsız olmasın diye yemeğin kenarı boyunca orta yıyavaşça ekleyin. - İlk kontrol olarak, tohum 3 x 104 insan GABAerjik internöronlar sadece 70 μL co-kültür orta başına bir-iyi eklemek. Bu tür yemeklerin uygun sayıda hazırlayın.
- İkinci bir kontrol olarak, co-tohum 3 x 104 GABAerjik insan internöronlar ile 3 x 104 kontrol insan endotel hücreleri 70 μL co-kültür orta başına bir-iyi eklemek. Uygun sayıda yemek hazırlayın.
- 37 °C ve %5 CO2'de24 saat boyunca tabakları kuluçkaya yatırın. 24 saat kuluçkadan sonra, hücrelerin düzgün bağlı olduğunu ve sızıntı olmadığını doğrulamak için mikroskop altında kontrol edin.
- 48 saat tohumlamadan sonra, serti steril bir cızırtıcı kullanarak hafifçe çıkarın. Hücre tabakasının rahatsız olmadığını doğrulamak için mikroskop altında kontrol edin (gün 0).
- Orta çıkarın ve taze co-kültür orta 1 mL ekleyin.
NOT: Gün 0 görüntüleri elde etmek için uygun sayıda yemek bir kenara koyun. - 37 °C'de 5 gün ve %5 CO2'deinküler.
- 5 gün sonra orta yıkayın, 10 dakika boyunca %4 PFA ile hücreleri düzeltin ve 1x PBS ile 3x yıkayın.
- Anti-insan β-Tubulin veya anti-insan MAP2 antikor ile lekeler nöronlar etiketlemek için. İmmünoboyama sonunda, her çanağa 1 mL antifade montaj ortamı ekleyin.
8. Chemo-attraction Assay
- Steril cımbız kullanarak poli-L-ornitin/laminin kaplı 35 mm çanak ortasına üç kuyulu bir kültür kesici yerleştirin.
- Tabağı ters çevir. Ultra ince uçlu kalıcı siyah bir işaretleyici kullanarak kesicinin orta bölmesinin etrafındaki sınırı işaretleyin.
- Tohum 3 x 104 nöronal ortamda 70 μL orta bölmede insan GABAerjik internöronlar (Şekil 3A).
- Tohum 104 insan periventriküler endotel hücreleri 70 μL periventriküler endotel hücreli orta ve 104 kontrol endotel hücreleri 70 μL kontrol endotel hücreli orta kontrol iki dış bölmelerde sırasıyla(Şekil 3A).
- Çanak taki kaplamanın kurumasını önlemek için yemeğin yan tarafına 1 mL co-kültür ortamı (%50 gaba sız ani periventriküler bakım ortamı ve %50 nöronal ortam) ekleyin.
- Hücrelerin kesici uç bölmesinden sızmadığını doğrulamak için mikroskop altında kontrol edin.
- 37 °C'de 24 saat ve %5 CO2'dekuluçka hücreleri . 24 saat kuluçkadan sonra, hücrelerin düzgün bağlı olduğunu ve sızıntı olmadığını doğrulamak için mikroskop altında kontrol edin.
- 48 saat tohumlamadan sonra, serti steril bir cızırtıcı kullanarak hafifçe çıkarın. Hücre tabakasının rahatsız olmadığını doğrulamak için mikroskop altında kontrol edin (gün 0).
- Orta çıkarın ve taze co-kültür orta 1 mL ekleyin.
NOT: Gün 0 görüntüler için gerekli sayıda yemeği bir kenara koyun. - 37 °C'de 36 saat ve %5 CO2'dekuluçka hücreleri . 36 saat sonra, aspire orta, 10 dakika için% 4 PFA ile hücreleri düzeltmek ve 1x PBS ile 3x yıkayın.
- Leke insan GABAerjik internöronlar anti-insan β-Tubulin veya anti-insan MAP2 antikor ile. Boyama işleminin sonunda, her bir tabağa 1 mL antifade montaj ortamı ekleyin.
9. Görüntüleme ve Veri Analizi
- 4X büyütme de bir mikroskop altında immüno lekeli istibak çanak yerleştirin.
- Dikdörtgen sınırın (yukarıda 5.10 adımda yapılmış) uzun kenarını görüş alanında tutun. Bu sınıra bitişik hücre serbest uzayda hücrelerin görüntülerini alın. Dikdörtgen sınırın sağ uzun kenarı ve sol uzun kenarı boyunca görüntüler edinin (Şekil 2B).
NOT: Dikdörtgene göre çapraz olarak konumlandırılmış hücreler, başlangıç işareti olarak kısa veya uzun kenar seçiminde belirsizlik nedeniyle dikkate alınmaz. Ayrıca, kısa kenar boyunca göç eden hücre sayısı genellikle önemli ölçüde daha azdır (muhtemelen kısa kenar boyunca başlayan hücrelerin daha az sayıda nedeniyle) ve kabul edilmez. - Görüntüleri ImageJ'de açın. ImageJ kullanarak her hücre ile sınır işareti(Şekil 2D)arasındaki mesafeyi hesaplayın.
- Geçişi hücre sayıları açısından değerlendirmek için ImageJ'de edinilen görüntüdeki sınırdan belirli bir mesafe belirleyin. Bu mesafede bulunan hücre sayısını sayın. Uygun yazılımı kullanarak ortalama sayıyı, standart sapmayı ve istatistiksel önemi hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
35 mm'lik bir çanak içinde tek kuyulu bir kültür kesici uç kurma adımları Şekil 1'degösterilmiştir. Uzun mesafeli göç analizi ve ortak kültür göç teşelesi, poli-L-ornitin/laminin kaplı 35 mm çanak merkezinde istenilen sayıda hücreyi tohumlamak için tek kuyulu bir kesici uç kullandı. 0. günde hücreler dikdörtgen yama olarak mevcuttu (Şekil 2A,C). Gün 0 görüntülerde, gün 0 satırı hücre tabakasının keskin kenarı (Şekil 2C'dekibeyaz noktalı çizgi) ile kolayca tanımlanabilir. 48 h ile hücreler hücre serbest uzaya göç etmişti(Şekil 2B,D). Gün sonrası 0 görüntülerde, kesici uç etrafında çizilen siyah kenarlık (yemeğin arka sında) açıkça siyah bir boşluk olarak görülebilir. Boşluğun kenarı gün 0 satırı (Şekil 2D'dekibeyaz noktalı çizgi) olarak atanır. Adım 9.2'de belirtildiği gibi, veri analizi için yalnızca hücre tabakasının sağ ve sol uzun kenarlarına (Şekil 2B'dekisarı alan) bitişik alana düşen hücreler dikkate alındı. Bir hücrenin kat ettiği mesafe, hücre (Şekil 2D'dekibeyaz ok) ile gün 0 çizgisi arasındaki uzaklık hesaplanarak ölçüldü. Anti-aktif Caspase 3 antikor ile immünositokimyasal boyama, apoptoz bir belirteç, tohumlu hücrelerde apoptotik sinyal gösterdi(Şekil 2E). Eş-kültür göç analizinde, internöronlar insan periventriküler endotel hücreleri ile birlikte tohumlandığında, nöronlar internöronların tek başına tohumlandığında veya kontrol endotel hücreleriyle birlikte tohumlandığında daha uzak mesafelere seyahat ettiler(Şekil 2F). Ayrıca, aynı mesafe aralığı için, internöronların daha yüksek sayıda diğer iki grup içinde internöronlar ile karşılaştırıldığında periventriküler endotel hücreleri ile birlikte tohumlu zaman göç etti. Bu gösteriyor ki, fare periventriküler endotel hücreleri gibi, insan periventriküler endotel hücreleri insan internöron göçteşvik.
