Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

גישה ניסויית לבדיקת איתות לפטין בגוף העורק והשפעותיו על השליטה בנשימה

Published: October 25, 2019 doi: 10.3791/60298
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Medicine, Johns Hopkins University, 2Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Respiratorias (CIBERES), Hospital Universitario Virgen del Rocío/Universidad de Sevilla

Summary

המחקר שלנו מתמקד בהשפעות של לפטין איתות בגוף העורק (CB) על התגובה ארוי מאווררים (HVR). ביצעת ' אובדן של פונקציה ' ניסויים מדידת ההשפעה של לפטין על HVR לאחר האצת CB ו ' להרוויח של פונקציה ' ניסויים מדידה HVR לאחר יתר ביטוי של קולטן לפטין ב-CB.

Abstract

הורמון מופק adipocyte הוא ממריץ נשימה חזקה, אשר עשוי לשחק תפקיד חשוב בהגנה על תפקוד הנשימה בהשמנה. הגופים הראשי (CB), איבר מפתח של רגישות ארוי היקפית, לבטא את התפקוד התפקודי ארוך של קולטן לפטין (LepRb) אבל את התפקיד של איתות לפטין בשליטה של נשימה לא הובהר במלואו. בדקנו את התגובה ארוי מאווררים (HVR) (1) ב C57BL/6J עכברים לפני ואחרי לפטין אינפוזיה בתוכנית הבסיסית ולאחר שימור CB; (2) ב- Leprb-שמנים לקויה db/db בעכבר בבסיס ואחרי leprb ביטוי יתר ב-CBs. ב C57BL/6J עכברים, לפטין גדל HVR ואפקטים של לפטין על HVR בוטלו על ידי CB denervation. ב- db/db , ביטוי leprb ב-CB מוגבר את hvr. לכן, אנו מסיקים כי לפטין פועל ב-CB כדי להגדיל את התגובות היפוקסיה.

Introduction

Adipocyte המיוצר הורמון לפטין פועל ההיפותלמוס לדכא את צריכת המזון ולהגדיל את קצב חילוף החומרים. מחקרים שבוצעו במעבדה שלנו1,2 ועל ידי חוקרים אחרים3,4 הראה כי לפטין מגביר את התגובה היפרקפיניק מאווררים (hvr) מניעת השמנה hypoventilation לפטין השמנה לקויה. עם זאת, רוב האנשים שמנים יש פלזמה גבוהה לפטין רמות ולהפגין עמידות השפעות מטבולית והנשימה של הורמון5,6,7,8. עמידות לפטין הוא רב עצרת, אבל חדירות מוגבלות של מחסום הדם-מוח (BBB) לפטין משחק תפקיד מרכזי. אנו מציעים כי לפטין פועל מתחת BBB באיבר מפתח של רגישות ארוי היקפית, הגופים הראשי (CB), כדי להגן על הנשימה של אנשים שמנים. הלמ ס לבטא את התפקוד הארוך isoform של קולטן לפטין, leprb, אבל התפקיד של CB באפקטי הנשימה של לפטין לא הובהר מספיק9,10.

המטרה של השיטה שלנו היתה לבחון את ההשפעה של לפטין איתות ב-CB על HVR. הרציונל שלנו היה לבצע (a) אובדן של הפונקציה ניסויים החדרת לפטין בעכברים עם גופים העורק שלמים וגופים העורק הראש denervated ואחריו מדידות HVR; (ב) להשיג ניסויים בפונקציה db/db בעכברים חסרים leprb, שבו אנו מדדו hvr בתוכנית הבסיסית ולאחר ביטוי של leprb בלעדית ב-CB. היתרון של הטכניקות שלנו היה שאנחנו ביצעו את כל הניסויים שלנו בעכברים ללא רסן בזמן שינה ועירות. חוקרים קודמים ביצעו את הניסויים שלהם תחת הרדמה9 או לא למדוד את ההשפעות של לפטין במהלך שינה10. בנוסף, המחקר שלנו הוא הראשון לנצל את הרווח הייחודי של גישת הפונקציה עם הביטוי LepRb סלקטיבי ב-CB שתוארו לעיל.

בהקשר הרחב, הגישה שלנו יכולה להיות כללית לקולטנים אחרים המבוטא ב-CB ותפקידם ברגישות ארוי. החוקרים יכולים להחדיר ליגאל ולקולטן של ריבית ולמדוד את HVR בתוכנית הבסיסית ולאחר השעה שימור. כגישה משלימה, ניתן לבטא את קולטן הריבית ב-CB ו-HVR מדידות שניתן לבצע לפני ואחרי ביטוי יתר באמצעות הטכנולוגיה שתוארה בכתב יד זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפרוטוקולים הניסיוניים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (MO18M211).

1. אינפוזיה לפטין

הערה: כדי לבחון את ההשפעה של לפטין על נשימה, התת-עורי לפטין C57BL/6J עכברים על ידי משאבת אוסמוטי להעלות במחזור רמות לפטין לאלה שנצפו עכברים שמנים.

  1. הכנת משאבת אוסמוטי
    1. שוקלים את המשאבה הריקה כדי לבדוק את משקל נטו של הפתרון טעון.
    2. הוסף לפטין (5 מ"ג/mL) למשאבה אוסמוטי (1 μL/h במשך 3 ימים). ממלאים את המשאבה במזרק קטן (1 מ ל). לאחר מילוי, לסגור את המשאבה עם סיפק בוטה משופעת 27 מד מילוי צינור.
      הערה: המזרק והשפופרת המצורפת צריכים להיות ללא בועות אוויר.
    3. לאחר מילוי, לשקול את המשאבה שוב כדי לבדוק את משקל נטו של הפתרון.
    4. הכנס את המשאבה לפטין תת-עורי באזור הגלימה.
      הערה:       אם אתה רוצה להתחיל את העירוי מיד, מומלץ להזרים את המשאבה שלפני המילוי בתמיסת המלח הסטרילית ב-37 ° c לפחות 4 עד 6 שעות (רצוי לילה).

2. ארוי מאווררים התגובה (HVR)

הערה: תנאי thermoneutral לחסל גורמים מלחיצים שהוטלו על ידי טמפרטורת הסביבה קריר ולשנות באופן משמעותי את חילוף החומרים בעכברים. לכן, יש לבצע את כל מדידות הנשימה בתנאים התרמותרמיים (t = 30 ° c) תוך שימוש באינקובטור התינוק12 (איור 1א). כל חדר המלא של הגוף (WBP) שימש עבור כל המדידות. כל בעלי החיים צריכים להיות מסתגלות לחדר החריץ הברומטרי ולצווארון צוואר מזויף עבור הקלטה מחמצן בעקבות הדופק במשך 3-5 ימים לפני מדידות HVR. HVR מוקלט בין השעות 10:00 ו-17:00. HVR מדוכאים במהלך השינה, ולכן זה יכול להיות נמדד בנפרד במהלך שינה ושקט ערות13. כדי להבטיח את השלב הספציפי להתעוררות שינה של בעל החיים במהלך מדידת HVR, אלקטרודות EEG/EMG צריך להיות מושתל כמו כותרת EEG/EMG כאשר תיאר בעבר14. בעלי חיים צריכים להיות מורשים להתאושש לפחות 72 h לאחר הר הראש. יש לבצע שינה בתקופות של 5 מנות. שינה NREM מזוהה על ידי הפעילות EEG גל איטי הכובש יותר מ 50% התקופה. ערות שקט באה לידי ביטוי בפעילות ה-EEG האלפא בהעדר תנועות. שינה REM מזוהה על-ידי הכוח השולט EEG ו תטא בנוכחות של טונוס שרירים מופחת ב EMG. בדרך כלל, השינה REM לא נצפתה במהלך אתגרי HVR גז.

  1. פרוטוקול ההקלטה של HVR
    1. השתמש בחדר WBP של הגודל הבא: קוטר פנימי של 80 מ"מ, גובה של 50.5 מ"מ, ונפח של 0.4 L. תא WBP מורכב משני תאים, תאי התייחסות, ופלטפורמה מעגלית למקום העכבר14 (איור 1ב). זרימה וזרימה בתוך התא נשלטים על ידי מקורות לחץ חיוביים ושליליים שמירה על לחץ אטמוספרי. שליטה זו יוצרת זרימת הטיה יציבה בחדר ומונעת שמירה של CO2 . לפרטים נוספים על הגדרת WBP, ראה הרננדז ועמיתיו15.
    2. למדוד את הטמפרטורה בתוך התא ואת הלחות יחסית בחדר לפני הצבת העכבר ב-WBP.
    3. למדוד את משקל הגוף ואת הטמפרטורה פי הטבעת.
    4. לשים את הצווארון חמצן סביב הצוואר של העכבר (האזור צריך להיות מגולח בעבר).
    5. מניחים את העכבר בתוך WBP ולוודא את החדר הוא אטום לחלוטין כדי למנוע leakages אוויר.
    6. המתן כ -30 דקות עד שהעכבר שקט והחדר נמצא בכרך קבוע.
    7. Normoxia: לאחר 30 דקות, אם העכבר שקט, להתחיל להקליט את אותות הנשימה ואת רוויית חמצן היקפית (SpO2) בשלב normoxia (21% fio2 ב 1 כספומט של לחץ) עבור 20 דקות, באמצעות labchart 7 Pro (גירסה 7.2).
    8. היפוקסיה: לאחר 20 דקות של normoxia שקט, להתחיל להקליט את המחזור הראשון של היפוקסיה חריפה ו-SpO2. לשלב היפוקסיה, לחשוף את החיות לתזרים קבוע גז מעורב מורכב על ידי 10% O2 ו 3% CO2 עבור 5 דקות.
      1. במהלך 30 השניות הראשונות של היפוקסיה, הגז המעורב זורם דרך החדר דרך 2 יציאות צד קטן בבסיס המאפשר FiO2 לרדת מ 21% (ב 1 כספומט של לחץ) עד 10%.
      2. לאחר 30 הראשונים, לסגור את אחד הנמלים בצד הקטן של חדר WBP ולשמור על הקלטת היפוקסיה קבוע ב 10% FiO2 עבור 5 דקות.
        הערה: התערובת של 10% O2 ו 3% CO2 ב היפוקסיה משמש כדי לשמור על eucapnea11.
    9. לאחר 5 דקות של היפוקסיה, לחשוף את העכבר על האוויר בחדר שוב (21% FiO2 ב 1 כספומט של הלחץ) על ידי החלפת מקור זרימה.
    10. המתן לפחות 30 דקות עד ההקלטה הבאה normoxia על מנת להתאושש מחשיפה ארוי הקודם כדי למנוע את התופעה מאווררים-off (כלומר, דיכוי מרכזי של נשימה במהלך היפוקסיה16).
      הערה: חזור על normoxia/היפוקסיה מחזורי שלוש פעמים בכל עכבר כדי להבטיח את הביסות של המידות. בניסיון שלנו, נוסף (יותר מ 3 פעמים ביום נתון) יש להימנע ארוי חשיפות, בגלל ההסתגלות מאווררים (התופעה מתגלגל).
    11. בסוף הניסוי, כיול את תא WBP (כאשר העכבר עדיין בפנים) על ידי הזרקת 1 מ ל של אוויר החדר 3 פעמים עם מזרק מחובר באחת היציאות בצד הקטן בבסיס החדר.
    12. למדוד את הטמפרטורה בחדר שוב עם בעל החיים בתוכו.
    13. פתח את התא ולמדוד את הטמפרטורה הרקטלית של העכבר לפני הצבת אותו בחזרה כלוב הבית שלו.
  2. חישוב HVR
    1. דיגיטייז כל האותות עבור חישוב HVR ב 1,000 Hz (תדר דגימה לערוץ).
      הערה: ניתוח כמות הגאות WBP מבוצע בתרשים Lab 7 מבוסס על משוואת Drorbaugh ו-Fenn17. המשתנים הנדרשים מהווים טמפרטורה רקטלית של העכבר והטמפרטורה הקאמרית (לפני ואחרי HVR מדידה), לחות יחסית, וקבוע הגז התאי. קבוע זה הוא תוצאה של הסטה לחץ WBP לאחר זריקות 1 mL של אוויר בשלב כיול. לפרטים נוספים, ראו הרננדז ועמיתיו15.
    2. לאחר חישוב משוואת Drorbaugh ו Fenn, להכפיל את נפח הגאות (Vt) הערוץ על ידי הקבוע.
    3. מבחר הקלטות לניתוח
      1. Normoxia: לבחור רק סעיפים של נשימה יציבה עם נפח הגאות קבוע. הימנע ממקטעים בקרבת תנועות של העכבר.
      2. היפוקסיה: להתעלם 30 s הראשון כאשר O2 רמות מתדרדר מ 21% כדי 10%, בחר מקטעים מ 30 כדי 2 דקות של 10% או2 חשיפה (מרווח 90 s). בתוך פרק זמן זה, בחר רק מקטעים עם נשימה יציבה עם נפח גאות קבוע. הימנע ממקטעים בקרבת תנועות של העכבר. הניתוח הוא אמין אם לפחות 10 s של היפוקסיה נבחרה בכל מחזור.
        הערה: הרכיב ההיקפי של מורפלקס נשלט על-ידי CB ב1-2 במהלך הראשון של המאה הקודמת של חשיפה16,18,19. בשלב השני, בין 2 דקות לבין 5 דקות של חשיפה ארוי, המרכיב ההיקפי והמרכזי ממלאים תפקיד. בסופו של דבר, השלב השלישי, > 5 דקות, מאופיין בהיפואפאיוורור (תופעת הגלגול) הנשלטת ברובו על ידי מרכז הכמורטורים. הניסיון שלנו מראה כי עכברים הם לעתים קרובות ערים במהלך ארוי התערוכה בגלל המתגים ידנית במקור זרימת האוויר.
    4. לאחר הבחירה, לחשב את אוורור הדקה ממוצע (VE) בתנאים normoxic ו ארוי באמצעות הנוסחה Ve = עוצמת הנשימה של שיעור X.
    5. לחשב את SpO ממוצע2 ב normoxia ובתנאי היפוקסיה.
    6. לחשב את HVR באופן ידני באמצעות הנוסחה HVR = (Ve (10% o2)-Ve (21% o2)/(Spo 2 (10 % o2) –spo2 (21% o 2)).
      הערה: בעכברים C57BL/6J, המשאבה האוסמוטי לפטין העירוי עלולה לפגוע בזיהוי האותות המדויק של SpO2 על ידי צווארון הצוואר. במקרה זה, HVR מחושבת על בסיס ערכי FiO2 בתנאים normoxic ו ארוי כמו hvr = ΔVE /ΔFiO211.

3. שימור הגוף העורק או ניתוח עצבי בעורק הראש (CSND)

הערה: ביצעת שילוב משולב כירורגי וכימי בהפרש של שבוע אחד בנפרד, מכיוון שסלסול כירורגי בלבד אינו מבטל את ארוי chemoreflex.

  1. הכנה כירורגית
    1. בצע את כל ההליכים על עכבר זכר מבוגר C57BL/6J. . לחטא את כל כלי הניתוח השתמש כפפות כירורגי סטרילי, מזרקים ומכשירי כותנה משופעת.
    2. הC57BL זכר/העכבר 6J באמצעות 1-2% באמצעות חרוט האף ומניחים שמיכה חמה כדי למנוע היפותרמיה. Isofלינה היא בקפידה מנסה לשמור על קצב הנשימה ב 1 הרץ (60 נשימות/דקות). הלימות ההרדמה לפני התחלת הניתוחים יהיה מוערך על ידי תדר נשימה, העדר תנועות ורעשים שומעים, העדר תגובה גירוי מישוש ו-forelimb או הדוושה הפדאל נסיגה רפלקס.
    3. ניהול בופראורפין (0.05 מ"ג/ק"ג) intraperitoneally כדי למנוע אי נוחות של כאב. הסירו את השיער באזור הצוואר ולחטא את האזור בבטאדין ובאלכוהול.
    4. כדי למנוע התייבשות, יש לשמן את עיני העכברים במשחה אופטלמולוגית בזמן ההרדמה.
  2. הליכי CSND
    שלב 1: שימור כירורגי
    1. לאחר החתך באמצע הדרך, לחשוף את החיתוך של העורקים העורק המשותף על ידי הסרת רקמות החיבור ואת רקמת השומן.
    2. לזהות את העצב ההיפוגלואל, אשר בדרך כלל בולט מאוד, ולאחר מכן להרים אותו כדי לחשוף את העצב הglossopharyngeal מיד מתחת. מבקיעים באמצעות מספריים. של מיקרו-קפיץ
    3. תסגור את החתך עם. תפר המשי 6-0
    4. מנהל 1 mL של תת-עורי מלוחים רגיל כדי למנוע התייבשות.
    5. הבית העכברים בתא התאוששות ולפקח על התנהגותם כל 15 דקות עבור הראשונית 1 h עד העכברים להחזיר את התודעה כדי לשמור על שכיבה. להחזיר את העכברים לכלובים הביתה שלהם לאחר שהם התאושש לחלוטין. המשיכו להשגיח על העכברים פעמיים ביום במשך 3 הימים הבאים. תן בופרנורפין נוספים אם עכברים מראים סימנים כלשהם של כאב (למשל, מופחתת תיאבון, חוסר משקט).
      שלב 2: שימור כימי
    6. שבוע לאחר הניתוח, צבעו את העורק הראשי בתמיסה של 2% פנול מדולל באתנול בנקודות הסתעפות מעצב הglossopharyngeal ועד לקוטב הגולגולת של ה-CB. אותו טיפול שלאחר הניתוח צריך להיות מסופק לאחר שימור כימי כמתואר לעיל בסעיף הניתוח הכירורגי.
      הערה: עבור קבוצת ניתוחים מזויפים, אותם הליכים מבוצעים מלבד ניתוח עצבי הסינוסים בעורק הראש.
    7. תן לחיות להתאושש 5-7 ימים לפני מדידות HVR.

4. ביטוי של LepRb ב-CB באמצעות וקטור אדנונגיפי (Ad-leprb) לעומת שליטה (ad-lacz)

  1. Ad-LepRb ו -ad-lacz השעיה
    1. העברה העכברים עם אדנווירוס (Ad-LepRb-gfp, 2-5X1010 Pfu/Ml עבור ביטוי יתר, Ad-Lacz, 1 x 1010 pfu/ml על השליטה) לאזור CB.
    2. הפשרת המטריצה של מטריקס על ידי מיזוג הבקבוקון בקרח במקרר של 4 ° c ללילה.
    3. בעדינות להשעות אדנווירוס ב מטריצה מטריקס נוזלית ב 1:5 (1 μL של מטריצה מטריקס ו 4 μL של אדנווירוס מוחל בקיעים).
    4. תמיד לשמור על השעיה ויראלי על הקרח עד שהוא מוחל ב-CB.
  2. הכנה כירורגית
    1. השתמש באותם כלים כירורגיים כמו פרוטוקול CSND.
    2. באמצעות חרוט החיות על שמיכה חמה כדי למנוע היפותרמיה, יש להשתמש באצטרובל לאחרלינה לקויה. Isofלינה היא בקפידה מנסה לשמור על קצב הנשימה ב 1 הרץ (60 נשימות/דקות). הלימות של הרדמה יהיה מוערך על ידי תדר נשימה, העדר תנועות ורעשים שומעים, העדר תגובה גירויים מישוש ואת forelimb או לנסיגה פדאל הדוושה רפלקס.
    3. ניהול בופרנורפין (0.05 מ"ג/ק"ג) intraperitoneally.
    4. להסיר את השיער באזור הגחוני של הצוואר לחטא את האזור עם betadine ואלכוהול כמו בפרוטוקול CSND.
    5. כדי למנוע התייבשות, יש לשמן את עיני העכברים במשחה אופטלמולוגית בזמן ההרדמה.
  3. אדנווירוס טיפול של CB
    1. לחשוף CBs כמתואר בפרוטוקול CSND ולהחיל 5 μL של הבולם הנגיפי לאזור CB בקיעים.
    2. המתן 2-3 דקות עד שהמטריצה הנוזלית הופכת לג. לאחר אישור כי הבולם הנגיפי היה מסוגר, לסגור את החתך עם תפר משי 6.0.
  4. לאחר הניתוח
    1. הבית העכברים בתא התאוששות ולפקח על התנהגותם כל 15 דקות עבור הראשונית 1 h עד העכברים להחזיר את התודעה כדי לשמור על שכיבה. להחזיר את העכברים לכלובים הביתה שלהם לאחר שהם התאושש לחלוטין. המשיכו להשגיח על העכברים פעמיים ביום במשך 3 הימים הבאים. תן בופרנורפין נוספים אם עכברים מראים סימנים כלשהם של כאב (למשל, מופחתת תיאבון, חוסר משקט).
    2. ניהול בופראורפין (0.05 מ"ג/ק"ג) intraperitoneally לפי הצורך כדי למנוע אי נוחות של כאב במהלך התקופה שלאחר הניתוח.
    3. למדוד HVR 9 ימים לאחר הזיהום אדנווירוס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אינפוזיה רציפה של לפטין גדל באופן משמעותי HVR ב רזה C57BL/6J עכברים מ 0.23 אל 0.31 mL/min/g/ΔFiO2 (P < 0.001, איור 2)11. CSND ביטלה את העלייה לפטין המושרה ב HVR (איור 2), בעוד לא השפעות מחליש של CSND על hvr נצפו בקבוצה ניתוח דמה לאחר לפטין אינפוזיה.

LepRb ביטוי ב-CB של leprb-מהשמנת יתר db/db עכברים המושרה עלייה משמעותית hvr מ 0.05 אל 0.06 mL/min/g/ΔSpO2 (איור 3). בבעלי חיים מזוהמים במודעה שליטה-LacZ ב- CB, hvr לא השתנה.

Figure 1
איור 1: מדידות HVR. יש לבצע ניסויים בתנאי תרמופלטיים באמצעות (א) אינקובטור של התינוק ב -30 ° צ' ונרשמיםב תאמלא לגוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: לפטין מורחבת התגובה ארוי מאווררים (HVR) ואת ההשפעות בוטלו על ידי ניתוח עצבי בסינוסים העורק (CSND) ב C57BL/6J עכברים. דמות זו שונתה מקאבאלארו-מחק ואח '11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ביטוי LepRb בגוף העורק (CB) של leprb- db נתונים/db הגדילו את תגובת ארוי מאווררים (hvr). נתון זה שונה מקאבאלארו-מחק ואח'. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המוקד העיקרי של המחקר שלנו היה לבחון את תופעות הנשימה של איתות לפטין ב-CB. מספר פרוטוקולים פותחו כדי להעריך את התפקיד של לפטין בצורה מכניסטית. ראשון, התרומה הספציפית של CB ל HVR נותחו על ידי כימות זהיר של HVR במהלך 2 הדקות הראשונות של חשיפה ארוי. שנית, הרלוונטיות של ה-CB בלפטין-בתיווך השליטה בנשימה נבדקה על-ידי שתי גישות משלימות. בעכברים מסוג פראי רזה עם רמות לפטין נמוכה, HVR נמדדה בסיסית ולאחר אינפוזיה רציפה של לפטין; הניסוי חזר לאחר שימור הרדיו. ב- leprלקויה DB/db עכבר, hvr נמדד בתוכנית הבסיסית ואחרי leprb ביטוי ב-CB.

פרוטוקולים מספר שימשו כדי למדוד HVR במכרסמים, חשיפת בעלי חיים ארוי גזים. פיתחנו פרוטוקול HVR כדי לבחון את התפקיד של CB בתוך הציוד ההיקפי, ואת ההשפעות של לפטין ב-CB על השליטה של נשימה. ל-CB צ'מורפלקס יש תחום זמן קצר יחסית. הראשון 1-2 מינימום של היפוקסיה מאופיינים על ידי הגדלת חריפה של תגובה מאווררים ואחריו חזרה איטית אוורור בסיסית לאחר 2 דקות של גירוי עצבי העורק העורקי16,18,19. כך, בפרוטוקול HVR שלנו, הניתוחים מתנהלים בתוך מרווח 90 s בין הראשון 30 s של היפוקסיה ו 2 דקות של 10% או2 חשיפה, המתאים לשליטה של היקפי cheמורפלקס נשלט על ידי CB. ניתוח זמן קצר זה מונע את הדיכאון ארוי מאווררים בבעלי חיים. בפרוטוקול hvr שלנו, השתמשנו גם קבוע 3% CO2 מתח ב היפוקסיה כדי לעקוף את hypocapnia הנגרמת על ידי נשימת במהלך חשיפה ארוי חריפה11. לבסוף, פיתחנו את הפרוטוקול HVR תחת תנאים thermoneutral קבוע, שמירה על העכברים בטמפרטורה של כ 30 ° c. הניסיון שלנו מראה כי חשיפות קצרות כדי היפוקסיה יכול להקטין את טמפרטורת הרקטום בעכברים אם החשיפה מתרחשת בטמפרטורת החדר11, בעוד היפוקסיה ב thermoneutrality אינה לגרום שינויים מטבולית משמעותיים12.

CSND בעכברים היא מאתגרת טכנית, בגלל הגודל הקטן של בעלי החיים ו-CBs שלהם. פיתחנו גישה מוצלחת בעקביות עם כמעט 100% שיעור ההישרדות על ידי דבקות קפדנית הפרוטוקול שלנו. תנאים מבוקרים בפרוטוקול שלנו כולל סביבה thermoneutral הרדמה מבוקרת בקפידה תקן מיקרוניתוחי מיקרו-כירורגי עם ויזואליזציה של העצב הglossopharyngeal כניהול שלאחר הניתוח המשמר עם כאב פקד. הניסיון שלנו מראה כי שימור כירורגי לבד אינו מבטל את ארוי chemoreflex. השלב השני, מעקב כימי, מלווה גם בניהול פוסט-פעיל זהיר כדי לשפר את ההישרדות.

הטכניקה החדשנית ביותר שלנו היא גנים סלקטיבית על ביטוי באזור CB. גישה זו לא יושמה קודם לכן, בגלל הגודל הקטן של הלמ ס והעדר נהגים ספציפיים המאפשרים לבטא גן מעניין בסוג תא מסוים. למעשה, הקלד I CB תאים דומים מאוד לנוירונים או תאים של האדרנל של ליבת יותרת הכליה, בעוד התאים סוג II דומים אסטרוציטים20,21. ניצלנו את db/db עכברים, אשר חסר הגן leprb , היכולת שלנו להחיל ההשעיה אדנונגיליות כמעט באופן בלעדי לאזור CB, ותכונות של מטריצה מטריקס, אשר מתגבש במהירות ב 37 ° c. הגישה הרומן שלנו ניתן להשתמש בעתיד ללמוד תפקיד של כל גן המבוטא ב-CB באמצעות עכברים עם הגוף כולו טירולי הידרוקסילאז ספציפי (סוג I תאים) או הספציפי GFAP (סוג II התאים) הנוק אאוט.

. לפרוטוקולים שלנו יש מספר מגבלות ראשית, השתמשנו 3% CO2 כדי לקבוע את hvr ואת השאלה נותרת פתוחה אם החלק של hvr יכול באמת להיות מיוחס לתגובה hypercapnic. כדי לטפל במגבלה זו, החוקרים יכולים בו למדוד את התגובות 3% CO2 מאוזנת גז hyperoxic, אשר היה לכבות את CB. שנית, HVR לא יכול להיות מסולק לחלוטין על ידי CSND22. ניתן לייחס תופעה זו לנוירופלסטיות, הבולטת במיוחד בעכברים. לכן, חשוב ללמוד HVR בהקדם האפשרי לאחר CSND ותמיד להשתמש בקרת ניתוח מזויף. שלישית, ביטוי הגנים שלנו מתקרב. לסוג תא ולספציפיות לאיברים טכניקות מולקולריות עם השימוש העתידי של היזמים סלקטיבית יותר עשויים לסייע להתנגד למגבלה זו.

לסיכום, למרות שמתואר לעיל מגבלות, הפרוטוקולים שלנו בשילוב לאפשר ללמוד את התפקיד של גנים מסוימים CB בתגובות פיסיולוגיים להיפוקסיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין תחומי עניין או גילויים סותרים.

Acknowledgments

R01HL138932, RO1HL133100, RO1HL128970, AHACDA34700025

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Insulin Syringes BD Biosciences 309311
1x PBS (pH 7.4) Gibco 10010-023 500 ml
Ad-Lacz Dr. Christopher Rhodes (University of Chicago) 1 x 1010 pfu/mL
Ad-LepRb-GFP Vector Biolabs ADV-263380 2-5 x 1010 pfu/mL
Anesthetic cart Atlantic Biomedical
Betadine Purdue Products Ltd. 12496-0757-5
Buprenorphine (Buprenex) Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. 12496-0757-5 0.3 mg/mL
C57Bl/6J Jackson laboratory 000664 Mice Strain
Cotton Gauze Sponges Fisherbrand 22-362-178
db/db Jackson laboratory 000697 Mice Strain
Ethanol Pharmco-AAPER 111000200
Isoflurane Vetone 502017
Lab Chart Data Science International (DSI) Software
Matrigel Matrix BD Biosciences 356234
Micro Spring Scissors World Precision Instruments (WPI) 14124
Mouse Ox Plus STARR Life Sciences Corp. Software
Mouse Ox Plus Collar Sensor STARR Life Sciences Corp. 015022-2 Medium Collar Clip Special 7”
Mouse Whole Body Plethysmography Chamber Data Science International (DSI) PLY3211
Ohio Care Plus Incubator Ohmeda HCHD000173
Operating Scissors World Precision Instruments (WPI) 501753-G Straight
Osmotic Pump Alzet 1003D 1 μL/h, 3 days
Phenol Sigma-Aldrich P4557
Recombinant Mouse Leptin protein R&D systems 498-OB-05M 5 mg
Saline RICCA Chemical 7210-16 0.9% Sodium Chloride
Sterile Surgical Suture DemeTech DT-639-1 Silk, size 6-0
Thermometer Innovative Calibration Solutions (INNOCAL) EW 20250-91

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'donnell, C. P., et al. Leptin prevents respiratory depression in obesity. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159, 1477-1484 (1999).
  2. Polotsky, V. Y., et al. Female gender exacerbates respiratory depression in leptin-deficient obesity. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164, 1470-1475 (2001).
  3. Bassi, M., et al. Central leptin replacement enhances chemorespiratory responses in leptin-deficient mice independent of changes in body weight. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 145-153 (2012).
  4. Inyushkina, E. M., Merkulova, N. A., Inyushkin, A. N. Mechanisms of the respiratory activity of leptin at the level of the solitary tract nucleus. Neuroscience and Behavioral Physiology. 40, 707-713 (2010).
  5. Considine, R. V., et al. Serum immunoreactive-leptin concentrations in normal-weight and obese humans. New England Journal of Medicine. 334, 292-295 (1996).
  6. Maffei, M., et al. Leptin levels in human and rodent: measurement of plasma leptin and ob RNA in obese and weight-reduced subjects. Nature Medicine. 1, 1155-1161 (1995).
  7. Phipps, P. R., Starritt, E., Caterson, I., Grunstein, R. R. Association of serum leptin with hypoventilation in human obesity. Thorax. 57, 75-76 (2002).
  8. Berger, S., Polotsky, V. Y. Leptin and Leptin Resistance in the Pathogenesis of Obstructive Sleep Apnea: A Possible Link to Oxidative Stress and Cardiovascular Complications. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 5137947 (2018).
  9. Ribeiro, M. J., et al. High fat diet blunts the effects of leptin on ventilation and on carotid body activity. The Journal of Physiology. 96, 3187-3199 (2018).
  10. Yuan, F., et al. Leptin signaling in the carotid body regulates a hypoxic ventilatory response through altering TASK channel expression. Frontiers in Physiology. 9, 249 (2018).
  11. Caballero-Eraso, C., et al. Leptin acts in the carotid bodies to increase minute ventilation during wakefulness and sleep and augment the hypoxic ventilatory response. The Journal of Physiology. 591, 151-172 (2018).
  12. Jun, J. C., Shin, M. K., Yao, Q., Devera, R., Fonti-Bevans, S., Polotsky, V. Y. Thermoneutrality modifies the impact of hypoxia on lipid metabolism. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 304, 424-435 (2012).
  13. Polotsky, V. Y., et al. Impact of interrupted leptin pathways on ventilatory control. Journal of Applied Physiology. 96, 991-998 (2004).
  14. Pho, H., et al. The effect of leptin replacement on sleep-disordered breathing in the leptin-deficient ob/ob mouse. Journal of Applied Physiology. 120, 78-86 (2016).
  15. Hernandez, A. B., et al. Novel whole body plethysmography system for the continuous characterization of sleep and breathing in a mouse. Journal of Applied Physiology. 112, 671-680 (2012).
  16. Powell, F. L., Milsom, W. K., Mitchell, G. S. Time domains of the hypoxic ventilatory response. Respiration Physiology. 112, 123-134 (1998).
  17. Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16, 81-87 (1955).
  18. Duffin, J. Measuring the ventilatory response to hypoxia. The Journal of Physiology. 587, 285-293 (2007).
  19. Teppema, L. J., Dahan, A. The Ventilatory Response to Hypoxia in Mammals: Mechanisms, Measurement, and Analysis. Physiological Reviews. 90, 675-754 (2010).
  20. Nurse, C. A., Fearon, I. M. Carotid body chemoreceptors in dissociated cell culture. Microscopy Research and Technique. 59, 249-255 (2002).
  21. Kumar, P., Prabhakar, N. R. Peripheral chemoreceptors: function and plasticity of the carotid body. Comprehensive Physiology. 2, 141-219 (2012).
  22. Roux, J. C., Peyronnet, J., Pascual, O., Dalmaz, Y., Pequignot, J. M. Ventilatory and central neurochemical reorganisation of O2 chemoreflex after carotid sinus nerve transection in rat. The Journal of Physiology. 522, 493-501 (2000).

Tags

ביולוגיה סוגיה 152 לפטין העורק הגוף ארוי מאווררים התגובה עצב הסינוס של העורק וקטור ויראלי השמנת יתר
גישה ניסויית לבדיקת איתות לפטין בגוף העורק והשפעותיו על השליטה בנשימה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shin, M. K., Kim, L. J.,… More

Shin, M. K., Kim, L. J., Caballero-Eraso, C., Polotsky, V. Y. Experimental Approach to Examine Leptin Signaling in the Carotid Bodies and its Effects on Control of Breathing. J. Vis. Exp. (152), e60298, doi:10.3791/60298 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter