Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

النهج التجريبي لفحص الإشارات الليبتين في الأجسام السباتية وأثارها علي التحكم في التنفس

Published: October 25, 2019 doi: 10.3791/60298
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Medicine, Johns Hopkins University, 2Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Respiratorias (CIBERES), Hospital Universitario Virgen del Rocío/Universidad de Sevilla

Summary

تركز دراستنا علي اثار الليبتين في الجسم السباتي (CB) علي استجابه تنفس نقص الأكسجين (HVR). قمنا بتنفيذ تجارب "فقدان الوظيفة" قياس تاثير الليبتين علي hvr بعد تعصيب CB و ' كسب وظيفة ' التجارب قياس hvr بعد التعبير المفرط من مستقبلات الليبتين في CB.

Abstract

هرمون ليبتين المنتجة الخلايا الشحمية هو منبه الجهاز التنفسي قويه ، والتي قد تلعب دورا هاما في الدفاع عن وظيفة الجهاز التنفسي في السمنة. الأجسام السباتية (CB) ، وهو الجهاز الرئيسي للحساسية الطرفية نقص الأكسجين ، والتعبير عن ايزوفورم وظيفية طويلة من مستقبلات الليبتين (LepRb) ولكن لم يتم توضيح دور الإشارات الليبتين في السيطرة علي التنفس تماما. درسنا استجابه تنفس نقص الأكسجين (HVR) (1) في الفئران C57BL/6J قبل وبعد ضخ ليبتين في خط الأساس وبعد denervation CB; (2) في leprb-نقص السمنة db/db الفئران في خط الأساس وبعد التعبير الفوقي leprb في CBs. في C57BL/6J الفئران ، وزيادة الليبتين HVR وأثار ليبتين علي HVR تم إلغاؤها بواسطة denervation CB. في db/db الفئران ، التعبير leprb في CB المضافة hvr. ولذلك ، نستنتج ان ليبتين يعمل في CB لزيادة الاستجابات لنقص الأكسجين.

Introduction

أنتجت الخلايا الشحمية هرمون ليبتين يعمل في المهاد لقمع تناول الطعام وزيادة معدل الأيض. وأظهرت الدراسات التي أجريت في مختبرنا1,2 والمحققين الآخرين 3,4 ان ليبتين يزيد من استجابه hypercapnic تنفس (hvr) منع السمنة نقص التهوية في ليبتين نقص السمنة. ومع ذلك, غالبيه الافراد يعانون من السمنة المفرطة لديهم مستويات عاليه من الليبتين البلازما وتظهر مقاومه للآثار الايضيه والتنفسية للهرمون5,6,7,8. مقاومه ليبتين هو متعدد العوامل ، ولكن نفاذيه محدوده من حاجز الدم في الدماغ (BBB) إلى ليبتين يلعب دورا رئيسيا. نقترح ان يعمل الليبتين أدناه BBB في جهاز رئيسي من حساسية نقص الأكسجين المحيطي, الأجسام السباتية (CB), للدفاع عن التنفس في الافراد البدناء. CBs التعبير عن ايزوفورم وظيفية طويلة من مستقبلات ليبتين ، leprب، ولكن دور CB في الآثار التنفسية من ليبتين لم يتم توضيح بما فيه الكفاية9،10.

وكان الهدف من طريقتنا لدراسة تاثير الإشارات ليبتين في CB علي HVR. وكان لدينا الأساس المنطقي لأداء (ا) فقدان الاختبارات الدالة باستخدام الليبتين في الفئران مع الأجسام السباتية السليمة والأجسام السباتية التي تتبعها قياسات HVR. (ب) كسب التجارب الوظيفية في الفئران db/db التي تفتقر leprb، والتي قمنا بقياس hvr في خط الأساس وبعد التعبير عن leprb حصرا في CB. وكان الاستفادة من تقنياتنا ان أجرينا جميع التجارب لدينا في الفئران غير المقيدة غير التخدير اثناء النوم واليقظة. اجري المحققون السابقون تجاربهم تحت التخدير9 أو لم يقيسوا اثار الليبتين اثناء النوم10. الاضافه إلى ذلك ، دراستنا هي الاولي التي تستخدم مكسبا فريدا من نهج وظيفة مع التعبير LepRb انتقائية في CB الموصوفة أعلاه.

في السياق العام ، يمكن تعميم نهجنا علي المستقبلات الأخرى المعرب عنها في CB ودورها في حساسية نقص الأكسجين. يمكن للمحققين ضخ الاربطه إلى مستقبلات الاهتمام وقياس HVR في خط الأساس وبعد denervation CB. وكنهج مكمل ، يمكن المبالغة في التعبير عن مستقبلات الفائدة في قياسات CB و HVR التي يمكن اجراؤها قبل وبعد الإفراط في استخدام التكنولوجيا الموصوفة في هذه المخطوطة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الماشية (MO18M211) علي جميع البروتوكولات التجريبية.