Kemo-attraction analizinde, üç kuyulu kültür ekler kullanılarak, insan internöronlar 35 mm poli-L-ornitin/laminin kaplı kültür çanak küçük bir dikdörtgen yama olarak tohumlu edildi. Periventriküler endotel hücreleri ve kontrol non-periventriküler endotel hücreleri nöronal yamanın her iki tarafında yamalar olarak tohumlanmış ve her yama arasındaki boşluk 500 μm 'dir(Şekil 3A). Periventriküler endotel hücrelerine doğru göç eden internöron ların sayısı kontrol endotel hücrelerine karşı 36 saat sonra ölçüldü. İnternöronların önemli ölçüde daha yüksek sayıda periventriküler endotel hücreleri kontrol endotel hücreleri ile karşılaştırıldığında göç(Şekil 3B,C),GABAerjik internöronlar insan periventriküler endotel hücreleri tarafından salgılanan kemo-çekici ipuçları seçici yanıt doğrulayan.
Şekil 1: Kültür eklemesinin hazırlanması. (A) İki kuyulu bir kültür eklemesi. (B) 35 mm'lik bir kabın ortasına sabitlenmiş tek kuyulu bir kesici uç. (C) Kesici uç çıkardıktan sonra gözlenen dikdörtgen yamanın anahattı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Skemi ve temsili göç titreşme sonucu. (A) 0. (B) Hücre serbest uzaya göç eden hücrelerin şeması. Kırmızı noktalar göç eden hücreleri gösterir. Sarı bölge, veri toplama için görüntüalınan alanı işaretler. A ve B'deki noktalı kutu, C ve Dpanellerinde gösterilen alana karşılık gelir. (C,D) Göç testinin 0 (C) ve2. Beyaz noktalı çizgi 0. D'deki sarı çizgi, 48 h.(E) Nöronlar (0. gün) bir hücrenin kat ettiği mesafeyi gösterir ve apoptotik hücreleri işaretleyen anti-β-Tubulin antikorları (kırmızı) ve anti-aktif Caspase 3 antikorları (yeşil) ile birlikte etiketlenir. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyanmış. Tohumlu hücrelerde apoptotik hücreler tespit edilmedi. (F) Göç eden internöron sayısının kat edilen mesafeye göre çizildiği ortak kültür analizinin 5. Tek başına tohumlanan veya kontrol endotel hücreleri ile birlikte tohumlanmış internöronlara kıyasla, periventriküler endotel hücreleri ile birlikte tohumlanmış internöronlar daha yüksek sayılarda göç etmiş ve daha uzak mesafelere seyahat etmiştir. Veriler ortalama ± S.D'yi (n = 5; **p<0.01, ***p< 0.001, Öğrencinin t testi) temsil eder. Ölçek çubukları = 100 μm. IN = internöronlar; PV EC = periventriküler endotel hücreleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kemo-çekim teşp. (A) Kemoterapi-attraction teşrinin şeması. Üç kuyulu bir kültür ekleme sokulu kullanılarak, internöronlar (IN) ortada (yeşil noktalı dikdörtgen) tohumlanırken, periventriküler endotel hücreleri (PV ECs; turuncu noktalı dikdörtgen) ve kontrol endotel hücreleri (ECs; sarı noktalı dikdörtgen) her iki tarafta tohumlandı. (B) Β-Tubulin etiketli internöronların periventriküler endotel hücrelerine doğru sağlam göç gösteren ancak kontrol endotel hücrelerine doğru değil görüntüleri. (C) İnternöronların kemo-çekici yanıtının sayısallaştırılması. Periventriküler endotel hücrelerine doğru göç eden nöronların sayısı, kontrol endotel hücrelerine göre çok daha fazladır. Veriler ortalama ± S.D'yi (n = 5; *p < 0.05, Öğrencinin t testi) temsil eder. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| A | Avantaj -ları | Sınırlama |
| Boyden odası tasni1,17 | · Teknik olarak talep karanlığa ait olmayan · Yapışık ve yapışmaz hücreler için uygundur · Parakrin sinyalizasyon veya kemo-çekicilerin hücre göçü üzerindeki etkisini incelemek için değiştirilebilir |
· Uç nokta tonu. Gerçek zamanlı görüntüleme için uygun değil. · Doğrudan hücre-hücre etkileşiminin göç üzerindeki etkisinin incelenmesi için uygun değil |
| Scratch asası18 | · Uç nokta veya kinetik · Teknik olarak talep karanlığa ait olmayan |
· Birkaç yüz mikrometrelik göç uzunluğu tahlilleri. 1-2 cm aralığında uzun mesafeli göç çalışmaları için uygun değildir. · Süspansiyon hücreleri için uygun değil · Çizilme alanındaki varyasyonlar |
| Uzun mesafeli geçiş teşpleri | · Bitiş noktası veya kinetik · 1,5 ila 2 cm arasında uzun mesafeli göç çalışma sağlar · Teknik olarak talep karanlığa ait olmayan |
· Süspansiyon hücreleri için uygun değil |
| Ortak kültür göç analizi | · Bitiş noktası veya kinetik · Doğrudan hücre-hücre temasının göç üzerindeki etkisinin incelenmesine izin verir · 1,5 ila 2 cm'ye kadar geçiş uzunluğu sağlar · Teknik olarak talep karanlığa ait olmayan |
· Süspansiyon hücreleri için uygun değil |
| B | Avantaj -ları | Sınırlama |
| Boyden odası tasması | · Teknik olarak talep karanlığa ait olmayan · Yapışık ve yapışmaz hücreler için uygundur |
· Uç nokta tonu. Canlı görüntüleme için uygun değil. · Dik konsantrasyon gradyanı |
| Agül altı asay19 | · Teknik olarak talep karanlığa ait olmayan · İki veya daha fazla kemo-çekici sinyaltek bir kurulumda doğrulanabilir |
· Yapışık hücreler için uygun değildir. Çoğunlukla kan hücreleriyle sınırlıdır. · Agarose'daki hücrelerin zor görselleştirilmesi |
| Kılcal oda göç töz20,21 | · Uç nokta veya kinetik · Yapışık veya süspansiyon hücreleri için uygundur |
· Özel odalara ihtiyaç duyar |
| Mikroakışkan cihaz22 | · Kontrol edilebilir ve kararlı konsantrasyon degradesi üretir · Tek hücreli düzey çözünürlüğü sağlar |
· Gelişmiş aygıtlar ve araçlara ihtiyaç duyar · Teknik olarak zorlu ve dik öğrenme eğrisi · Karmaşık görüntüleme ve veri analizi |
| Kemo-attraction teşp | · Bitiş noktası veya kinetik · Kademeli konsantrasyon gradyanı · Gerçek zamanlı veya floresan görüntüleme için uygundur · Teknik olarak talep karanlığa ait olmayan |
· Süspansiyon hücreleri için uygun değil |
Tablo 1: Araştırma yöntemlerinin karşılaştırılması. (A) Ortak in vitro göç tahlillerinin uzun mesafeli göç tahlilleri ve ortak kültür tahlilleri ile karşılaştırılması. (B) Ortak kemotaksis tahlillerinin kemo-attraction tahlilleri ile karşılaştırılması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, birlikte insan periventriküler endotel hücreye özgü özelliklerinin nicel değerlendirmesini sağlayan üç in vitro tahlilleri tanımladık. Bu tahliller insan periventriküler endotel hücrelerinin insan internöronları ile etkileşimi içine mekanistik anlayışlar kazanıyor değerli olacaktır. Ligandlar, inhibitörler veya gen-spesifik nakavt veya aşırı ekspresyon ile hücreleri kullanarak deneyler tespit edecek veya endotel hücre güdümlü internöron göç veya periventriküler endotel hücrelerinin uzun mesafe göç özellikleri aracılık moleküler oyuncular doğrulamak. Bu tahliller de canlı hücre zaman atlamalı geçiş çalışmaları gerçekleştirmek için değiştirilebilir. Ayrıca, internöronlar dışındaki hücrelerle endotel hücrelerinin etkileşimine dair kanıtlar vardır. Grubumuzun ve diğerlerinden yapılan çalışmalar, periventriküler endotel hücrelerinin projeksiyon nöronların desenlemesi ve nöral öncül hücrelerin çoğalması üzerindeki etkisine atıfta bulunmaktadır5,14,15. Bu olası etkileşimleri test etmek, test etme ayarlarımızı kullanarak ilgimizi çekebilir. Son olarak, bu tahliller hastalıklı periventriküler endotel hücrelerinin değerlendirilmesi için bir platform olarak hizmet verecektir. Çalışmalarımız periventriküler vasküler ağ ve şizofreni, epilepsi, otizm ve majör depresyon 3 ,5gibi nöropsikiyatrik bozuklukların kökeni arasında yeni özerk bağlantılar kurmuştur. Bu tahliller uzun mesafe göç potansiyel kusurları belirlenmesinde paha biçilmez olacaktır, kemo-attraction, ya da bu nöropsikiyatrik bozukluk koşullarında hastalıklı-periventriküler endotel hücrelerinin jukstrarin sinyal.
Bu tahliller basit, tekrarlanabilir ve düşük maliyetlidir ve yapışık olmayan hücreler dışında çeşitli hücre türlerinde hücre göçünün ve eş kültür veya kemo-çekici ipuçlarının etkilerini ölçmek için değiştirilebilir. Doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için izlenmesi gereken bazı kritik adımlar vardır. İlk olarak, her bir tsay için tohumlama hücre numarasını optimize etmek çok önemlidir. Tek bir bölmede tohumlanacak hücre sayısı hücre tipine, istenilen birleşme düzeyine ve eş kültür oranı gibi tasmaya özgü faktörlere bağlı olmalıdır. İkinci olarak, her bir tdeneme için hücre kültürü ortamını optimize etmek gerekir. Birden fazla hücre tipinin tek bir tabakta tohumlandığı ortak kültür göç analizi ve kemo-attraction analizinde, tüm hücre tiplerine yardımcı olmalıdır. Pilot deneylerde, co-kültür ortamının her hücre tipinin canlılık (trippan mavi dışlama yöntemi kullanılarak) ve morfolojisi (immünositokimya kullanılarak) üzerindeki etkisini inceledik. Biz bir hafta boyunca co-kültür orta ile insan GABAerjik nöronlar kültürlü ve co-kültür orta nöronların canlılık ve morfolojisi nöronal ortamda kültürlü nöronlar ile karşılaştırıldığında önemli bir fark gözlendi. Benzer bir şekilde, periventriküler endotel hücreleri ve kontrol endotel hücreleri, iki pasaj lar için co-kültür orta kültürlü, hücre sağkalım ve morfolojisinde önemli bir varyasyon göstermedi. Üçüncü olarak, geçiş hızı farklı hücre tipleri arasında değiştiğinden, çalışılan hücre tipi(ler) için her bir tartışığın zaman dilimini belirlemek önemlidir. Dördüncü olarak, kültür ekler dikkatle işlemek için önemlidir. Kesici uçlar, parmak ucuyla hafifçe bastırılarak çanağa sıkıca sabitlenmelidir. Kesici uç hareket etmediğini doğrulamak için çanak ters çevrilmelidir. Hücre tabakasını rahatsız etmemek için kesici uç çıkarılırken de dikkatli olunmalıdır. Son olarak, deneysel değişkenliği azaltmak için numune boyutunun artırılması önerilir.
Sonuç olarak, bu tahliller önemli ölçüde insan periventriküler endotel hücre biyolojisi ve normal ve hastalıklı koşullarda beyin gelişimi üzerindeki rolü anlayışımızı genişletecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü (R01MH110438) ve Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü 'nün (R01NS100808) AV'ye verdiği ödüllerle desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase dissociation solution | Millipore Sigma | SCR005 | Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4) |
| Anti-human β-Tubulin antibody | Biolegend | 802001 | |
| Anti-human CD31 antibody | Millipore Sigma | CBL468 | |
| Anti- MAP2 antibody | Neuromics | CH22103 | |
| Anti-active Caspase 3 antibody | Millipore Sigma | AB3623 | |
| Control human endothelial cells | Cellular Dynamics | R1022 | |
| Control endothelial Cells Medium Supplement | Cellular Dynamics | M1019 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 03-337-7Y | |
| DMEMF/12 medium | Thermofisher Scientific | 11320033 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| E6 medium | Thermofisher Scientific | A1516401 | |
| FGF2 | Thermofisher Scientific | PHG0261 | |
| Fibronectin | Thermofisher Scientific | 33016-015 | |
| Freezing Container | Thermofisher Scientific | 5100 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Human GABAergic neurons | Cellular Dynamics | R1013 | |
| Human GABAergic neurons base medium | Cellular Dynamics | M1010 | |
| Human GABAergic neuron Neural supplement | Cellular Dynamics | M1032 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | Basement membrane matrix |
| Mounting Medium | Vector laboratories | H-1200 | |
| poly-L-ornithin | Sigma | p4957 | |
| PBS | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| Trypan blue | Thermofisher Scientific | 15250061 | |
| TrypLE | Thermofisher Scientific | 12563011 | Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4) |
| VEGF-A | Peprotech | 100-20 | |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | Lifeline Cell Technologies | LL-0003 | Component of control human endothelial cell medium |
| 2-well silicone culture-Insert | ibidi | 80209 | |
| 3-well silicone culture-Insert | ibidi | 80369 | |
| 35 mm dish | Corning | 430165 | |
| 15-ml conical tube | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| 4% PFA solution | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| Inverted phase contrast microscope | Zeiss | Zeiss Axiovert 40C | |
| Fluorescent microscope | Olympus | FSX-100 |
References
- Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).
- Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nature Neuroscience. 11 (4), 429-439 (2008).
- Won, C., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nature Communications. 4, 2149 (2013).
- Li, S., Haigh, K., Haigh, J. J., Vasudevan, A. Endothelial VEGF sculpts cortical cytoarchitecture. The Journal of Neuroscience. 33 (37), 14809-14815 (2013).
- Li, S., et al. Endothelial cell-derived GABA signaling modulates neuronal migration and postnatal behavior. Cell Research. 28 (2), 221-248 (2018).
- Lewis, D. A., Levitt, P. Schizophrenia as a disorder of neurodevelopment. Annual Review of Neuroscience. 25, 409-432 (2002).
- Lewis, D. A., Hashimoto, T., Volk, D. W. Cortical inhibitory neurons and schizophrenia. Nature Reviews Neuroscience. 6 (4), 312-324 (2005).
- Marin, O.
- Levitt, P., Eagleson, K. L., Powell, E. M. Regulation of neocortical interneuron development and the implications for neurodevelopmental disorders. Trends in Neurosciences. 27 (7), 400-406 (2004).
- Treiman, D. M.
- Datta, D., Subburaju, S., Kaye, S., Vasudevan, A. Human forebrain endothelial cells for cell-based therapy of neuropsychiatric disorders. Proceedings of 22nd Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience. , Nara, Japan. (2018).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient? Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
- Ardhanareeswaran, K., Mariani, J., Coppola, G., Abyzov, A., Vaccarino, F. M. Human induced pluripotent stem cells for modelling neurodevelopmental disorders. Nature Reviews Neurology. 13 (5), 265-278 (2017).
- Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cerebral Cortex. 19 (1), 32-41 (2009).
- Vissapragada, R., et al. Bidirectional crosstalk between periventricular endothelial cells and neural progenitor cells promotes the formation of a neurovascular unit. Brain Research. 1565, 8-17 (2014).
- JoVE Science Education Database. Cell Biology. The Transwell Migration Assay. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
- Renaud, J., Martinovic, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. 113, e54356 (2016).
- Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. The Journal of Immunology. 115 (6), 1650-1656 (1975).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. Journal of Cell Biology. 75 (2), 606-616 (1977).
- Zicha, D., Dunn, G., Jones, G. Analyzing chemotaxis using the Dunn direct-viewing chamber. Methods in Molecular Biology. 75, 449-457 (1997).
- Kim, B. J., Wu, M. Microfluidics for mammalian cell chemotaxis. Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1316-1327 (2012).
