Summary
Vores undersøgelse fokuserer på virkningerne af Leptin signalering i carotis krop (CB) på hypoksiske ventilatorisk respons (HVR). Vi udførte eksperimenter med» tab af funktion «, der målte Leptin-effekten på HVR, efter at der var blevet foretaget en» Gain of Function «-eksperimenter, som målte HVR efter overekspression af Leptin-receptoren i CB.
Abstract
En adipocyte-producerede hormon Leptin er en potent respiratorisk stimulerende, som kan spille en vigtig rolle i forsvaret respiratorisk funktion i fedme. Carotis-organerne (CB), et nøgle organ med perifer hypoxisk følsomhed, udtrykker den lange funktionelle isoform af Leptin-receptoren (LepRb), men leptinsignalering i kontrol af vejrtrækningen er ikke fuldt belyst. Vi undersøgte hypoksiske ventilatorisk respons (HVR) (1) i C57BL/6j mus før og efter Leptin infusion ved baseline og efter CB denervation; (2) i Leprb-mangel på fede DB/DB -mus ved baseline og efter leprb -overekspression i CBs. I C57BL/6J-mus blev Leptin forhøjet HVR, og virkningen af Leptin på HVR blev afskaffet ved CB denervation. I DB/DB -mus forstørrede leprb -EKSPRESSION i CB HVR. Derfor konkluderer vi, at Leptin virker i CB til at forstærke respons på hypoksi.
Introduction
En fedtcellerne produceret hormon Leptin handlinger i hypothalamus at undertrykke fødeindtagelse og øge stofskiftet. Undersøgelser udført i vores laboratorium1,2 og af andre investigatorer3,4 viste, at Leptin øger hypercapnic ventilatorisk respons (HVR) forebygge fedme hypoventilation i leptin mangelfuld fedme. Men, et flertal af overvægtige personer har høj plasma leptin niveauer og demonstrere resistens over for de metaboliske og respiratoriske virkninger af hormonet5,6,7,8. Resistens over for Leptin er multifaktoriel, men begrænset permeabilitet af blod-hjerne barrieren (BBB) til Leptin spiller en stor rolle. Vi foreslår, at Leptin virker under BBB i et nøgle organ af perifer hypoxisk følsomhed, carotis organer (CB), for at forsvare vejrtrækning i overvægtige individer. CBs udtrykker den lange funktionelle isoform af Leptin receptor, leprb, men cb's rolle i respiratoriske virkninger af Leptin er ikke tilstrækkeligt belyst9,10.
Målet med vores metode var at undersøge effekten af Leptin signalering i CB på HVR. Vores rationale var at udføre (a) tab af funktions eksperimenter ved infusion af leptin i mus med intakte carotis-kroppe og denerverede carotis-kroppe efterfulgt af HVR-målinger; b) øgning af funktions eksperimenter i DB/DB -mus, der mangler leprb, hvor vi målte HVR ved baseline og efter ekspression af leprb udelukkende i CB. Fordelen ved vores teknikker var, at vi udførte alle vores eksperimenter i uhæmmet ubedøvet mus under søvn og vågenhed. Tidligere investigatorer enten udført deres eksperimenter under anæstesi9 eller ikke måle virkningerne af Leptin under søvn10. Desuden er vores undersøgelse den første til at udnytte en unik gevinst ved funktions tilgang med selektiv LepRb -ekspression i CB beskrevet ovenfor.
I den brede sammenhæng kan vores tilgang generaliseret til andre receptorer udtrykt i CB og deres rolle i hypoxisk følsomhed. Investigatorerne kan indgyde en ligand til en receptor af interesse og måle HVR ved baseline og efter CB denervation. Som en supplerende tilgang kan en receptor af interesse over udtrykkes i CB-og HVR-målinger kan udføres før og efter overekspression ved hjælp af vores teknologi, der er beskrevet i dette manuskript.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøgsprotokoller er blevet godkendt af Udvalget for institutionel dyrepasning og-anvendelse (MO18M211).