1. ليبتين ضخ

ملاحظه: من أجل فحص تاثير الليبتين علي التنفس ، ونحن غرست جلد ليبتين في الفئران C57BL/6j العجاف بواسطة مضخة الاسموزي لرفع مستويات الليبتين المتداولة لتلك التي لوحظت في الفئران البدناء.

  1. اعداد مضخة اوسموتيك
    1. تزن المضخة الفارغة للتحقق من الوزن الصافي للحل الذي تم تحميله.
    2. أضافه ليبتين (5 ملغ/مل) إلى مضخة اوسموتيك (1 μL/h لمده 3 أيام). أملا المضخة بحقنه صغيره (1 مل). بعد ملء ، إغلاق المضخة مع المقدمة حاده يميل 27 مقياس أنبوب ملء.
      ملاحظه: يجب ان تكون الحقنه والأنبوب المرفق خاليه من فقاعات الهواء.
    3. بعد التعبئة ، تزن المضخة مره أخرى للتحقق من الوزن الصافي للحل.
    4. ادخل جلد مضخة الليبتين في المنطقة البينية الكتف.
      ملاحظه:       إذا كنت ترغب في بدء ضخ فورا ، احتضان مضخة مملوءة مسبقا في المحلول الملحي المعقم في 37 درجه مئوية لمده لا تقل عن 4 إلى 6 ساعة (ويفضل بين عشيه وضحيها).

2. الاستجابة التنفسه لنقص الأكسجين (HVR)

ملاحظه: ظروف thermoneutral القضاء علي العوامل المجهدة التي تفرضها درجه الحرارة المحيطة بارد وتعديل كبير في التمثيل الغذائي في الفئران. ولذلك ، ينبغي اجراء جميع قياسات الجهاز التنفسي في ظروف معتدل (t = 30 درجه مئوية) باستخدام حاضنه الوليد12 (الشكل 1ا). وقد استخدمت غرفه سونار الجسم كله (WBP) لجميع القياسات. يجب ان تتاقلم جميع الكائنات إلى غرفه السونار البارومتري والي طوق الرقبة الزائفة للتسجيل اللاحق لمقياس التاكسج لمده 3-5 يوما قبل القياسات HVR. يتم تسجيل HVR بين 10 صباحا و 5 مساءا. يتم منع HVR اثناء النوم ، التالي يمكن قياسه بشكل منفصل اثناء النوم واليقظة الهادئة13. لضمان مرحله النوم والاستيقاظ المحددة من الحيوانية خلال قياس HVR ، يجب ان تزرع أقطاب تخطيط الدماغ/الفريق البيئي كراس الدماغ/فريق التخطيط البيئي كما هو موضح سابقا14. يجب السماح للحيوانات بالتعافي لمده لا تقل عن 72 ساعة بعد راس الجبل. وينبغي ان يتم التدريج النوم في العهود 5 ق. يتم التعرف علي النوم NREM من قبل نشاط الدماغ موجه بطيئه تحتل أكبر من 50 ٪ من الحقبة. يتجلى اليقظة الهادئة من خلال نشاط التخطيط الدماغي الفا في غياب الحركات. يتم تحديد النوم REM من قبل النشاط المهيمن الفا والتخطيط الدماغي ثيتا في وجود انخفاض لهجة العضلات علي فريق العمل البيئي. عاده ، لا يتم ملاحظه النوم REM اثناء التحديات الغاز HVR.

  1. بروتوكول تسجيل HVR
    1. استخدام غرفه WBP من الحجم التالي: القطر الداخلي من 80 مم ، ارتفاع 50.5 ملم ، وحجم 0.4 لتر. تتكون غرفه WBP من غرفتين ، مختومه وغرف مرجعيه ، ومنصة دائريه لوضع الماوس14 (الشكل 1ب). يتم التحكم في تدفق وتدفق داخل الغرفة من قبل مصادر الضغط الايجابيه والسلبية الحفاظ علي الضغط الجوي. هذا التحكم يخلق تدفق التحيز ثابت في الغرفة ويمنع الاحتفاظ CO2 . لمزيد من التفاصيل حول اعداد WBP ، راجع هيرنانديز وزملاءه15.
    2. قياس درجه الحرارة داخل الغرفة والرطوبة النسبية في القاعة قبل وضع الماوس في WBP.
    3. قياس وزن الجسم ودرجه حرارة المستقيم.
    4. وضع طوق مقياس التاكسج حول عنق الماوس (يجب ان تكون المنطقة حلق سابقا).
    5. وضع الماوس داخل WBP والتاكد من ان الغرفة مختومه تماما من أجل تجنب تسرب الهواء.
    6. الانتظار لمده 30 دقيقه تقريبا حتى الماوس هادئه والغرفة في حجم ثابت.
    7. Normoxia: بعد 30 دقيقه ، إذا كان الماوس هادئا ، بدء تسجيل الإشارات التنفسية وتشبع الأكسجين المحيطي (التخطيط الاستراتيجي2) في مرحله normoxia (21 ٪ fio2 في 1 atm من الضغط) لمده 20 دقيقه ، وذلك باستخدام labchart 7 برو (الإصدار 7.2).
    8. نقص الأكسجين: بعد 20 دقيقه من normoxia هادئه ، بدء تسجيل الدورة الاولي من نقص الأكسجين الحاد والاستراتيجي2. لمرحله نقص الأكسجين ، وفضح الكائنات إلى تدفق الغاز مختلطة ثابته تتالف من 10 ٪ O2 و 3 ٪ CO2 لمده 5 دقائق.
      1. خلال أول 30 ثانيه من نقص الأكسجين ، يتدفق الغاز المختلط من خلال الغرفة عن طريق 2 الموانئ الجانبية الصغيرة في قاعده السماح لل FiO2 لإسقاط من 21 ٪ (في 1 atm من الضغط) إلى 10 ٪.
      2. بعد 30 ثانيه الاولي ، إغلاق واحده من الموانئ الجانبية الصغيرة للغرفة WBP والحفاظ علي تسجيل في نقص الأكسجين المستمر في 10 ٪ FiO2 لمده 5 دقائق.
        ملاحظه: يتم استخدام خليط من 10 ٪ O2 و 3 ٪ CO2 في نقص الأكسجين من أجل الحفاظ علي انقطاع التنفس الاقليي11.
    9. بعد 5 دقيقه من نقص الأكسجين ، وفضح الماوس إلى غرفه الهواء مره أخرى (21 ٪ FiO2 في 1 atm من الضغط) عن طريق تحويل مصدر التدفق الوافد.
    10. الانتظار لمده 30 دقيقه علي الأقل حتى تسجيل normoxia المقبل من أجل التعافي من التعرض السابق نقص الأكسجين لتجنب ظاهره تنفس اللفة (اي ، قمع المركزية للتنفس اثناء عدم الأكسجين16).
      ملاحظه: تكرار نورموسيا/نقص الأكسجين دورات ثلاث مرات في كل الماوس لضمان استنساخ من القياسات. في تجربتنا, اضافيه (أكثر من 3 مرات في يوم معين) وينبغي تجنب التعرض لنقص الأكسجين, بسبب التكيف تنفس (ظاهره الانطلاق).
    11. في نهاية التجربة ، معايره غرفه WBP (مع الماوس لا يزال داخل) عن طريق حقن 1 مل من الهواء الغرفة 3 مرات مع حقنه موصوله في واحده من الموانئ الجانبية الصغيرة في قاعده الغرفة.
    12. قياس درجه الحرارة في الغرفة مره أخرى مع الحيوانية داخلها.
    13. فتح الغرفة وقياس درجه حرارة المستقيم من الماوس قبل وضعه مره أخرى إلى قفصه الرئيسي.
  2. حساب HVR
    1. رقمنه جميع الإشارات لحساب HVR في 1,000 هرتز (تردد أخذ العينات لكل قناه).
      ملاحظه: يتم اجراء تحليل حجم المد والجزر WBP في المخطط المعملي 7 استنادا إلى المعادلتين دروربوغ و Fenn17. المتغيرات المطلوبة تشمل درجه حرارة المستقيم الماوس ودرجه حرارة الغرفة (قبل وبعد قياس HVR) ، والرطوبة النسبية ، والغاز الغرفة ثابت. وينتج هذا الثابت من انحراف ضغط WBP بعد حقن 1 مل من الهواء في مرحله المعايرة. لمزيد من التفاصيل ، انظر هيرنانديز وزملاءه15.
    2. بعد حساب المعادلة درورباوغ و Fenn ، مضاعفه حجم المد والجزر (Vt) غرفه القناة بالثابت.
    3. اختيار التسجيلات للتحليل
      1. Normoxia: حدد فقط مقاطع من التنفس الثابت مع حجم المد والجزر المستمر. تجنب الأقسام علي مقربه من حركات الماوس.
      2. نقص الأكسجين: تجاهل أول 30 ثانيه عندما تنخفض مستويات O2 من 21 ٪ إلى 10 ٪ ، حدد المقاطع من 30 ثانيه إلى 2 دقيقه من 10 ٪ O2 التعرض (a 90 s الفاصل الزمني). ضمن هذه الفترة ، حدد المقاطع فقط مع التنفس الثابت مع حجم المد والجزر المستمر. تجنب الأقسام علي مقربه من حركات الماوس. ويمكن الاعتماد علي التحليل إذا تم اختيار ما لا يقل عن 10 ليالي من نقص الأكسجين في كل دوره.
        ملاحظه: المكون الطرفي لل chemoreflex يحكمها CB تسود خلال الدقيقة 1-2 الاولي من التعرض16,18,19. خلال المرحلة الثانية ، بين 2 دقيقه و 5 دقيقه من التعرض لنقص الأكسجين ، كل من المكونات الطرفية والمركزية تلعب دورا. أخيرا, ميزت الطور ثالثه, > 5 [مين], بنقص تهويه (ال [رول-وب] ظاهر) يحكم غالبا ب [كسومنتورس] مركزيه. تبين تجربتنا ان الفئران غالبا ما تكون مستيقظة اثناء معرض نقص الأكسجين بسبب المفاتيح اليدوية في مصدر تدفق الهواء.
    4. بعد التحديد ، احسب متوسط التهوية دقيقه (Ve) في نورموكسيك وظروف نقص الأكسجين باستخدام الصيغة ve = معدل التنفس X حجم المد والجزر.
    5. احسب متوسط2 في حاله نقص الأكسجين.
    6. حساب HVR يدويا باستخدام صيغه HVR = (Ve (10 ٪ س2)-ve (21 ٪ o2))/(الاستراتيجي2 (10 ٪ س2)-الاستراتيجي2 (21 ٪ س2)).
      ملاحظه: في C57BL/6j الفئران ، ومضخة الاسموزي للحقن ليبتين قد يضعف الكشف عن الإشارات المكتبية دقيقه2 بواسطة طوق الرقبة. في هذه الحالة ، يتم احتساب HVR استنادا إلى القيم FiO2 في نورموكسيك وشروط نقص الأكسجين كما hvr = ΔVE /δfio211.

3. تشريح العصب السباتي للجسم أو الشريان السباتي (CSND)

ملاحظه: أجرينا الجمع بين الجراحية والكيميائية تعصيب أسبوع واحد وبصرف النظر ، لان الجراحة الجراحية وحدها لا تلغي نقص الأكسجين الكيماوي.

  1. التحضير الجراحي
    1. تنفيذ جميع الإجراءات علي الذكور البالغين C57BL/6J الفئران. تعقيم جميع الاداات الجراحية. استخدام قفازات جراحيه معقمه ، والمحاقن والقطن يميل تطبيقها.
    2. تخدير الذكور C57BL/6J الفئران مع 1-2 ٪ ايزوفلوراني باستخدام مخروط الأنف ووضع بطانية دافئه لمنع انخفاض حرارة الجسم. يتم معايره ايزوفلواني بعناية للحفاظ علي معدل التنفس عند 1 هرتز (60 الأنفاس/دقيقه). سيتم تقييم مدي كفاية التخدير قبل بدء العمليات الجراحية من خلال تردد التنفس ، وغياب الحركات والضوضاء المسموعة ، وغياب الاستجابة لمحفزات اللمس ومنعكس السحب الامامي أو المؤخر للأطراف الاماميه.
    3. أداره Buprenorphine (0.05 مغ/كغ) داخل الصفاق لمنع عدم الراحة الم. أزاله الشعر في المنطقة البطنية من الرقبة وتطهير المنطقة مع بيتادين والكحول.
    4. لمنع جفاف القرنية ، تليين عيني الفئران بمرهم معقم للعين اثناء التخدير.
  2. إجراءات CSND
    المرحلة الاولي: الجراحة الجراحية
    1. بعد شق الخط النصفي ، فضح تشعب الشرايين السباتية المشتركة عن طريق أزاله الانسجه الضامة والانسجه الدهنية.
    2. التعرف علي العصب تحت اللسان ، والذي عاده ما يكون بارزا جدا ، ومن ثم رفعه للكشف عن العصب الحلقي المغمور مباشره في الأسفل. تشريح أعصاب الجيوب السباتية بشكل ثنائي باستخدام مقص الربيع الصغير.
    3. إغلاق الشق مع خياطه الحرير 6-0.
    4. أداره 1 مل من جلد الملحية العادية لمنع الجفاف.
    5. منزل الفئران في غرفه الانتعاش ومراقبه سلوكهم كل 15 دقيقه لأول 1 ح حتى الفئران استعاده الوعي للحفاظ علي الركود القصيه. أعاده الفئران إلى اقفاصهم المنزلية بعد ان يتم استردادها بالبالكامل. الحفاظ علي مراقبه الفئران مرتين في اليوم التالي لمده 3 أيام. إعطاء البوبرينورفين اضافيه إذا كانت الفئران تظهر اي علامات الم (علي سبيل المثال ، انخفاض الشهية ، والأرق).
      المرحلة الثانية: الإفراز الكيميائي
    6. بعد أسبوع من الجراحة ، يدهن الشريان السباتي بمحلول بنسبه 2% من الفينول المخفف في الايثانول عند نقاط التفرع من العصب الحلقي إلى قطب الجمجمة لل CB. وينبغي توفير نفس الرعاية بعد العملية الجراحية بعد الإفراز الكيميائي علي النحو الموصوف أعلاه في قسم الجراحة.
      ملاحظه: بالنسبة لمجموعه الجراحة الصورية ، يتم تنفيذ نفس الإجراءات باستثناء تشريح عصب الجيوب السباتية.
    7. السماح للحيوانات الشفاء لأيام 5-7 قبل القياسات HVR.

4. التعبير عن LepRb في CB باستخدام ناقلات الفيروسية (Ad-leprب) مقابل السيطرة (ad-lacz)

  1. Ad-LepRب والتعليق الإعلاني-lacz
    1. Transfect الفئران مع فيروس الغدة الدرقية (Ad-LepRب-gfp، 2-5X1010 pfu/ml للتعبير الفوقي ، الإعلان ، lacz، 1 × 1010 pfu/ml للسيطرة) إلى منطقه CB.
    2. أذابه مصفوفة المصفوفة عن طريق دمج القارورة في الثلج في ثلاجة 4 درجات مئوية بين عشيه وضحيها.
    3. تعليق بلطف الفيروس اللحمية في مصفوفة السائلة المصفوفة في 1:5 (1 μL من مصفوفة المصفوفة و 4 μL من فيروس الغدة الدرقية تطبيق ثنائي).
    4. دائما الحفاظ علي تعليق الفيروسية علي الجليد حتى يتم تطبيقه في CB.
  2. التحضير الجراحي
    1. استخدام نفس الاداات الجراحية كبروتوكول CSND.
    2. تخدير Leprb-ناقص db/db الفئران مع 2-2.5 ٪ ايزوفلوان باستخدام مخروط الأنف ووضع الكائنات علي بطانية دافئه لمنع انخفاض حرارة الجسم. يتم معايره ايزوفلواني بعناية للحفاظ علي معدل التنفس عند 1 هرتز (60 الأنفاس/دقيقه). سيتم تقييم مدي كفاية التخدير من خلال تردد التنفس ، وغياب الحركات والضوضاء المسموعة ، وعدم وجود استجابه لمحفزات اللمس ومنعكس السحب الامامي أو المؤخر للأطراف الاماميه.
    3. أداره البوبرينورفين (0.05 مغ/كغ) داخل الصفاق.
    4. أزاله الشعر في المنطقة البطنية من الرقبة وتطهير المنطقة مع بيتادين والكحول كما في بروتوكول CSND.
    5. لمنع جفاف القرنية ، تليين عيني الفئران بمرهم معقم للعين اثناء التخدير.
  3. علاج فيروس الغدة الدرقية لل CB
    1. فضح CBs كما هو موضح في بروتوكول CSND وتطبيق 5 μL من تعليق الفيروسية إلى منطقه CB ثنائيا.
    2. الانتظار 2-3 دقيقه حتى تصبح مصفوفة السائلة المصفوفة هلام. بعد التاكد من ان تعليق الفيروسية كانت ملتصقة ، إغلاق شق مع خياطه الحرير 6.0.
  4. بعد الجراحة
    1. منزل الفئران في غرفه الانتعاش ومراقبه سلوكهم كل 15 دقيقه لأول 1 ح حتى الفئران استعاده الوعي للحفاظ علي الركود القصيه. أعاده الفئران إلى اقفاصهم المنزلية بعد ان يتم استردادها بالبالكامل. الحفاظ علي مراقبه الفئران مرتين في اليوم التالي لمده 3 أيام. إعطاء البوبرينورفين اضافيه إذا كانت الفئران تظهر اي علامات الم (علي سبيل المثال ، انخفاض الشهية ، والأرق).
    2. أداره Buprenorphine (0.05 مغ/كغ) داخل الصفاق حسب الحاجة لمنع الم الانزعاج خلال فتره ما بعد الجراحة.
    3. قياس HVR 9 أيام بعد العدوى الفيروس اللحمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

التسريب المستمر من ليبتين زيادة كبيره HVR في الفئران C57BL/6J الهزيل من 0.23 إلى 0.31 mL/min/g/ΔFiO2 (P < 0.001 ، الشكل 2)11. ألغيت CSND الزيادة الناجمة عن الليبتين في HVR (الشكل 2) ، في حين لم يلاحظ اي اثار مخففه من csnd علي hvr في مجموعه جراحه الشام بعد ضخ ليبتين.

LepRb التعبير في CB من leprb-ناقص السمنة db/db الفئران التي تسببت في زيادة كبيره في hvr من 0.05 إلى 0.06 mL/min/g/δspo2 (الشكل 3). في الكائنات التي تم نقلها باستخدام التحكم Ad-LacZ في CB ، لم يتغير hvr.

Figure 1
الشكل 1: قياسات HVR. وينبغي اجراء التجارب في ظروف معتدل باستخدام (ا) حاضنه حديثي الولادة في 30 درجه مئوية ، ويتم تسجيلها في (B) الجسم كله سونار غرفه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: لبتين زيادة استجابه تنفس نقص الأكسجين (HVR) وتم إلغاء الآثار الناجمة عن الشريان السباتي تشريح العصب (CSND) في C57BL/6J الفئران. وقد عدل هذا الرقم من كابيرو-ايراسو وآخرون11. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التعبير LepRb في الأجسام السباتية (CB) لفئران db/db الناقصة من leprزيادة استجابه تنفس نقص الأكسجين (hvr). وقد عدل هذا الرقم من كابيرو-ايراسو وآخرون11. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وكان التركيز الرئيسي للدراسة لدينا لدراسة الآثار التنفسية من الإشارات الليبتين في CB. وقد وضعت عده بروتوكولات لتقييم دور ليبتين بطريقه ميكانيكيه. أولا ، تم تحليل مساهمه محدده من CB إلى HVR عن طريق التقدير الدقيق لل HVR خلال أول 2 دقيقه من التعرض لنقص الأكسجين. ثانيا ، تم فحص اهميه CB في تنظيم التحكم في التنفس الذي يتوسطه الليبتين من خلال نهجين متكاملين. في الفئران من النوع البري الهزيل مع مستويات ليبتين منخفضه ، تم قياس HVR في خط الأساس وبعد ضخ مستمر من الليبتين. وتكررت التجربة بعد denervation CB. في leprb-ناقص db/db الفئران ، تم قياس hvr في خط الأساس وبعد التعبير leprb في CB.

وقد استخدمت عده بروتوكولات لقياس HVR في القوارض ، وتعريض الماشية للغازات نقص الأكسجين. لقد وضعنا بروتوكول HVR لدراسة دور CB في الكيميائية الطرفية المنعكس وأثار الليبتين في CB علي السيطرة علي التنفس. وقد المجال الكيميائي CB النطاق الزمني قصيرة نسبيا. الاولي 1-2 دقيقه من نقص الأكسجين تتميز بزيادة حاده من استجابه تنفس متبوعا بالعودة البطيءه إلى التهوية خط الأساس بعد 2 دقيقه من العصب السباتي العصبي التحفيز16,18,19. التالي ، في بروتوكول HVR لدينا ، يتم اجراء التحاليل ضمن فاصل زمني 90 s بين أول 30 ثانيه من نقص الأكسجين و 2 دقيقه من 10 ٪ O2 التعرض ، المقابلة للهيمنة الكيميائية الطرفية التي يحكمها CB. هذا التحليل لفتره قصيرة يتجنب الاكتئاب تنفس نقص الأكسجين في الماشية. في بروتوكول HVR لدينا ، ونحن أيضا استخدام ثابت 3 ٪ CO2 التوتر في نقص الأكسجين من أجل التفاف علي الهيبوكابنيا الناجمة عن فرط التهوية اثناء التعرض الحاده هيبوكسيك11. وأخيرا ، قمنا بتطوير بروتوكول hvr تحت شروط ثابته معتدل ، والحفاظ علي الفئران في درجه حرارة حوالي 30 درجه مئوية. وتبين تجربتنا ان التعرض القصير لنقص الأكسجين يمكن ان يقلل من درجه حرارة المستقيم في الفئران إذا كان التعرض يحدث في درجه حرارة الغرفة11، في حين لا يسبب نقص الأكسجين في thermoneutrality التغييرات الايضيه كبيره12.

CSND في الفئران من الناحية الفنية الصعبة ، وذلك بسبب صغر حجم الحيوانية و CBs بهم. لقد وضعنا نهجا ناجحا باستمرار مع ما يقرب من 100 ٪ معدل البقاء علي قيد الحياة من خلال التزام الصارم لبروتوكولنا. الظروف التي تسيطر عليها في بروتوكولنا تشمل البيئة معتدل ، والتخدير الخاضعة للرقابة بعناية والتقنيات الجراحية الدقيقة المعقمة القياسية مع التصور من العصب الصوفي كاداره يقظة بعد الجراحة مع الم التحكم. تبين تجربتنا ان التخلص الجراحي وحده لا يلغي المنعكس الكيميائي لنقص الأكسجين. والخطوة الثانية ، وهي الإفراز الكيميائي ، تليها أيضا الاداره المتانيه لما بعد العمليات الجراحية لتحسين البقاء علي قيد الحياة.

تقنيتنا الأكثر ابتكارا هي الجينات الانتقائية الإفراط في التعبير في منطقه CB. ولم ينفذ هذا النهج من قبل ، بسبب صغر حجم شبكه سي بي اس وعدم وجود سائقين محددين يسمحون بالتعبير عن جين الاهتمام في نوع معين من الخلايا. في الواقع ، نوع I CB الخلايا هي مشابهه جدا للخلايا العصبية المتعاطفة أو خلايا النخاع الكظرية ، في حين ان الخلايا من النوع الثاني مماثله ل استروسيتيس20،21. أخذنا الاستفادة من الفئران db/db ، والتي تفتقر leprb الجينات ، لدينا القدرة علي تطبيق تعليق الفيروسية تقريبا حصرا إلى منطقه CB ، وخصائص مصفوفة المصفوفة ، الذي يتصلب بسرعة في 37 درجه مئوية. ويمكن استخدام نهجنا الرواية في المستقبل لدراسة دور اي الجينات المعرب عنها في CB باستخدام الفئران مع الجسم كله تيروزين هيدروكسيلاز محدده (الخلايا من النوع الأول) أو GFAP محدده (الخلايا من النوع الثاني) الضربة القاضية.

بروتوكولاتنا لديها العديد من القيود. أولا ، استخدمنا 3 ٪ CO2 لتحديد hvr ويبقي السؤال مفتوحا إذا كان جزء من hvr يمكن ان يعزي فعلا إلى استجابه hypercapnic. من أجل التصدي لهذا القيد ، يمكنللمحققين في وقت واحد قياس الاستجابات إلى 3 ٪ CO 2 متوازنة في الغاز مفرط الاكسده ، والتي من شانها ان تحول CB قباله. ثانيا ، قد لا يتم التخلص من HVR تماما من قبل CSND22. هذه الظاهرة يمكن ان تعزي إلى اللدونة العصبية ، والتي هي بارزه بشكل خاص في الفئران. ولذلك ، فمن المهم لدراسة HVR في أقرب وقت ممكن بعد CSND ودائما استخدام السيطرة علي الجراحة الصورية. ثالثا ، لدينا نهج التعبير الجيني CB تفتقر إلى نوع الخلية وخصوصية الجهاز. التقنيات الجزيئية مع الاستخدام المستقبلي لمروجين أكثر انتقائية قد تساعد علي التصدي لهذا القيد.

في الختام ، علي الرغم من وصفها أعلاه القيود ، بروتوكولاتنا في تركيبه تسمح لدراسة دور الجينات CB محدده في الاستجابات الفسيولوجية لنقص الأكسجين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي أصحاب البلاغ مصالح أو إفصاحات متضاربة.

Acknowledgments

R01HL138932, RO1HL133100, RO1HL128970, AHACDA34700025

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Insulin Syringes BD Biosciences 309311
1x PBS (pH 7.4) Gibco 10010-023 500 ml
Ad-Lacz Dr. Christopher Rhodes (University of Chicago) 1 x 1010 pfu/mL
Ad-LepRb-GFP Vector Biolabs ADV-263380 2-5 x 1010 pfu/mL
Anesthetic cart Atlantic Biomedical
Betadine Purdue Products Ltd. 12496-0757-5
Buprenorphine (Buprenex) Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. 12496-0757-5 0.3 mg/mL
C57Bl/6J Jackson laboratory 000664 Mice Strain
Cotton Gauze Sponges Fisherbrand 22-362-178
db/db Jackson laboratory 000697 Mice Strain
Ethanol Pharmco-AAPER 111000200
Isoflurane Vetone 502017
Lab Chart Data Science International (DSI) Software
Matrigel Matrix BD Biosciences 356234
Micro Spring Scissors World Precision Instruments (WPI) 14124
Mouse Ox Plus STARR Life Sciences Corp. Software
Mouse Ox Plus Collar Sensor STARR Life Sciences Corp. 015022-2 Medium Collar Clip Special 7”
Mouse Whole Body Plethysmography Chamber Data Science International (DSI) PLY3211
Ohio Care Plus Incubator Ohmeda HCHD000173
Operating Scissors World Precision Instruments (WPI) 501753-G Straight
Osmotic Pump Alzet 1003D 1 μL/h, 3 days
Phenol Sigma-Aldrich P4557
Recombinant Mouse Leptin protein R&D systems 498-OB-05M 5 mg
Saline RICCA Chemical 7210-16 0.9% Sodium Chloride
Sterile Surgical Suture DemeTech DT-639-1 Silk, size 6-0
Thermometer Innovative Calibration Solutions (INNOCAL) EW 20250-91

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'donnell, C. P., et al. Leptin prevents respiratory depression in obesity. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159, 1477-1484 (1999).
  2. Polotsky, V. Y., et al. Female gender exacerbates respiratory depression in leptin-deficient obesity. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164, 1470-1475 (2001).
  3. Bassi, M., et al. Central leptin replacement enhances chemorespiratory responses in leptin-deficient mice independent of changes in body weight. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 145-153 (2012).
  4. Inyushkina, E. M., Merkulova, N. A., Inyushkin, A. N. Mechanisms of the respiratory activity of leptin at the level of the solitary tract nucleus. Neuroscience and Behavioral Physiology. 40, 707-713 (2010).
  5. Considine, R. V., et al. Serum immunoreactive-leptin concentrations in normal-weight and obese humans. New England Journal of Medicine. 334, 292-295 (1996).
  6. Maffei, M., et al. Leptin levels in human and rodent: measurement of plasma leptin and ob RNA in obese and weight-reduced subjects. Nature Medicine. 1, 1155-1161 (1995).
  7. Phipps, P. R., Starritt, E., Caterson, I., Grunstein, R. R. Association of serum leptin with hypoventilation in human obesity. Thorax. 57, 75-76 (2002).
  8. Berger, S., Polotsky, V. Y. Leptin and Leptin Resistance in the Pathogenesis of Obstructive Sleep Apnea: A Possible Link to Oxidative Stress and Cardiovascular Complications. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 5137947 (2018).
  9. Ribeiro, M. J., et al. High fat diet blunts the effects of leptin on ventilation and on carotid body activity. The Journal of Physiology. 96, 3187-3199 (2018).
  10. Yuan, F., et al. Leptin signaling in the carotid body regulates a hypoxic ventilatory response through altering TASK channel expression. Frontiers in Physiology. 9, 249 (2018).
  11. Caballero-Eraso, C., et al. Leptin acts in the carotid bodies to increase minute ventilation during wakefulness and sleep and augment the hypoxic ventilatory response. The Journal of Physiology. 591, 151-172 (2018).
  12. Jun, J. C., Shin, M. K., Yao, Q., Devera, R., Fonti-Bevans, S., Polotsky, V. Y. Thermoneutrality modifies the impact of hypoxia on lipid metabolism. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 304, 424-435 (2012).
  13. Polotsky, V. Y., et al. Impact of interrupted leptin pathways on ventilatory control. Journal of Applied Physiology. 96, 991-998 (2004).
  14. Pho, H., et al. The effect of leptin replacement on sleep-disordered breathing in the leptin-deficient ob/ob mouse. Journal of Applied Physiology. 120, 78-86 (2016).
  15. Hernandez, A. B., et al. Novel whole body plethysmography system for the continuous characterization of sleep and breathing in a mouse. Journal of Applied Physiology. 112, 671-680 (2012).
  16. Powell, F. L., Milsom, W. K., Mitchell, G. S. Time domains of the hypoxic ventilatory response. Respiration Physiology. 112, 123-134 (1998).
  17. Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16, 81-87 (1955).
  18. Duffin, J. Measuring the ventilatory response to hypoxia. The Journal of Physiology. 587, 285-293 (2007).
  19. Teppema, L. J., Dahan, A. The Ventilatory Response to Hypoxia in Mammals: Mechanisms, Measurement, and Analysis. Physiological Reviews. 90, 675-754 (2010).
  20. Nurse, C. A., Fearon, I. M. Carotid body chemoreceptors in dissociated cell culture. Microscopy Research and Technique. 59, 249-255 (2002).
  21. Kumar, P., Prabhakar, N. R. Peripheral chemoreceptors: function and plasticity of the carotid body. Comprehensive Physiology. 2, 141-219 (2012).
  22. Roux, J. C., Peyronnet, J., Pascual, O., Dalmaz, Y., Pequignot, J. M. Ventilatory and central neurochemical reorganisation of O2 chemoreflex after carotid sinus nerve transection in rat. The Journal of Physiology. 522, 493-501 (2000).

Tags

علم الاحياء ، العدد 152 ، الليبتين ، الجسم السباتي ، استجابه تنفس نقص الأكسجين ، عصب الجيوب السباتية ، النواقل الفيروسية ، السمنة
النهج التجريبي لفحص الإشارات الليبتين في الأجسام السباتية وأثارها علي التحكم في التنفس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shin, M. K., Kim, L. J.,… More

Shin, M. K., Kim, L. J., Caballero-Eraso, C., Polotsky, V. Y. Experimental Approach to Examine Leptin Signaling in the Carotid Bodies and its Effects on Control of Breathing. J. Vis. Exp. (152), e60298, doi:10.3791/60298 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter