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Neuroscience

मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं और गैबाएर्गिक न्यूरॉन्स के लिए प्रवासन, कीमो-आकर्षण और सह-संस्कृति परख

Published: January 23, 2020 doi: 10.3791/60295
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 2Angiogenesis and Brain Development Laboratory, Division of Basic Neuroscience, McLean Hospital

Summary

हम तीन सरल इन विट्रो परख प्रस्तुत-लंबी दूरी के प्रवास परख, सह संस्कृति प्रवास परख, और कीमो आकर्षण परख-कि सामूहिक रूप से मानव स्टेम सेल के कार्यों का मूल्यांकन पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं और उनके गैबाएर्गिक इंटरन्यूरॉन्स के साथ बातचीत।

Abstract

तंत्रिका तंत्र के विकास और मस्तिष्क विकारों के एटिजियोलॉजी में मस्तिष्क वास्कुलचर की भूमिका तेजी से ध्यान आकर्षित कर रही है। हमारे हाल के अध्ययनों ने संवहनी कोशिकाओं की एक विशेष आबादी की पहचान की है, पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं, जो भ्रूणीय विकास के दौरान अग्रमस्तिष्क गैबाएर्गिक इंटरन्यूरॉन्स के प्रवास और वितरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। यह, उनके सेल-स्वायत्त कार्यों के साथ मिलकर, सिजोफ्रेनिया, मिर्गी और आत्मकेंद्रित जैसे न्यूरोसाइकियाट्रिक विकारों की विकृति में पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं की उपन्यास भूमिकाओं के लिए संकेत देता है। यहां, हमने तीन अलग-अलग इन विट्रो परखों का वर्णन किया है जो सामूहिक रूप से पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं के कार्यों और गैबाएर्गिक इंटरन्यूरॉन्स के साथ उनकी बातचीत का मूल्यांकन करते हैं। विशेष रूप से मानव संदर्भ में इन परखों का उपयोग, हमें पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं और मस्तिष्क विकारों के बीच की कड़ी की पहचान करने की अनुमति देगा। ये परख सरल, कम लागत और प्रजनन योग्य हैं, और आसानी से किसी भी अनुयायी सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Introduction

एंडोथेलियल कोशिकाएं रक्त वाहिकाओं की परत बनाती हैं और महत्वपूर्ण कार्यों में मध्यस्थता करती हैं जिनमें पोत की दीवार परगम्यता का रखरखाव, रक्त प्रवाह का विनियमन, प्लेटलेट एकत्रीकरण और नई रक्त वाहिकाओं का गठन शामिल है। मस्तिष्क में, एंडोथेलियल कोशिकाएं एक महत्वपूर्ण रक्त-मस्तिष्क-बाधा का हिस्सा बनती हैं जो मस्तिष्क और रक्त प्रवाह1के बीच सामग्रियों के आदान-प्रदान को कसकर नियंत्रित करती है। पिछले एक दशक में हमारे अध्ययनों ने मस्तिष्क एंडोथेलियल कोशिकाओं की उपन्यास न्यूरोजेनिक भूमिकाओं की पहचान की है जिनका मस्तिष्क विकास और व्यवहार2,3,4,5के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं । हमने दिखाया है कि माउस भ्रूणीय अग्रमस्तिष्क दो अलग-अलग उपप्रकार के जहाजों, पियाल जहाजों और पेरिवेंट्रिकुलर जहाजों द्वारा संवहनी है, जो शरीर रचना विज्ञान, मूल और विकासात्मक प्रोफ़ाइल2में भिन्न होते हैं। एंडोथेलियल कोशिकाएं इन दो पोत उपप्रकारों को अस्तर करती हैं, जो उनके जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल में अलग अंतर दिखाती हैं। जबकि पियाल एंडोथेलियल कोशिकाएं ज्यादातर सूजन और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से संबंधित जीन व्यक्त करती हैं, पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं आमतौर पर न्यूरोजेनेसिस, न्यूरोनल माइग्रेशन, कीमोटैक्सिस और एक्सॉन गाइडेंस3से जुड़े जीन की अभिव्यक्ति में विशिष्ट रूप से समृद्ध होती हैं। पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं में एक उपन्यास गाबा सिग्नलिंग पाथवे भी है जो पारंपरिक न्यूरोनल गाबा सिग्नलिंग पाथवे5से अलग है । इसकी जीन अभिव्यक्ति के साथ सहवर्ती, पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को विकासशील नियोकॉर्टेक्स में गैबाएर्गिक इंटरन्यूरॉन्स के प्रवास और वितरण को विनियमित करने के लिए पाया गया था। भ्रूणीय विकास के दौरान, पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को पेरिवेंट्रिकुलर वैस्कुलर नेटवर्क2,3स्थापित करने के लिए एक वेंट्रल-पृष्ठीय ढाल के साथ लंबी दूरी के प्रवास से गुजरना पड़ता है। यह प्रवासी मार्ग एक दिन बाद इंटरन्यूरॉन्स द्वारा प्रतिबिंबित होता है। माइग्रेट इंटरन्यूरॉन्स शारीरिक रूप से पूर्व-गठित पेरिवेंट्रिकुलर वैस्कुलर नेटवर्क के साथ बातचीत करते हैं और नियोकॉर्टेक्स में अपने अंतिम गंतव्य तक पहुंचने के लिए इसे गाइडरेल के रूप में उपयोग करते हैं। एक भौतिक सब्सट्रेट के रूप में कार्य करने के अलावा, पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं न्यूरॉन्स को माइग्रेट करने के लिए नौवहन संकेतों के स्रोत के रूप में काम करती हैं। पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल सेल-स्रावित गाबा इंटरन्यूरॉन माइग्रेशन का मार्गदर्शन करता है और उनके अंतिम वितरण पैटर्न4को नियंत्रित करता है। इंटरन्यूरॉन माइग्रेशन और वितरण में दोष ऑटिज्म, मिर्गी, सिजोफ्रेनिया और अवसाद6,7,8,9,10जैसे न्यूरोसाइकियाट्रिक विकारों से जुड़े होते हैं। इसलिए, पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल सेल कार्यों का अध्ययन और मानव संदर्भ में इंटरन्यूरॉन माइग्रेशन पर उनका प्रभाव इन विकारों के रोगजनन को संबोधित करने के लिए महत्वपूर्ण हो जाता है।

हमने अपनी प्रयोगशाला11में मानव भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं से मानव पेरिवेंट्रिकुलर जैसी एंडोथेलियल कोशिकाओं को उत्पन्न किया है, जो प्रेरित प्लुरीपोटेवल स्टेम सेल (आईपीएससी) प्रौद्योगिकी12,13का उपयोग कररहे हैं। यह मान्य करने के लिए कि क्या मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं ईमानदारी से माउस पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं की नकल करती हैं, और मात्रात्मक रूप से इंटरन्यूरॉन माइग्रेशन पर उनके प्रभाव का आकलन करने के लिए, हमने तीन इन विट्रो परख विकसित की: एक लंबी दूरी की प्रवास परख, एक सह-संस्कृति प्रवास परख, और एक कीमो-आकर्षण परख। यहां हम इन परखों के लिए प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन करते हैं । सभी तीन परख सिलिकॉन संस्कृति आवेषण के उपयोग पर आधारित करने के लिए कोशिकाओं का एक छोटा आयताकार पैच बनाने के लिए (निश्चित आयामों की) सेल मुक्त अंतरिक्ष से घिरा हुआ है । 0 दिन में उल्लिखित आयताकार पैच की सीमा से कोशिकाओं की अंतिम स्थितियों के बीच की दूरी को मापने के द्वारा माइग्रेशन दूरी का मूल्यांकन किया जाता है। लंबी दूरी की प्रवास परख में, मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को 35 मिमी पकवान के केंद्र में एक पैच के रूप में वरीयता दी जाती है, और लंबे समय तक कोशिकाओं द्वारा कूच की गई दूरियों की गणना की जाती है। सह-संस्कृति प्रवास परख में, मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को 35 मिमी पकवान में एक पैच के रूप में मानव इंटरन्यूरॉन्स के साथ सह-वरीयता प्राप्त किया जाता है। यह सेटअप इंटरन्यूरॉन्स के माइग्रेशन की दर पर इन दो सेल प्रकारों के प्रत्यक्ष शारीरिक बातचीत के प्रभाव की परीक्षा की अनुमति देता है। कीमो-आकर्षण परख मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं द्वारा स्रावित कीमो-आकर्षक संकेतों के जवाब में इंटरन्यूरॉन्स के प्रवास को मापता है। इंटरन्यूरॉन्स को आयताकार पैच के रूप में वरीयता दी जाती है, जिसमें मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं होती हैं और दोनों तरफ समान आकार के पैच के रूप में वरीयता प्राप्त गैर-पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को नियंत्रित करती हैं। प्रत्येक कोशिका पैच को 500 माइक्रोन के सेल-मुक्त अंतर से अलग किया जाता है। अंतरन्यूरॉन्स की प्रतिक्रिया का मूल्यांकन उन कोशिकाओं की संख्या को निर्धारित करके किया जाता है जो गैर-पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को नियंत्रित करने की तुलना में पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं की ओर चले गए हैं।

ये परख मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल सेल कार्यों और इंटरन्यूरॉन माइग्रेशन पर उनके प्रभाव का मजबूत आकलन प्रदान करते हैं। लंबी दूरी की परख और सह-संस्कृति प्रवास परख का उपन्यास सेटअप लंबी दूरी के प्रवास का पता लगाने की अनुमति देने के लिए सेंटीमीटर (~ 1-1.5 सेमी) की सीमा में सेल-मुक्त स्थान प्रदान करता है। अन्य लोकप्रिय परखों की तुलना में हमारे परखों की विशेषताओं का सारांश तालिका 1में प्रस्तुत किया गया है । सामूहिक रूप से, यहां वर्णित परखों से सिजोफ्रेनिया, ऑटिज्म या मिर्गी जैसे मस्तिष्क विकारों के आईपीएससी से उत्पन्न "रोगग्रस्त" पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं और इंटरन्यूरॉन्स का आकलन करने के लिए एक मंच के रूप में काम करेगा । इन परखों का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए भी किया जा सकता है कि विभिन्न स्थितियां (जैसे अवरोधक, लिगांड, आरएनएआई) सेल माइग्रेशन को कैसे प्रभावित करती हैं। अंत में, इन परखों को लंबी दूरी के प्रवास, कीमो-आकर्षण या सेल-सेल मध्यस्थता प्रवास को मापने के लिए अन्य सेल प्रकारों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

1. मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं की संस्कृति और भंडारण

  1. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित (सामग्री की तालिका देखें) पर मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को बनाए रखें (सामग्री की तालिकादेखें) पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल सेल मीडियम में 6-अच्छी प्लेटें (E6 मीडियम जिसमें 50 एनजी/एमएल VEGF-A, 100 एनजी/mL FGF2 और 5 μM गाबा) 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर हर वैकल्पिक दिन माध्यम बदलें।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस में बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स गल, और इसे ठंडे DMEM/F12 माध्यम में पतला करके एक 1:100 समाधान बनाते हैं । मैट्रिक्स समाधान के 1 mL के साथ एक 6-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं को कोट करें। उपयोग से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट प्लेटें।
  3. मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को 80%-90% की संवर्तन तक पहुंचने की अनुमति दें। कुएं से एस्पिरेट माध्यम। कुएं को एक बार 1 mL के साथ अच्छी तरह से बाँझ 1x पीबीएस के साथ धोलें।
  4. कोशिकाओं को प्रति अच्छी तरह से सेल विसोजन समाधान (सामग्री की तालिकादेखें) के 1 mL जोड़कर अलग करें। 5 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। 5 मिन के बाद, पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल सेल मीडियम का 1 mL जोड़ें। सेल समाधान को 15 mL शंकुट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: हम यहां सेल विसोशन के लिए Accutase का उपयोग करते हैं, जैसा कि धारा 3 और 4 में ट्रिपल के विपरीत है।
  5. कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए 500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज कोशिकाएं, सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें और पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल सेल मीडियम के 1 mL में सेल पैलेट को फिर से सस्पेंड करें।
  6. ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन विधि का उपयोग करके लाइव कोशिकाओं की गणना करें। 1.2 x 105 कोशिकाओं/सेमी2के घनत्व पर ताजा मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों में बीज कोशिकाएं । 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेट ।
  7. ठंड माध्यम (90% पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल सेल मीडियम और 10% डीएमएसओ) में क्रायोप्रिजर्वेपिंग द्वारा मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को स्टोर करें।
    1. ऊपर चरण 1.3 और 1.4 के बाद कोशिकाओं को अलग और इकट्ठा करें। ट्रायपैन ब्लू अपवर्जन विधि द्वारा समाधान में कोशिकाओं की गणना करें।
    2. कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए 500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र कोशिकाएं। सुपरनटेंट को एस्पिरेट करें और सेल पेलेट को 5 x 106 कोशिकाओं/ठंड माध्यम की एल पर फिर से निलंबित करें।
    3. क्रायोवियल प्रति फ्रीजिंग मीडियम प्लस कोशिकाओं का 1 mL बांटें। शीशियों को आइसोप्रोपेनॉल से भरे कक्ष में रखें और रात भर 1 डिग्री सेल्सियस/मिन में ठंडा करें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए अगले दिन एक तरल नाइट्रोजन टैंक में शीशियों को स्थानांतरित करें।

2. परख के लिए मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं की तैयारी

  1. मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को 70%-80% कन्फ्लंटेंसी तक पहुंचने की अनुमति दें।
  2. ऊपर वर्णित चरण1.3 से 1.5 के बाद कोशिकाओं को अलग करें। ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन विधि का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।

3. परख के लिए मानव गैबाएर्गिक इंटरन्यूरॉन्स की तैयारी

नोट: मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी)- व्युत्पन्न GABAergic इंटरन्यूरॉन्स और न्यूरोनल माध्यम व्यावसायिक रूप से खरीदा गया था (सामग्री की तालिकादेखें) । न्यूरॉन्स निर्माता द्वारा विकसित प्रोटोकॉल के बाद एक मानव फाइब्रोब्लास्ट-व्युत्पन्न iPSC लाइन में अंतर करके उत्पन्न होते हैं। कोशिकाओं को पिघला दिया गया था और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार सुसंस्कृत ।

  1. गल मानव GABAergic इंटरन्यूरॉन्स और संस्कृति उन्हें 12 में अच्छी तरह से थाली में दो सप्ताह के लिए 70%-80% की एक प्रवाह के लिए ।
  2. परख के दिन, गर्म सेल विघटन समाधान (सामग्री की तालिकादेखें) और उपयोग से पहले 10 मीटर के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर न्यूरोनल माध्यम का एक बहाना।
  3. कोशिकाओं वाले प्रत्येक कुएं से एस्पिरेट माध्यम। प्रति अच्छी तरह से बाँझ 1x पीबीएस के 1 mL के साथ कोशिकाओं को धोएं।
  4. कोशिकाओं को प्रति अच्छी तरह से प्रति गर्म विच्छेदन समाधान के 0.5 मिलील जोड़कर और 5 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट जोड़कर अलग करें। 1 मिलीएल प्रति अच्छी तरह से न्यूरोनल मीडियम डालें। सेल समाधान को 15 mL शंकुट्यूब में स्थानांतरित करें। धीरे-धीरे कोशिका झुरमुट को अलग करने की कोशिश करें।
  5. कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए 380 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र कोशिकाएं, सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें और न्यूरोनल माध्यम के 1 mL में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें। ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन विधि का उपयोग करके लाइव कोशिकाओं की गणना करें।

4. परख के लिए नियंत्रण मानव एंडोथेलियल कोशिकाओं की तैयारी

नोट: नियंत्रण मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं और एंडोथेलियल सेल माध्यम व्यावसायिक रूप से खरीदा गया था(सामग्री की तालिका)। ये एंडोथेलियल कोशिकाएं निर्माता द्वारा विकसित प्रोटोकॉल के बाद एंडोथेलियल भाग्य के लिए मानव फाइब्रोब्लास्ट-व्युत्पन्न आईपीएससी लाइन में अंतर करके उत्पन्न होती हैं। कोशिकाओं को पिघला दिया गया था और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार Fibronectin सब्सट्रेट पर सुसंस्कृत । निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद फिब्रोनेक्टिन-कोटेड प्लेटें तैयार की गई थीं।

  1. गल मानव एंडोथेलियल कोशिकाओं को नियंत्रित करता है और उन्हें 6-अच्छी प्लेट में 80%-90% की एक प्रवाह के लिए संस्कृति।
  2. परख के दिन, गर्म सेल विघटन समाधान (सामग्री की तालिकादेखें) और उपयोग से पहले 10 मीटर के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एंडोथेलियल माध्यम का एक बहाना।
  3. कोशिकाओं वाले प्रत्येक कुएं से माध्यम को एस्पिरेट करें। प्रति अच्छी तरह से बाँझ 1x पीबीएस के 1 mL के साथ कोशिकाओं को धोएं।
  4. प्रति अच्छी तरह से पूर्व गर्म विच्छेदन समाधान के 0.5 मिलील जोड़कर कोशिकाओं को अलग करें। 5 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। विघटन समाधान को बेअसर करने के लिए प्रति अच्छी तरह से एंडोथेलियल सेल मीडियम का 1 mL जोड़ें। सेल समाधान को 15 mL शंकुट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज कोशिकाएं। एस्पिरेट सुपरनेटेंट और एंडोथेलियल सेल मीडियम के 1 mL में सेल पैलेट को फिर से सस्पेंड करें। ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन विधि का उपयोग करके लाइव कोशिकाओं की गणना करें।

5. एक अच्छी तरह से संस्कृति आवेषण की तैयारी

  1. कमरे के तापमान पर 1 मिलीग्राम/mL टुकड़े टुकड़े समाधान या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  2. 0.01% पॉली-एल-ऑर्निथिन समाधान (प्रति डिश 1 एमएल) के साथ 35 मिमी व्यंजनों की उचित संख्या कोट करें। कमरे के तापमान में व्यंजन कम से कम 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. उपयोग से तुरंत पहले 3.3 μg/mL की अंतिम एकाग्रता के लिए बाँझ पानी में 1 मिलीग्राम/mL टुकड़े टुकड़े समाधान 1:300 पतला करें।
  4. प्रत्येक डिश से पूरी तरह से एस्पिरेट पॉली-एल-ऑर्निथिन। पॉली-एल-ऑर्निथिन-प्रेरित सेल विषाक्तता से बचने के लिए प्रत्येक डिश को बाँझ पानी और एस्पिरेट के साथ पूरी तरह से 3x कुल्ला करें।
  5. प्रत्येक डिश के लिए 3.3 माइक्रोन/एमएल लेमिनिन समाधान का 1 किलोग्राम जोड़ें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस या कम से कम 1 घंटे में इनक्यूबेट करें। उपयोग से तुरंत पहले पकवान से लेमिनिन समाधान निकालें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, 4 डिग्री सेल्सियस में लेमिनिन युक्त व्यंजन स्टोर करें। उपयोग से पहले 37 डिग्री सेल्सियस सेल कल्चर इनक्यूबेटर में व्यंजनों को समतुल्य करें।
  6. एक अच्छी तरह से सिलिकॉन संस्कृति डालने के एक कुएं के तीन पक्षों में कटौती(चित्रा 1ए)एक बाँझ ब्लेड का उपयोग करने के लिए एक अच्छी तरह से डालने(चित्रा 1बी)उत्पन्न करते हैं ।
    नोट: एक चिकनी कटौती सुनिश्चित करने और डालने की चिपकने की रक्षा के लिए काटते समय मूल पैकेजिंग की सतह से दो-अच्छी तरह से सम्मिलित करें।
  7. व्यंजनों से एस्पिरेट लैमिनिन समाधान।
    नोट: लेमिनिन ऊष्मायन के बाद बाँझ पीबीएस या पानी के साथ व्यंजन न धोएं। गीली सतहों संस्कृति डालने के तंग आसंजन को रोकने जाएगा।
  8. बाँझ चिमटी के साथ एक अच्छी तरह से डालने निकालें और यह पाली-एल-ornithine/laminin लेपित पकवान के केंद्र में जगह है । इसे पकवान की सतह पर ठीक करने के लिए डालने के किनारों के साथ दबाएं।
  9. ध्यान से पकवान उल्टा बारी को सत्यापित करें कि डालने का दृढ़ता से पालन किया जाता है।
  10. पकवान को उल्टा रखें और अल्ट्रा-फाइन टिप(चित्रा 1सी)के साथ स्थायी काले मार्कर का उपयोग करके डालने वाले डिब्बे की सीमा को चिह्नित करें।

6. लंबी दूरी के प्रवास परख

  1. न्यूरोनल मीडियम की 3 x 104 कोशिकाओं/70 माइक्रोन की एकाग्रता पर मानव गैबाएर्गिक इंटरन्यूरॉन्स को निलंबित करें। बीज प्रत्येक एक अच्छी तरह से संस्कृति डालने के अंदर सेल समाधान के 70 μL ।
    नोट: इंटरन्यूरॉन्स का सीडिंग घनत्व निर्माता की सिफारिश के अनुसार है।
  2. मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को 3 x 104 कोशिकाओं/70 माइक्रोन ऑफ पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल सेल मीडियम की एकाग्रता पर निलंबित करें। बीज प्रत्येक एक अच्छी तरह से संस्कृति डालने के अंदर सेल समाधान के 70 μL ।
    नोट: मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं की संख्या वरीयता प्राप्त न्यूरॉन्स की संख्या के साथ एक 1:1 अनुपात में वरीयता प्राप्त।
  3. डालने के आसपास के क्षेत्र को भरने और कोटिंग को सूखने से रोकने के लिए न्यूरॉन डिश में न्यूरोनल मीडियम का 1 mL जोड़ें। इसी तरह पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल सेल मीडियम का 1 एलईएल पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल सेल डिश में डालें।
    नोट: डिश के किनारे धीरे-धीरे मध्यम जोड़ें ताकि डालने में परेशानी न हो।
  4. एक माइक्रोस्कोप के नीचे जांच करने के लिए सत्यापित करें कि कोशिकाओं को डालने के डिब्बे से लीक नहीं कर रहे हैं ।
  5. 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेट कोशिकाएं । 24 घंटे ऊष्मायन के बाद, माइक्रोस्कोप के तहत जांच करने के लिए सत्यापित करें कि कोशिकाओं को ठीक से संलग्न किया है और वहां कोई रात भर रिसाव है ।
  6. सीडिंग के 48 एच के बाद, धीरे-धीरे बाँझ चिमटी का उपयोग करके डालने को हटा दें। यह सत्यापित करने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे जांच करें कि सेल परत अव्यवस्थित (0 दिन) बनी हुई है।
  7. न्यूरॉन डिश से मध्यम निकालें और ताजा न्यूरोनल माध्यम के 1 mL जोड़ें। इसी तरह, पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल सेल डिश से मध्यम को हटा दें और ताजा पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल सेल मीडियम का 1 मिलील जोड़ें।
    नोट: व्यंजनों की एक आवश्यक संख्या को अलग करें और 0 दिन की छवियों के लिए 4% पीएफए के साथ ठीक करें।
  8. 5 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेट कोशिकाएं । 5 दिनों के बाद, मध्यम निकालें, 10 00 के लिए 4% पीएफए के साथ कोशिकाओं को ठीक करें, और 1x पीबीएस के साथ 3x धोएं।
  9. एंटी-ह्यूमन एंटी-ट्यूबलिन या एंटी-ह्यूमन मैप 2 एंटीबॉडी के साथ दाग न्यूरॉन्स, और एंटी-ह्यूमन सीडी 31 एंटीबॉडी के साथ एंडोथेलियल कोशिकाएं। इम्यूनोस्टेनिंग के अंत में, प्रत्येक डिश में एंटीफीका बढ़ते माध्यम का 1 mL जोड़ें।

7. सह संस्कृति प्रवास परख

  1. सह निलंबित 3 x 104 GABAergic इंटरन्यूरॉन्स और 3 x 104 सह संस्कृति माध्यम के 70 μL में मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (गाबा और 50% न्यूरोनल माध्यम के बिना 50% पेरिवेंट्रिकुलर रखरखाव माध्यम) । एक अच्छी तरह से डालने के डिब्बे के अंदर इस सेल समाधान बीज। ऐसे परख व्यंजनों की एक उचित संख्या तैयार करें।
    नोट: सह संस्कृति माध्यम में गाबा नहीं जोड़ा गया था प्रवास पर बहिर्जात गाबा के प्रभाव को बाहर करने के लिए ।
  2. एक माइक्रोस्कोप के नीचे जांच करने के लिए सत्यापित करें कि कोशिकाओं को डालने के डिब्बे से लीक नहीं कर रहे हैं ।
  3. धीरे-धीरे कोटिंग को सूखने से रोकने के लिए डिश के किनारे सह-संस्कृति माध्यम का 1 मिलील जोड़ें।
    नोट: डिश के किनारे धीरे-धीरे मध्यम जोड़ें ताकि डालने में परेशानी न हो।
  4. पहले नियंत्रण के रूप में, बीज 3 x 104 मानव गैबार्गिक इंटरन्यूरॉन्स केवल सह-संस्कृति माध्यम के 70 माइक्रोन में प्रति एक-अच्छी तरह से सम्मिलित करते हैं। ऐसे व्यंजनों की एक उचित संख्या तैयार करें।
  5. दूसरे नियंत्रण के रूप में, सह-बीज 3 x 104 गैबार्गिक मानव इंटरन्यूरॉन्स 3 x 104 नियंत्रण मानव एंडोथेलियल कोशिकाओं में सह-संस्कृति माध्यम के 70 माइक्रोन प्रति एक-अच्छी तरह से सम्मिलित करते हैं। एक उचित संख्या में व्यंजन तैयार करें।
  6. 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर व्यंजन इनक्यूबेट करें । 24 घंटे ऊष्मायन के बाद, यह सत्यापित करने के लिए एक माइक्रोस्कोप के नीचे जांच करें कि कोशिकाओं ने ठीक से संलग्न किया है और कोई रिसाव नहीं है।
  7. सीडिंग के 48 एच के बाद, धीरे-धीरे बाँझ चिमटी का उपयोग करके डालने को हटा दें। माइक्रोस्कोप के नीचे जांच करें सत्यापित करने के लिए कि सेल परत परेशान नहीं है (0 दिन) ।
  8. मध्यम निकालें और ताजा सह संस्कृति माध्यम के 1 mL जोड़ें ।
    नोट: 0 दिन की छवियों को प्राप्त करने के लिए व्यंजनों की एक उचित संख्या अलग सेट करें।
  9. 5 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेट कोशिकाएं ।
  10. 5 दिनों के बाद, मध्यम निकालें, 10 00 के लिए 4% पीएफए के साथ कोशिकाओं को ठीक करें, और 1x पीबीएस के साथ 3x धोएं।
  11. न्यूरॉन्स लेबल करने के लिए एंटी-ह्यूमन ए-ट्यूबलिन या एंटी-ह्यूमन मैप 2 एंटीबॉडी के साथ दाग। इम्यूनोस्टेनिंग के अंत में, प्रत्येक डिश में एंटीफीका बढ़ते माध्यम का 1 mL जोड़ें।

8. कीमो-आकर्षण परख

  1. बाँझ चिमटी का उपयोग कर के एक पाली-एल-ऑर्निथिन/लेमिनिन लेपित 35 मिमी पकवान के केंद्र में एक तीन अच्छी तरह से संस्कृति डालने रखें।
  2. पकवान को उल्टा घुमाें। अल्ट्रा-फाइन टिप के साथ एक स्थायी काले मार्कर का उपयोग करके डालने के बीच के डिब्बे के चारों ओर सीमा को चिह्नित करें।
  3. बीज 3 x 104 न्यूरोनल मीडियम के 70 माइक्रोन में बीच के डिब्बे में ह्यूमन गैबर्गिक इंटरन्यूरॉन्स(चित्रा 3ए)।
  4. बीज 104 मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल सेल मीडियम के 70 माइक्रोन में और 104 नियंत्रण एंडोथेलियल कोशिकाएं क्रमशः दो बाहरी डिब्बों में नियंत्रण एंडोथेलियल सेल मीडियम के 70 माइक्रोन में(चित्रा 3ए)।
  5. डिश के किनारे सह-संस्कृति माध्यम (गाबा के बिना 50% पेरिवेंट्रिकुलर मेंटेनेंस मीडियम और 50% न्यूरोनल मीडियम) के 1 मिलील जोड़ें ताकि डिश को सुखाने से रोका जा सके।
  6. माइक्रोस्कोप के तहत जांच करने के लिए सत्यापित करें कि कोशिकाओं को डालने के डिब्बे से लीक नहीं कर रहे हैं ।
  7. 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेट कोशिकाएं । 24 घंटे ऊष्मायन के बाद, यह सत्यापित करने के लिए एक माइक्रोस्कोप के नीचे जांच करें कि कोशिकाओं ने ठीक से संलग्न किया है और कोई रिसाव नहीं है।
  8. सीडिंग के 48 एच के बाद, धीरे-धीरे बाँझ चिमटी का उपयोग करके डालने को हटा दें। माइक्रोस्कोप के नीचे जांच करें सत्यापित करने के लिए कि सेल परत परेशान नहीं है (0 दिन) ।
  9. मध्यम निकालें और ताजा सह संस्कृति माध्यम के 1 mL जोड़ें ।
    नोट: 0 दिन की छवियों के लिए आवश्यक संख्या में व्यंजन अलग सेट करें।
  10. 36 घंटे के लिए इनक्यूबेट कोशिकाएं 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर । 36 घंटे के बाद, एस्पिरेट मीडियम, 10 मिन के लिए 4% पीएफए के साथ कोशिकाओं को ठीक करें, और 1x पीबीएस के साथ 3x धोएं।
  11. मानव गैबर्जिक इंटरन्यूरॉन्स को एंटी-ह्यूमन ए-ट्यूबलिन या एंटी-ह्यूमन मैप 2 एंटीबॉडी के साथ दाग दें। धुंधला प्रक्रिया के अंत में, प्रत्येक डिश में एंटीफीका बढ़ते माध्यम के 1 mL जोड़ें।

9. इमेजिंग और डेटा विश्लेषण

  1. इम्यूनो-दाग परख पकवान 4X आवर्धन पर एक माइक्रोस्कोप के नीचे रखें।
  2. देखने के क्षेत्र में आयताकार सीमा (ऊपर चरण 5.10 में बनाया गया) का एक लंबा किनारा रखें। उस सीमा से सटे सेल-फ्री स्पेस में कोशिकाओं की छवियां लें। आयताकार सीमा(चित्र ा 2बी)के दाएं लंबे किनारे और बाएं लंबे किनारे के साथ छवियां प्राप्त करें।
    नोट: आयत के संबंध में तिरछे तैनात कोशिकाओं को प्रारंभिक निशान के रूप में छोटी या लंबी बढ़त का चयन करने में अस्पष्टता के कारण विचार नहीं किया जाता है । इसके अलावा, कम बढ़त में पलायन कोशिकाओं की संख्या अक्सर काफी कम कर रहे है (संभवतः कम बढ़त के साथ शुरू कोशिकाओं की कम संख्या के कारण) और विचार नहीं कर रहे हैं ।
  3. इमेजजे में छवियों को खोलें। इमेजजे का उपयोग करके प्रत्येक सेल और सीमा चिह्न(चित्रा 2डी)के बीच की दूरी की गणना करें।
  4. सेल नंबरों के संदर्भ में माइग्रेशन का आकलन करने के लिए, इमेजजे में अधिग्रहीत छवि में सीमा से एक विशिष्ट दूरी निर्धारित करें। इस दूरी के भीतर मौजूद कोशिकाओं की संख्या गिनें। उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करके औसत संख्या, मानक विचलन और सांख्यिकीय महत्व की गणना करें।

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Representative Results

35 मिमी डिश के अंदर एक अच्छी तरह से संस्कृति डालने की स्थापना के कदम चित्रा 1में दिखाए गए हैं। लंबी दूरी की प्रवास परख और सह संस्कृति प्रवास परख एक पाली के केंद्र में कोशिकाओं की वांछित संख्या बीज के लिए एक अच्छी तरह से डालने का इस्तेमाल किया-L-ornithine/laminin लेपित ३५ मिमी पकवान । 0 दिन, कोशिकाओं को एक आयताकार पैच(चित्रा 2ए, सी)के रूप में मौजूद थे । दिन 0 छवियों में, दिन 0 लाइन आसानी से सेल परत के तेज किनारे (चित्रा 2सीमें सफेद बिंदीदार लाइन) से पहचाना जा सकता है । 48 घंटे तक, कोशिकाएं सेल-मुक्त स्थान(चित्रा 2बी, डी)में बाहर चले गए थे। दिन के बाद 0 छवियों में, डालने के आसपास खींची गई काली सीमा (पकवान के पीछे) स्पष्ट रूप से काले अंतर के रूप में मनाई जा सकती है। अंतर के किनारे दिन 0 लाइन (चित्रा 2डीमें सफेद बिंदीदार लाइन) के रूप में सौंपा गया था । जैसा कि चरण 9.2 में उल्लेख किया गया है, केवल वे कोशिकाएं जो कोशिका परत (चित्रा 2बीमें पीला क्षेत्र) के दाहिने और बाएं लंबे किनारों के निकट क्षेत्र में गिर गई ं। एक कोशिका द्वारा यात्रा की दूरी कोशिका (चित्रा 2डीमें सफेद तीर) और दिन 0 लाइन के बीच की दूरी की गणना करके मापा गया था । एंटी-एक्टिव कैस्पास 3 एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोसाइटोकेमिकल धुंधला, एपोप्टोसिस का एक मार्कर, वरीयता प्राप्त कोशिकाओं(चित्रा 2ई)में कोई अपोप्टोटिक संकेत नहीं दिखा। सह-संस्कृति प्रवास परख में, जब इंटरन्यूरॉन्स को मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ सह-वरीयता प्राप्त किया गया था, तो न्यूरॉन्स ने जब इंटरन्यूरॉन्स को अकेले वरीयता प्राप्त की गई थी या जब नियंत्रण एंडोथेलियल कोशिकाओं(चित्रा 2एफ)के साथ सह-वरीयता प्राप्त थी, तो न्यूरॉन्स ने आगे की दूरी तय की। इसके अलावा, एक ही दूरी सीमा के लिए, अन्य दो समूहों में इंटरन्यूरॉन्स की तुलना में पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ सह-वरीयता प्राप्त होने पर इंटरन्यूरॉन्स की अधिक संख्या बाहर हो गई। इससे पता चलता है कि माउस पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं की तरह, मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं मानव इंटरन्यूरॉन माइग्रेशन को बढ़ावा देती हैं।

कीमो-आकर्षण परख में, तीन अच्छी तरह से संस्कृति आवेषण का उपयोग कर, मानव interन्यूरॉन्स एक ३५ मिमी पाली-एल-ornithine/laminin लेपित संस्कृति पकवान में एक छोटे आयताकार पैच के रूप में वरीयता प्राप्त थे । पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं और नियंत्रण गैर-पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को न्यूरोनल पैच के दोनों ओर पैच के रूप में वरीयता दी गई थी, प्रत्येक पैच के बीच अंतर 500 माइक्रोन(चित्रा 3ए)के बीच अंतर था। पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं बनाम नियंत्रण एंडोथेलियल कोशिकाओं की ओर पलायन करने वाले इंटरन्यूरॉन्स की संख्या 36 घंटे के बाद निर्धारित की गई थी। नियंत्रण एंडोथेलियल कोशिकाओं(चित्रा 3बी, सी)की तुलना में अंतरन्यूरॉन्स की काफी अधिक संख्या पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं की ओर चले गए, इस बात की पुष्टि करते हुए कि गैबार्गिक इंटरन्यूरॉन्स मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं द्वारा स्रावित कीमो-आकर्षक संकेतों के लिए चुनिंदा प्रतिक्रिया करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: संस्कृति डालने की तैयारी। (क)एक दो अच्छी तरह से संस्कृति डालने । (ख)एक अच्छी तरह से एक ३५ मिमी पकवान के केंद्र में तय डालने । (ग)डालने को हटाने के बाद देखी गई आयताकार पैच की रूपरेखा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: स्कीमा और प्रवास परख का प्रतिनिधि परिणाम । (A)0 दिन पर सेल लेयर (लाल आयत) की स्कीमा। (ख)कोशिकाओं की स्कीमा कोशिका मुक्त स्थान में पलायन । लाल बिंदु माइग्रेटिंग कोशिकाओं का संकेत देते हैं। पीला क्षेत्र उस क्षेत्र को चिह्नित करता है जो डेटा अधिग्रहण के लिए इमेजमें है। ए और बी में बिंदीदार बॉक्स पैनलों सी और डीमें दिखाए गए क्षेत्र से मेल खाती है । (C,D) विरोधी के प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवियों-Tubulin एंटीबॉडी दिन 0(सी)और प्रवास परख के दिन 2(डी)पर इंटरन्यूरॉन्स लेबल । सफेद बिंदीदार लाइन 0 दिन के निशान । डी में पीली रेखा 48 घंटे(ई)न्यूरॉन्स (0 दिन) में एक कोशिका (सफेद तीर द्वारा चिह्नित) द्वारा यात्रा की दूरी को इंगित करती है, जिसे एंटी-ए-ट्यूबलिन एंटीबॉडी (लाल) और एंटी-एक्टिव कैस्पास 3 एंटीबॉडी (ग्रीन) के साथ सह-लेबल किया गया है, जो अपोप्टोटिक कोशिकाओं को चिह्नित करता है। नाभिक DAPI (नीले) के साथ दाग रहे हैं। वरीयता प्राप्त कोशिकाओं में एपोप्टोटिक कोशिकाओं का पता नहीं चला। (एफ)सह-संस्कृति परख के 5 दिन से ग्राफ, जहां माइग्रेट किए गए इंटरन्यूरॉन्स की संख्या यात्रा की दूरी के खिलाफ साजिश रची जाती है । इंटरन्यूरॉन्स की तुलना में जो अकेले वरीयता प्राप्त थे या नियंत्रण एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ सह-वरीयता प्राप्त थे, अंतरन्यूरॉन्स को पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ सह-वरीयता प्राप्त उच्च संख्या में बाहर चले गए, और आगे की दूरी भी तय की। डेटा मतलब ± एस.डी (n = 5; **पीएंड एलटी;0.01, ***पीएंड एलटी; 0.001, स्टूडेंट टी टेस्ट) का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल बार = 100 माइक्रोन= इंटरन्यूरॉन्स; पीवी ईसी = पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: कीमो-आकर्षण परख । (क)केमो-आकर्षण परख की स्कीमा । तीन-अच्छी संस्कृति डालने का उपयोग करते हुए, इंटरन्यूरॉन्स (आईएन) को मध्य (हरी बिंदीदार आयत) में वरीयता दी गई थी, जबकि पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं (पीवी ईसी; नारंगी बिंदीदार आयत) और नियंत्रण एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसीएस; पीले बिंदीदार आयत) को दोनों तरफ वरीयता दी गई थी। (ख)एंडोथेलियल कोशिकाओं को नियंत्रित करने की दिशा में नहीं बल्कि पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं की ओर मजबूत प्रवास दिखाते हुए इंटरन्यूरॉन्स लेबल की छवियां। (ग)इंटरन्यूरॉन्स की कीमो-आकर्षक प्रतिक्रिया का परिमाणीकरण। न्यूरॉन्स की एक काफी अधिक संख्या एंडोथेलियल कोशिकाओं को नियंत्रित करने की तुलना में पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं की ओर चले गए। डेटा मतलब ± एस.डी (n = 5; *पी एंड एलटी; ०.०५, छात्र टी टेस्ट) का प्रतिनिधित्व करता है । स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एक लाभ सीमाओं
बॉयडन चैंबर परख16,17 · तकनीकी रूप से गैर की मांग
· अनुयायी और गैर-अनुयायी कोशिकाओं के लिए उपयुक्त
· सेल माइग्रेशन पर पैराक्रिन सिग्नलिंग या कीमो-आकर्षित करने वालों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है		 · एंडपॉइंट परख। वास्तविक समय इमेजिंग के लिए उपयुक्त नहीं है।
· माइग्रेशन पर प्रत्यक्ष सेल-सेल इंटरैक्शन के प्रभाव के अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं
स्क्रैच परख18 · एंडपॉइंट या गतिज
· तकनीकी रूप से गैर की मांग		 · कुछ सौ माइक्रोमीटर की माइग्रेशन लंबाई पर ख़राब होती है। 1-2 सेमी की सीमा में लंबी दूरी के प्रवास के अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं है।
· निलंबन कोशिकाओं के लिए उपयुक्त नहीं
· स्क्रैच क्षेत्र में भिन्नता
लंबी दूरी के प्रवास परख · अंतिम बिंदु या गतिज
· 1.5 से 2 सेमी के बीच लंबी दूरी के प्रवास के अध्ययन की अनुमति देता है
· तकनीकी रूप से गैर की मांग		 · निलंबन कोशिकाओं के लिए उपयुक्त नहीं
सह संस्कृति प्रवास परख · अंतिम बिंदु या गतिज
· माइग्रेशन पर प्रत्यक्ष सेल-सेल संपर्क के प्रभाव के अध्ययन की अनुमति देता है
· 1.5 से 2 सेमी तक की माइग्रेशन लंबाई की अनुमति देता है
· तकनीकी रूप से गैर की मांग		 · निलंबन कोशिकाओं के लिए उपयुक्त नहीं
बी लाभ सीमाओं
बॉयडन चैंबर परख · तकनीकी रूप से गैर की मांग
· अनुयायी और गैर-अनुयायी कोशिकाओं के लिए उपयुक्त		 · एंडपॉइंट परख। लाइव इमेजिंग के लिए उपयुक्त नहीं है।
· खड़ी एकाग्रता ढाल
अंडर-अगारोज परख19 · तकनीकी रूप से गैर की मांग
· एक सेट अप में दो या दो से अधिक कीमो-आकर्षक संकेतों को परख े किया जा सकता है		 · अनुयायी कोशिकाओं के लिए उपयुक्त नहीं है। ज्यादातर रक्त कोशिकाओं तक प्रतिबंधित।
· अगारोज में कोशिकाओं का कठिन दृश्य
केशिका चैंबर माइग्रेशन परख20,21 · एंडपॉइंट या गतिज
· अनुयायी या निलंबन कोशिकाओं के लिए उपयुक्त		 · विशेष कक्षों की जरूरत है
माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस22 · नियंत्रणीय और स्थिर एकाग्रता ढाल उत्पन्न करता है
· एकल सेल स्तर के संकल्प की अनुमति देता है		 · परिष्कृत उपकरणों और उपकरणों की जरूरत है
· तकनीकी रूप से मांग और तेजी से सीखने की अवस्था
· जटिल इमेजिंग और डेटा विश्लेषण
कीमो-आकर्षण परख · अंतिम बिंदु या गतिज
· क्रमिक एकाग्रता ढाल
· वास्तविक समय या फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए उपयुक्त
· तकनीकी रूप से गैर की मांग		 · निलंबन कोशिकाओं के लिए उपयुक्त नहीं

तालिका 1: परख के तरीकों की तुलना। (A)लंबी दूरी के प्रवास परख और सह-संस्कृति परख के साथ आम इन विट्रो माइग्रेशन परखकी की तुलना । (ख)कीमो-आकर्षण परख के साथ आम कीमोटैक्सियों परखों की तुलना ।

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Discussion

यहां, हमने तीन इन विट्रो परखों का वर्णन किया है कि एक साथ मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल सेल-विशिष्ट गुणों का मात्रात्मक आकलन प्रदान करते हैं। ये परख मानव अंतरन्यूरॉन्स के साथ मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं की बातचीत में मशीनी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में मूल्यवान होंगे। जीन-विशिष्ट नॉकआउट या अतिअभिव्यक्ति वाले लिगांड, अवरोधकों या कोशिकाओं का उपयोग करने वाले प्रयोग आणविक खिलाड़ियों की पहचान या मान्य करेंगे जो एंडोथेलियल सेल-निर्देशित इंटरन्यूरॉन माइग्रेशन या पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं के लंबी दूरी के प्रवासी गुणों में मध्यस्थता करते हैं। इन परखों को लाइव-सेल टाइम-लैप्स माइग्रेशन स्टडीज करने के लिए भी संशोधित किया जा सकता है । इसके अलावा, इंटरन्यूरॉन्स के अलावा अन्य कोशिकाओं के साथ एंडोथेलियल कोशिकाओं की बातचीत के लिए सबूत है। हमारे समूह और अन्य लोगों के अध्ययनों ने अनुमान न्यूरॉन्स की तर्ज पर पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं के प्रभाव और तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं5,14,15के प्रसार की ओर इशारा किया है । हमारी परख सेटिंग्स का उपयोग करके इन संभावित बातचीत का परीक्षण करना रुचि का होगा। अंत में, ये परख रोगग्रस्त पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं के मूल्यांकन के लिए एक मंच के रूप में काम करेंगे । हमारे काम ने पेरिवेंट्रिकुलर वैस्कुलर नेटवर्क और सिजोफ्रेनिया, मिर्गी, आत्मकेंद्रित और प्रमुख अवसाद3,5जैसे न्यूरोसाइकियाट्रिक विकारों की उत्पत्ति के बीच उपन्यास स्वायत्त संबंध स्थापित किए हैं। ये परख लंबी दूरी के प्रवास, कीमो-आकर्षण, या इन न्यूरोसाइकियाट्रिक विकार स्थितियों में रोगग्रस्त-पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं के मुक्सट्रेट्रिन सिग्नलिंग में अमूल्य होंगे।

ये परख सरल, प्रजनन योग्य और कम लागत वाले हैं, और उन्हें गैर-अनुयायी कोशिकाओं को छोड़कर विभिन्न सेल प्रकारों में प्रवास पर सह-संस्कृति या कीमो-आकर्षक संकेतों के सेल माइग्रेशन और प्रभावों को मापने के लिए संशोधित किया जा सकता है। सटीक और प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम ों का पालन किए जाने की आवश्यकता है। सबसे पहले, प्रत्येक परख के लिए सीडिंग सेल नंबर को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है। एक ही डिब्बे में वरीयता प्राप्त होने वाली कोशिकाओं की संख्या कोशिका प्रकार, समप्रवाह के वांछित स्तर और सह-संस्कृति अनुपात जैसे परख-विशिष्ट कारकों पर निर्भर होना चाहिए । दूसरा, प्रत्येक परख के लिए सेल संस्कृति माध्यम का अनुकूलन करना आवश्यक है। सह संस्कृति प्रवास परख और कीमो आकर्षण परख में, जहां एक से अधिक सेल प्रकार एक ही पकवान में वरीयता प्राप्त है, परख माध्यम सभी सेल प्रकार के लिए अनुकूल होना चाहिए । पायलट प्रयोगों में, हमने प्रत्येक सेल प्रकार की व्यवहार्यता (ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन विधि का उपयोग करके) और आकृति विज्ञान (इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री का उपयोग करके) पर सह-संस्कृति माध्यम के प्रभाव की जांच की। हमने एक सप्ताह के लिए सह-संस्कृति माध्यम के साथ मानव गैबार्गिक न्यूरॉन्स को सुसंस्कृत किया और न्यूरोनल माध्यम में सुसंस्कृत न्यूरॉन्स की तुलना में सह-संस्कृति माध्यम में न्यूरॉन्स की व्यवहार्यता और आकृति विज्ञान में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा। इसी तरह के फैशन में, पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं और नियंत्रण एंडोथेलियल कोशिकाओं, दो मार्ग के लिए सह संस्कृति माध्यम में सुसंस्कृत, सेल अस्तित्व और आकृति विज्ञान में कोई महत्वपूर्ण बदलाव नहीं दिखा था । तीसरा, चूंकि माइग्रेशन की दर विभिन्न सेल प्रकारों के बीच भिन्न होती है, इसलिए अध्ययन किए जा रहे सेल प्रकार (एस) के लिए प्रत्येक परख के लिए समय सीमा निर्धारित करना महत्वपूर्ण है। चौथा, संस्कृति को ध्यान से सम्मिलित करना महत्वपूर्ण है। आवेषण धीरे एक उंगलियों के साथ दबाने से पकवान पर मजबूती से तय किया जाना चाहिए। पकवान उल्टा कर दिया जाना चाहिए सत्यापित करने के लिए कि डालने नहीं चल रहा है । डालने को हटाते समय भी देखभाल की जानी चाहिए ताकि सेल लेयर को परेशान न किया जा सके। अंत में, प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए नमूना आकार बढ़ाने की सिफारिश की जाती है।

निष्कर्ष में, इन परखों काफी मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल सेल जीव विज्ञान और सामांय और रोगग्रस्त परिस्थितियों में मस्तिष्क के विकास पर अपनी भूमिका के बारे में हमारी समझ का विस्तार होगा ।

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Disclosures

लेखक हितों का कोई टकराव नहीं घोषित करते हैं ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय मानसिक स्वास्थ्य संस्थान (R01MH110438) और राष्ट्रीय न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक (R01NS100808) से एवी को पुरस्कारों से समर्थन मिला ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase dissociation solution Millipore Sigma SCR005 Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4)
Anti-human β-Tubulin antibody Biolegend 802001
Anti-human CD31 antibody Millipore Sigma CBL468
Anti- MAP2 antibody Neuromics CH22103
Anti-active Caspase 3 antibody Millipore Sigma AB3623
Control human endothelial cells Cellular Dynamics R1022
Control endothelial Cells Medium Supplement Cellular Dynamics M1019
Cryogenic vials Fisher Scientific 03-337-7Y
DMEMF/12 medium Thermofisher Scientific 11320033
DMSO Sigma-Aldrich D2650
E6 medium Thermofisher Scientific A1516401
FGF2 Thermofisher Scientific PHG0261
Fibronectin Thermofisher Scientific 33016-015
Freezing Container Thermofisher Scientific 5100
GABA Sigma-Aldrich A2129
Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629
Human GABAergic neurons Cellular Dynamics R1013
Human GABAergic neurons base medium Cellular Dynamics M1010
Human GABAergic neuron Neural supplement Cellular Dynamics M1032
Laminin Sigma L2020
Matrigel Corning 356230 Basement membrane matrix
Mounting Medium Vector laboratories H-1200
poly-L-ornithin Sigma p4957
PBS Thermofisher Scientific 14190
Trypan blue Thermofisher Scientific 15250061
TrypLE Thermofisher Scientific 12563011 Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4)
VEGF-A Peprotech 100-20
VascuLife VEGF Medium Complete Kit Lifeline Cell Technologies LL-0003 Component of control human endothelial cell medium
2-well silicone culture-Insert ibidi 80209
3-well silicone culture-Insert ibidi 80369
35 mm dish Corning 430165
15-ml conical tube Fisher Scientific 07-200-886
4% PFA solution Fisher Scientific AAJ19943K2
6-well tissue culture plate Fisher Scientific 14-832-11
Inverted phase contrast microscope Zeiss Zeiss Axiovert 40C
Fluorescent microscope Olympus FSX-100

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References

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Datta, D., Vasudevan, A. Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons. J. Vis. Exp. (155), e60295, doi:10.3791/60295 (2020).

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