1. Leptin infusion
Bemærk: For at undersøge effekten af Leptin på vejrtrækning, vi invant Leptin subkutant i Lean C57BL/6J mus af en osmotisk pumpe til at hæve cirkulerende leptin niveauer til dem observeret i fede mus.
-
Forberedelse af osmotisk pumpe
- Afvejes den tomme pumpe for at kontrollere nettovægten af den indlæste opløsning.
- Tilsæt Leptin (5 mg/mL) til den osmotiske pumpe (1 μL/time i 3 dage). Fyld pumpen med en lille sprøjte (1 mL). Efter påfyldning lukkes pumpen med det medfølgende stumpede 27 gauge påfyldningsslange.
Bemærk: Sprøjten og det vedlagte rør skal være fri for luftbobler. - Efter påfyldning vejes pumpen igen for at kontrollere opløsningens nettovægt.
-
Sæt Leptin pumpen subkutant i det interscapulære område.
Bemærk: hvis du vil starte infusionen med det samme, skal du inkubere den fyldte pumpe i det sterile saltvand ved 37 °c i mindst 4 til 6 timer (helst natten over).
2. hypoxisk Ventilatorisk respons (HVR)
Bemærk: Thermoneutral betingelser eliminere stressende faktorer pålagt af kølige omgivende temperatur og væsentligt ændre stofskiftet i mus. Derfor skal alle respiratoriske målinger udføres ved de termodynamiske forhold (t = 30 °C) ved hjælp af en neonatal inkubator12 (figur 1a). Hele kroppen plethysmografi kammer (WBP) har været anvendt til alle målinger. Alle dyr skal akklieres til det barometriske plethysmografi kammer og til en farce hals krave for efterfølgende puls oximetri optagelse i 3-5 dage før HVR målinger. HVR er registreret mellem 10 AM og 5 PM. HVR er undertrykt under søvn, derfor kan det måles separat under søvn og stille vågenhed13. For at sikre dyrets specifikke søvn vågne stadie under HVR-målingen bør EEG/EMG-elektroder implanteres som en EEG/EMG-hovedbøjle som tidligere beskrevet14. Dyrene skal have ret til at komme sig i mindst 72 h efter headmount. Sleep staging skal udføres i 5 s epochs. NREM Sleep er anerkendt af den langsomme bølge EEG aktivitet besat mere end 50% af epoken. Stille vågenhed er manifesteret af alpha EEG aktivitet i fravær af bevægelser. REM-søvn identificeres ved den dominerende alfa-og Theta-EEG-aktivitet i nærværelse af nedsat muskeltonus på EMG. Typisk observeres REM-søvn ikke under HVR-gasudfordringerne.
- Protokollen om optagelse af HVR
- Brug WBP-kammeret af følgende størrelse: indvendig diameter på 80 mm, højde 50,5 mm og volumen på 0,4 L. WBP-kammeret består af to kamre, forseglede og reference kamre, og en cirkulær platform til at placere musen14 (figur 1B). Tilstrømning og udstrømning inde i kammeret styres af positive og negative tryk kilder, der bevarer det atmosfæriske tryk. Dette kontrolelement skaber en stabil bias flow i kammeret og forhindrer CO2 retention. For flere detaljer om WBP oprettet, se Hernandez og kolleger15.
- Mål temperaturen inde i kammeret og den relative luftfugtighed i rummet, før du placerer musen i WBP.
- Mål kropsvægt og rektal temperatur.
- Sæt pulsoximeter kraven rundt om halsen af musen (området skal være tidligere barberet).
- Placer musen inde i WBP og sørg for, at kammeret er helt forseglet for at undgå luft lækager.
- Vent ca. 30 minutter, indtil musen er stille, og kammeret er i konstant lydstyrke.
- Normoxia: efter 30 min, hvis musen er stille, begynde at optage de respiratoriske signaler og perifer iltmætning (SpO2) på normoxia fase (21% FIO2 ved 1 ATM af tryk) i 20 min, ved hjælp af labchart 7 Pro (version 7,2).
- Hypoksi: efter 20 minutters stille normoxia, begynde at optage den første cyklus af akut hypoksi og SpO2. For hypoxi fase, udsætte dyrene til en konstant blandet gas flow sammensat af 10% O2 og 3% Co2 for 5 min.
- I løbet af de første 30 sekunder af hypoksi strømmer den blandede gas gennem kammeret via 2 små side porte på basen, så FiO2 kan falde fra 21% (ved 1 ATM af tryk) til 10%.
- Efter de første 30 s, lukke en af de små side havne i WBP kammer og holde optagelsen på den konstante hypoksi ved 10% FiO2 for 5 min.
Bemærk: blandingen af 10% O2 og 3% Co2 ved hypoksi anvendes for at opretholde eucapnea11.
- Efter 5 min af hypoksi, udsætte musen til rum luft igen (21% FiO2 ved 1 ATM af tryk) ved at skifte tilkoblings kilde.
- Vent mindst 30 min indtil næste normoxia optagelse for at komme sig efter den tidligere hypoxiske eksponering for at undgå ventilatorisk roll-off fænomen (dvs. central undertrykkelse af vejrtrækning under hypoksi16).
Bemærk: Gentag normoxia/hypoxia cyklusser tre gange i hver mus for at sikre reproducerbarhed af målingerne. I vores erfaring, yderligere (større end 3 gange på en given dag) hypoksiske eksponeringer bør undgås, på grund af ventilatorisk tilpasning (roll-off fænomen). - Ved afslutningen af forsøget, kalibrere WBP kammer (med musen er stadig inde) ved at injicere 1 mL rum luft 3 gange med en sprøjte tilsluttet en af de små side havne i bunden af kammeret.
- Mål temperaturen i kammeret igen med dyret inde i det.
- Åbn kammeret og måle rektal temperaturen af musen, før du placerer den tilbage til sit hjem bur.
- Beregning af HVR
- Digitaliser alle signaler til HVR-beregning ved 1.000 Hz (samplingfrekvens pr. kanal).
Bemærk: WBP Tidal Volume analyse udføres i Lab chart 7 baseret på Drorbaugh og Fenn ligning17. De påkrævede variabler omfatter musens rektal temperatur og kammertemperaturen (før og efter HVR-måling), relativ luftfugtighed og kammer gaskonstanten. Denne konstant er resulterende fra WBP tryk afbøjning efter 1 mL indsprøjtninger af luft i kalibreringsfasen. For flere detaljer, se Hernandez og kolleger15. - Efter beregning af Drorbaugh og Fenn ligning, multiplicere tidevands volumen (VT) kammer kanal ved konstanten.
-
Udvælgelse af optagelser til analysen
- Normoxia: Vælg kun sektioner af konstant vejrtrækning med konstant tidevands volumen. Undgå sektioner i nærheden af musens bevægelser.
- Hypoksi: kasseres første 30 s når O2 niveauer er faldende fra 21% til 10%, skal du vælge sektioner fra 30 s til 2 min af 10% O2 eksponering (a 90 s interval). Inden for dette interval, skal du vælge kun sektioner med konstant vejrtrækning med konstant tidevands volumen. Undgå sektioner i nærheden af musens bevægelser. Analysen er pålidelig, hvis mindst 10 s af hypoksi er valgt i hver cyklus.
Bemærk: Den perifere bestanddel af chemoreflex, som er reguleret af CB, dominerer i løbet af den første 1-2 min eksponering16,18,19. I anden fase, mellem 2 min og 5 min af hypoksiske eksponering, både perifer og central komponent spiller en rolle. Endelig er den tredje fase, > 5 min, karakteriseret ved hypoventilation (roll-off fænomen) styres overvejende af centrale chemoreceptors. Vores erfaring viser, at mus er ofte vågen under hypoksiske Exposition på grund af de manuelle afbrydere i luftstrømmen kilde.
- Efter udvælgelsen beregnes middelminut ventilationen (Ve) ved normoxiske og hypoxiske forhold ved hjælp af formlen Ve = respirationshastighed X tidevands volumen.
- Beregn den gennemsnitlige SpO2 ved normoxia og hypoksi betingelser.
- HVR beregnes manuelt ved hjælp af formlen HVR = (Ve (10% o2)-Ve (21% o2))/(SPO2 (10% o2) – SPO2 (21% o2)).
Bemærk: I C57BL/6J-mus kan den osmotiske pumpe til leptininfusion forringe den nøjagtige SpO2 -signaldetektering ved halskraven. I dette tilfælde beregnes HVR på grundlag af FiO2 -værdierne ved normoxic og hypoxiske tilstande som HVR = ΔvE /δfio211.
- Digitaliser alle signaler til HVR-beregning ved 1.000 Hz (samplingfrekvens pr. kanal).
3. carotis krop Denervation eller Carotid sinus nerve dissektion (CSND)
Bemærk: Vi udførte kombinerede kirurgiske og kemiske denervering en uge fra hinanden, fordi kirurgisk denervering alene ikke afskaffe hypoksiske chemoreflex.
-
Kirurgisk forberedelse
- Udfør alle procedurer på voksne mandlige C57BL/6J mus. Steriliser alle kirurgiske instrumenter. Brug sterile kirurgiske handsker, sprøjter og bomuld tippet applikatorer.
- Anesthetize mandlige C57BL/6j mus med 1-2% isofluran ved hjælp af en næse kegle og placere et varmt tæppe for at forhindre hypotermi. Isofluran titreres omhyggeligt for at opretholde respirationshastigheden ved 1 Hz (60 vejrtrækninger/min). Tilstrækkeligheden af anæstesi før start kirurgi vil blive vurderet af åndedræts frekvensen, fravær af bevægelser og hørbare lyde, fraværet af respons på taktile stimuli og forbimb eller bagben pedal tilbagetræknings refleks.
- Administration af buprenorphin (0,05 mg/kg) intraperitonealt for at forebygge smerte ubehag. Fjern håret i ventrale region af halsen og Desinficer området med betadin og alkohol.
- For at undgå cornea-udtørring skal du smøre musene med steril oftalmisk salve under anæstesi.
-
CSND-procedurer
Etape 1: kirurgisk denervering- Efter midterlinje Incision, udsætte bifurcation af de almindelige carotis arterier ved at fjerne bindevæv og fedtvæv.
- Identificer hypogloalnerven, som normalt er meget fremtrædende, og løft den derefter op for at afsløre den gloopharyngeale nerve umiddelbart nedenunder. Dissekere carotis sinus nerver bilateralt ved hjælp af mikro fjeder saks.
- Luk snittet med 6-0 silke sutur.
- Injicer 1 mL normal saltvandsopløsning subkutant for at forhindre dehydrering.
- Hus musene i et opsving kammer og overvåge deres opførsel hver 15 min for indledende 1 h, indtil musene genvinde bevidstheden om at opretholde brystbenet recumbency. Returnere musene til deres hjem bure, efter at de er fuldt tilbagebetalt. Hold overvågningen af musene to gange om dagen i de næste 3 dage. Giv yderligere buprenorphin, hvis mus viser tegn på smerte (f. eks. nedsat appetit, rastløshed).
Etape 2: kemisk denervering - En uge efter operationen, male halspulsåren med en opløsning af 2% phenol fortyndet i ethanol på de punkter af forgrening fra gloopharyngeal nerve til kranial pol af CB. Den samme postoperative pleje skal gives efter den kemiske denervering som beskrevet ovenfor i afsnittet om kirurgisk denervering.
Bemærk: for en fingeret kirurgi gruppe, de samme procedurer udføres undtagen carotis sinus nerve dissektion. - Lad dyrene komme sig i 5-7 dage før HVR målinger.
4. ekspression af LepRb i CB ved hjælp af en adenovirale vektor (ad-leprb) vs kontrol (ad-LacZ)
-
Ad-LepRb og ad-LacZ suspension
- Transfect musene med adenovirus (ad-LepRb-gfp, 2-5X1010 PFU/ml for overekspression, ad-LacZ, 1 x 1010 PFU/ml til kontrol) til CB-området.
- Tø Matrigel-matrixen op ved at nedsænke hætteglasset i is i et 4 °C-køleskab natten over.
- Forsigtigt suspendere adenovirus i flydende Matrigel matrix ved 1:5 (1 μL Matrigel matrix og 4 μL adenovirus anvendt bilateralt).
- Opbevar altid viral suspension på is, indtil den påføres i CB.
-
Kirurgisk forberedelse
- Brug de samme kirurgiske instrumenter som CSND-protokollen.
- Anesthetize leprb-mangelfuld DB/DB mus med 2-2.5% isofluran ved hjælp af en næse kegle og placere dyrene på et varmt tæppe for at forhindre hypotermi. Isofluran titreres omhyggeligt for at opretholde respirationshastigheden ved 1 Hz (60 vejrtrækninger/min). Tilstrækkeligheden af anæstesi vil blive vurderet af åndedræts frekvensen, fravær af bevægelser og hørbare lyde, fraværet af respons på taktile stimuli og forbimb eller bagben pedal tilbagetræknings refleks.
- Administration af buprenorphin (0,05 mg/kg) intraperitonealt.
- Fjern håret i ventrale-området af halsen og Desinficer området med betadin og alkohol som i CSND-protokollen.
- For at undgå cornea-udtørring skal du smøre musene med steril oftalmisk salve under anæstesi.
-
Adenovirus behandling af CB
- Eksponere CBs som beskrevet i CSND-protokollen og anvende 5 μL af den virale suspension til CB-området bilateralt.
- Vent 2-3 min, indtil den flydende Matrigel matrix bliver en gel. Efter at have bekræftet, at den virale suspension var kongealed, lukke snittet med 6,0 silke sutur.
-
Efter operationen
- Hus musene i et opsving kammer og overvåge deres opførsel hver 15 min for indledende 1 h, indtil musene genvinde bevidstheden om at opretholde brystbenet recumbency. Returnere musene til deres hjem bure, efter at de er fuldt tilbagebetalt. Hold overvågningen af musene to gange om dagen i de næste 3 dage. Giv yderligere buprenorphin, hvis mus viser tegn på smerte (f. eks. nedsat appetit, rastløshed).
- Buprenorphin (0,05 mg/kg) intraperitonealt administreres efter behov for at forebygge smerte ubehag i den postoperative periode.
- Mål HVR 9 dage efter adenovirus transfection.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kontinuerlig infusion af Leptin øgede HVR signifikant i Lean C57BL/6J-mus fra 0,23 til 0,31 mL/min/g/ΔFiO2 (P < 0,001, figur 2)11. CSND afskaffede den leptininducerede stigning i HVR (figur 2), mens der ikke blev observeret nogen formildende virkninger af CSND på HVR i Sham Surgery-gruppen efter leptininfusion.
LepRb -ekspression i CB af leprb-mangelfuld overvægtige DB/DB -mus inducerede en signifikant stigning i HVR fra 0,05 til 0,06 ml/min/g/δspo2 (figur 3). Hos dyr, som blev transficeret med kontrol ad-LacZ i CB, ændrede HVR ikke.
Figur 1: målinger af HVR. Forsøgene bør udføres ved termodynamik ved anvendelse afa) en neonatal inkubator ved 30 °c og registreres i et (B) helkrops plethysmografi kammer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Leptin forstørrede hypoksiske ventilatorisk respons (HVR) og virkningerne blev afskaffet ved carotis sinus nerve dissektion (csnd) i C57BL/6j mus. Dette tal er blevet modificeret fra Caballero-Eraso et al.11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: leprb -ekspression i carotis-organerne (CB) af leprb-mangelfulde DB/DB -mus forøgede hypoksiske ventilatorisk respons (HVR). Dette tal er blevet modificeret fra Caballero-Eraso et al.11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hovedfokus i vores undersøgelse var at undersøge respiratoriske virkninger af Leptin signalering i CB. Flere protokoller er blevet udviklet til at vurdere rollen af leptin i en mekanisk måde. For det første blev det specifikke bidrag fra CB til HVR analyseret ved omhyggelig kvantificering af HVR i løbet af de første 2 min. af hypoxisk eksponering. For det andet blev relevansen af CB i leptin-medieret op-regulering af kontrol med vejrtrækning undersøgt ved to komplementære tilgange. Hos lean Wild-type mus med lave leptinniveauer blev HVR målt ved baseline og efter kontinuerlig infusion af Leptin; forsøget blev gentaget efter CB denervation. I Leprb-mangelfulde DB/DB -mus blev HVR målt ved baseline og efter leprb -ekspression i CB.
Flere protokoller er blevet brugt til at måle HVR i gnavere, udsætter dyrene for hypoksiske gasser. Vi har udviklet en HVR protokol til at undersøge rollen som CB i den perifere kemoterapi og virkningerne af leptin i CB på kontrol af vejrtrækning. CB chemoreflex har et relativt kort tids domæne. Den første 1-2 min hypoksi er karakteriseret ved en akut augmentation af ventilatorisk respons efterfulgt af en langsom tilbagevenden til baseline ventilation efter 2 min af carotis sinus nerve stimulation16,18,19. I vores HVR-protokol gennemføres analyserne således inden for et interval på 90 s mellem de første 30 s af hypoksi og 2 min af 10% O2 eksponering, svarende til dominans af perifer kemoterapi reguleret af CB. Denne kort tidsanalyse undgår hypoksiske ventilatorisk depression i dyrene. I vores HVR-protokol brugte vi også en fast 3% CO2 -spænding i hypoksi for at omgå hypocapnia induceret af hyperventilation under akut hypoxisk eksponering11. Endelig har vi udviklet HVR-protokollen under konstante termodynamik forhold og holdt musene ved en temperatur på omkring 30 °C. Vores erfaring viser, at korte eksponeringer mod hypoksi kan nedsætte rektal temperatur i mus, hvis eksponeringen sker ved stuetemperatur11, mens hypoksi ved thermoneutrality ikke inducerer signifikante metaboliske ændringer12.
CSND i mus er teknisk udfordrende, på grund af den lille størrelse af dyrene og deres CBs. Vi har udviklet en konsekvent vellykket tilgang med næsten 100% overlevelsesrate ved streng overholdelse af vores protokol. Kontrollerede forhold i vores protokol omfatter neutrale miljø, omhyggeligt kontrolleret anæstesi og standard sterile mikrokirurgiske teknikker med visualisering af gloopharyngeal nerve som årvågen postoperativ ledelse med smerter Kontrol. Vores erfaring viser, at kirurgisk denervering alene ikke afskaffe hypoksiske chemoreflex. Det andet skridt, kemisk denervation, er også efterfulgt af omhyggelig post-operative forvaltning for at forbedre overlevelsen.
Vores mest innovative teknik er selektiv gen over-ekspression i CB-området. Denne fremgangsmåde er ikke tidligere blevet gennemført på grund af certificeringsorganernes ringe størrelse og manglen på specifikke chauffører, der gør det muligt at udtrykke et gen af interesse i en bestemt celletype. Faktisk, type I CB celler er meget lig sympatiske neuroner eller celler i binyre medulla, mens type II celler ligner astrocytter20,21. Vi udnyttede DB/DB mus, som mangler leprb genet, vores evne til at anvende adenovirale suspension næsten udelukkende til CB område, og egenskaber af matrigel matrix, som hurtigt størkner ved 37 °c. Vores nye tilgang kan bruges i fremtiden til at studere en rolle af ethvert gen udtrykt i CB ved hjælp af mus med hele kroppen tyrosin hydroxylase specifikke (type I celler) eller GFAP specifikke (type II celler) knockouts.
Vores protokoller har flere begrænsninger. For det første brugte vi 3% CO2 til at bestemme HVR, og spørgsmålet forbliver åbent, hvis fraktionen af HVR faktisk kan tilskrives hypercapnic respons. For at imødegå denne begrænsning, kan investigatorerne samtidig måle responser til 3% CO2 afbalanceret i hyperoxic gas, som ville slå CB off. For det andet kan HVR ikke elimineres fuldstændigt af CSND22. Dette fænomen kan tilskrives neuroplasticitet, som er særligt fremtrædende i mus. Derfor er det vigtigt at studere HVR så hurtigt som muligt efter CSND og altid bruge Sham kirurgi kontrol. For det tredje manglede vores tilgang til CB-genekspression celletype og organspecificitet. Molekylære teknikker med fremtidig brug af mere selektive initiativtagere kan bidrage til at imødegå denne begrænsning.
Afslutningsvis, trods beskrevet ovenfor begrænsninger, vores protokoller i kombination gør det muligt at studere den rolle, specifikke CB gener i fysiologiske reaktioner på hypoksi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen modstridende interesser eller afsløringer.
Acknowledgments
R01HL138932, RO1HL133100, RO1HL128970, AHACDA34700025
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Insulin Syringes | BD Biosciences | 309311 | |
| 1x PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | 500 ml |
| Ad-Lacz | Dr. Christopher Rhodes (University of Chicago) | 1 x 1010 pfu/mL | |
| Ad-LepRb-GFP | Vector Biolabs | ADV-263380 | 2-5 x 1010 pfu/mL |
| Anesthetic cart | Atlantic Biomedical | ||
| Betadine | Purdue Products Ltd. | 12496-0757-5 | |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | 0.3 mg/mL |
| C57Bl/6J | Jackson laboratory | 000664 | Mice Strain |
| Cotton Gauze Sponges | Fisherbrand | 22-362-178 | |
| db/db | Jackson laboratory | 000697 | Mice Strain |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Isoflurane | Vetone | 502017 | |
| Lab Chart | Data Science International (DSI) | Software | |
| Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
| Micro Spring Scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14124 | |
| Mouse Ox Plus | STARR Life Sciences Corp. | Software | |
| Mouse Ox Plus Collar Sensor | STARR Life Sciences Corp. | 015022-2 | Medium Collar Clip Special 7” |
| Mouse Whole Body Plethysmography Chamber | Data Science International (DSI) | PLY3211 | |
| Ohio Care Plus Incubator | Ohmeda | HCHD000173 | |
| Operating Scissors | World Precision Instruments (WPI) | 501753-G | Straight |
| Osmotic Pump | Alzet | 1003D | 1 μL/h, 3 days |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P4557 | |
| Recombinant Mouse Leptin protein | R&D systems | 498-OB-05M | 5 mg |
| Saline | RICCA Chemical | 7210-16 | 0.9% Sodium Chloride |
| Sterile Surgical Suture | DemeTech | DT-639-1 | Silk, size 6-0 |
| Thermometer | Innovative Calibration Solutions (INNOCAL) | EW 20250-91 |
References
- O'donnell, C. P., et al. Leptin prevents respiratory depression in obesity. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159, 1477-1484 (1999).
- Polotsky, V. Y., et al. Female gender exacerbates respiratory depression in leptin-deficient obesity. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164, 1470-1475 (2001).
- Bassi, M., et al. Central leptin replacement enhances chemorespiratory responses in leptin-deficient mice independent of changes in body weight. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 145-153 (2012).
- Inyushkina, E. M., Merkulova, N. A., Inyushkin, A. N. Mechanisms of the respiratory activity of leptin at the level of the solitary tract nucleus. Neuroscience and Behavioral Physiology. 40, 707-713 (2010).
- Considine, R. V., et al. Serum immunoreactive-leptin concentrations in normal-weight and obese humans. New England Journal of Medicine. 334, 292-295 (1996).
- Maffei, M., et al. Leptin levels in human and rodent: measurement of plasma leptin and ob RNA in obese and weight-reduced subjects. Nature Medicine. 1, 1155-1161 (1995).
- Phipps, P. R., Starritt, E., Caterson, I., Grunstein, R. R. Association of serum leptin with hypoventilation in human obesity. Thorax. 57, 75-76 (2002).
- Berger, S., Polotsky, V. Y. Leptin and Leptin Resistance in the Pathogenesis of Obstructive Sleep Apnea: A Possible Link to Oxidative Stress and Cardiovascular Complications. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 5137947 (2018).
- Ribeiro, M. J., et al. High fat diet blunts the effects of leptin on ventilation and on carotid body activity. The Journal of Physiology. 96, 3187-3199 (2018).
- Yuan, F., et al. Leptin signaling in the carotid body regulates a hypoxic ventilatory response through altering TASK channel expression. Frontiers in Physiology. 9, 249 (2018).
- Caballero-Eraso, C., et al. Leptin acts in the carotid bodies to increase minute ventilation during wakefulness and sleep and augment the hypoxic ventilatory response. The Journal of Physiology. 591, 151-172 (2018).
- Jun, J. C., Shin, M. K., Yao, Q., Devera, R., Fonti-Bevans, S., Polotsky, V. Y. Thermoneutrality modifies the impact of hypoxia on lipid metabolism. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 304, 424-435 (2012).
- Polotsky, V. Y., et al. Impact of interrupted leptin pathways on ventilatory control. Journal of Applied Physiology. 96, 991-998 (2004).
- Pho, H., et al. The effect of leptin replacement on sleep-disordered breathing in the leptin-deficient ob/ob mouse. Journal of Applied Physiology. 120, 78-86 (2016).
- Hernandez, A. B., et al. Novel whole body plethysmography system for the continuous characterization of sleep and breathing in a mouse. Journal of Applied Physiology. 112, 671-680 (2012).
- Powell, F. L., Milsom, W. K., Mitchell, G. S. Time domains of the hypoxic ventilatory response. Respiration Physiology. 112, 123-134 (1998).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16, 81-87 (1955).
- Duffin, J. Measuring the ventilatory response to hypoxia. The Journal of Physiology. 587, 285-293 (2007).
- Teppema, L. J., Dahan, A. The Ventilatory Response to Hypoxia in Mammals: Mechanisms, Measurement, and Analysis. Physiological Reviews. 90, 675-754 (2010).
- Nurse, C. A., Fearon, I. M. Carotid body chemoreceptors in dissociated cell culture. Microscopy Research and Technique. 59, 249-255 (2002).
- Kumar, P., Prabhakar, N. R. Peripheral chemoreceptors: function and plasticity of the carotid body. Comprehensive Physiology. 2, 141-219 (2012).
- Roux, J. C., Peyronnet, J., Pascual, O., Dalmaz, Y., Pequignot, J. M. Ventilatory and central neurochemical reorganisation of O2 chemoreflex after carotid sinus nerve transection in rat. The Journal of Physiology. 522, 493-501 (2000).
