Summary
我们的研究侧重于胡萝卜素体 （CB） 中的瘦素信号对低氧通气反应 （HVR） 的影响。进行了"功能丧失"实验，测量瘦素在CB变性后对HVR的影响，在CB中瘦素受体过度表达后测量HVR的"功能增益"实验。
Abstract
脂肪细胞产生的激素瘦素是一种有效的呼吸兴奋剂，在保护肥胖的呼吸功能方面可能起着重要作用。胡萝卜体（CB）是周围缺氧敏感性的关键器官，表达瘦素受体（LepRb）的长功能异形，但瘦素信号在控制呼吸中的作用尚未完全阐明。我们检查了C57BL/6J小鼠在基线和CB脱液后输液前后的低氧通气反应（HVR）（1）;（2） 在LepRb- 缺乏肥胖的 db/db小鼠在基线和后 LepRb在 CB 的过度表达。在C57BL/6J小鼠中，瘦素增加HVR，瘦素对HVR的影响被CB变性所废除。在db/db小鼠中，CB 中的 LepRb表达式增强了 HVR。因此，我们得出结论，瘦素在CB的作用，以增强对缺氧的反应。
Introduction
脂肪细胞产生激素瘦素作用下丘脑抑制食物摄入量和增加代谢率。在我们的实验室1，2和其他研究者3，4进行的研究表明，瘦素增加高充气通气反应（HVR），防止瘦素的肥胖通气不足缺乏肥胖症。然而，大多数肥胖者有高血浆瘦素水平，并表现出对激素5，6，7，8的代谢和呼吸作用的阻力。对瘦素的抗药性是多因素的，但血脑屏障（BBB）对瘦素的渗透性有限，是主要原因。我们建议，瘦素作用于BBB以下的周围缺氧敏感性的关键器官，胡萝卜体（CB），以捍卫肥胖者的呼吸。CB表示瘦素受体LepRb的长功能等形，但CB在瘦素呼吸效应中的作用尚未充分阐明9，10。
我们的方法的目的是检查瘦素信号在CB对HVR的影响。我们的基本原理是：（a） 在小鼠体内注入瘦素，并注入完整的胡萝卜体和脱粒胡萝卜体，然后进行HVR测量;（a） 进行功能丧失实验，将瘦素注入小鼠体内;（b） 缺乏 LepRb的db/db小鼠的功能实验增益，其中我们仅在 CB 中测量了在基线和后表达 LepRb的 HVR。我们技术的优点是，我们在睡眠和觉醒期间，在无节制的无麻醉小鼠身上进行了所有实验。以前的研究者要么在麻醉9下进行实验，要么在睡眠10号期间没有测量瘦素的效果。此外，我们的研究是首次利用上述CB中选择性LepRb表达的函数方法的独特增益。
在广义上，我们的方法可以概括到CB中表达的其他受体及其在低氧敏感性中的作用。调查人员可以将配体注入感兴趣的受体，并在基线和CB变性后测量HVR。作为一种补充方法，在CB和HVR测量中，可以使用本手稿中描述的技术在过度表达之前和之后过度表达感兴趣的受体。
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Protocol
所有实验协议均已获得机构动物护理和使用委员会（MO18M211）的批准。
1. 瘦素输液
注：为了检查瘦素对呼吸的影响，我们通过渗透泵在瘦C57BL/6J小鼠中注入瘦素，以提高肥胖小鼠的循环瘦素水平。
-
渗透泵制备
- 称重空泵以检查已装载溶液的净重量。
- 将瘦素（5毫克/mL）加入渗透泵（1 μL/h，3天）。用小型注射器（1 mL）填充泵。加注后，用提供的钝尖 27 仪表填充管关闭泵。
注：注射器和连接管应无气泡。 - 加注后，再次称重泵以检查溶液的净重量。
-
将瘦素泵分皮插入间盖区域。
注：如果您想立即开始输注，在37°C无菌盐水中孵育预填充泵至少4至6小时（最好是过夜）。
2. 缺氧通气反应 （HVR）
注：热中性条件消除环境温度冷却带来的压力因素，并显著改变小鼠的新陈代谢。因此，所有呼吸测量应在热中性条件下（t = 30 °C）使用新生儿培养箱12（图1A）。全身胸腔（WBP）已用于所有测量。所有动物都应适应大气胸腔和假颈领，在HVR测量前进行3-5天的脉搏血氧测量记录。HVR记录在上午10点至下午5点之间。HVR在睡眠期间被抑制，因此可以在睡眠和静醒13时单独测量。为了确保在HVR测量期间动物的特定睡眠-觉醒阶段，EEG/EMG电极应植入EEG/EMG头部，如前所述14。动物应该被允许恢复至少72小时后，头山。睡眠暂存应在 5 s 的周期内执行。NREM 睡眠由占据超过 50% 的慢波脑电图活动识别。安静的觉醒表现在无运动的情况下的阿尔法脑电图活动。REM睡眠由主要α和ta EEG活动在EMG上肌肉张力降低的情况下识别。通常，在 HVR 气体挑战期间不会观察到 REM 睡眠。
- HVR 记录协议
- 使用以下尺寸的 WBP 造型室：内径 80 mm、高度 50.5 mm 和体积 0.4 L。WBP 室由两个腔室、密封室和参考室以及一个圆形平台组成，用于放置鼠标14（图 1B）。腔室内的流入和流出由维持大气压力的正负压力源控制。此控件可在造型室中创建稳定的偏置流，并防止CO2保持。有关WBP设置的更多详细信息，请参阅埃尔南德斯和同事15。
- 在将鼠标放入 WBP 之前，测量室内温度和室内的相对湿度。
- 测量体重和直肠温度。
- 将血氧表环绕在鼠标的脖子上（以前应将区域进行测量）。
- 将鼠标放在 WBP 内，确保腔室完全密封，以避免空气泄漏。
- 等待大约 30 分钟，直到鼠标安静且腔室的音量恒定。
- Normoxia：30分钟后，如果鼠标安静，开始记录呼吸信号和周围氧饱和度（SpO2）在诺莫夏相（21% FiO2在1分压）20分钟，使用LabChart 7 Pro（版本7.2）。
- 缺氧：在静默20分钟后，开始记录急性缺氧和SpO2的第一周期。对于缺氧阶段，使动物暴露于由10%O2和3%CO2组成的恒定混合气体流中，持续5分钟。
- 在缺氧的前30秒，混合气体通过基座的2个小侧端口流经腔室，使FiO2从21%（压力1atm时）降至10%。
- 初始 30 秒后，关闭 WBP 腔室的一个小侧端口，并在 10% FiO2的恒定缺氧处保持记录 5 分钟。
注：在缺氧时使用10%O2和3%CO2的混合物，以保持eucapnea11。
- 缺氧5分钟后，通过切换流入源，将小鼠再次暴露在室内空气中（压力为1atm时为21%FiO2）。
- 等待至少30分钟，直到下一次诺莫夏记录，以便从以前的缺氧暴露中恢复，以避免通气性滚降现象（即，在缺氧16期间集中抑制呼吸）。
注：在每只鼠标中重复三次缺氧/缺氧循环，以确保测量的可重复性。根据我们的经验，由于通气适应（滚降现象），应避免额外的（在给定一天超过3次）缺氧暴露。 - 在实验结束时，通过在腔室底部的一个小侧口中插入注射器，将1 mL室空气注入3次，校准WBP腔室（鼠标仍在内部）。
- 再次测量室内温度，与里面的动物一起测量。
- 打开腔室并测量鼠标的直肠温度，然后再将其放回家庭笼子。
- HVR 计算
- 以 1，000 Hz（每个通道的采样频率）对 HVR 计算的所有信号进行数字化。
注：WBP潮汐体积分析在实验室图7中基于德洛博和芬方程17进行。所需的变量包括小鼠直肠温度和腔室温度（HVR 测量前后）、相对湿度和腔室气体常数。此常数是校准阶段 1 mL 空气喷射后 WBP 压力偏转的结果。有关更多详情，请参阅埃尔南德斯和同事15。 - 计算德洛博和芬方程后，将潮汐体积 （Vt） 室通道乘以常数。
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为分析选择录像
- 诺莫夏：只选择稳定呼吸与恒定的潮量部分。避免靠近鼠标移动的部分。
- 缺氧：当O2水平从21%下降到10%时，丢弃前30秒，选择30秒到2分钟的10%O2暴露（90秒间隔）。在此间隔内，仅选择具有稳定呼吸且具有恒定潮汐量的部分。避免靠近鼠标移动的部分。如果在每个周期中至少选择 10 s 的缺氧，则分析是可靠的。
注：由CB控制的chemoreflex的外围组件在16、18、19的曝光前1-2分钟占主导地位。在第二阶段，在2分钟至5分钟的缺氧暴露之间，外围和中央元件都发挥作用。最后，第三阶段，>5分钟，的特点是通气不足（滚降现象），主要由中央化学受体控制。我们的经验表明，由于气流源中的手动开关，小鼠在缺氧的博览会上经常醒着。
- 选择后，使用公式VE = 呼吸速率X潮汐体积，在规范和缺氧条件下计算平均分钟通气（VE）。
- 计算诺莫夏和缺氧条件下的平均SpO2。
- 使用公式 HVR = （VE （10% O2） - VE （21%O2） / （SpO2 （10% O2） = SpO2 （21% O2）手动计算 HVR。
注：在 C57BL/6J 小鼠中，用于瘦素输液的渗透泵可能会损害颈部环的准确 SpO2信号检测。在这种情况下，HVR 基于在规范和低氧条件下的 FiO2值（HVR = +VE / +FiO211） 进行计算。
- 以 1，000 Hz（每个通道的采样频率）对 HVR 计算的所有信号进行数字化。
3. 胡萝卜体变性或胡萝卜气突神经解剖（CSND）
注：我们进行了手术和化学变性联合一周分开，因为手术变性本身并不能消除缺氧的化学变性。
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手术准备
- 对成年雄性C57BL/6J小鼠执行所有手术。消毒所有手术器械。使用无菌手术手套、注射器和棉尖施用器。
- 用鼻锥麻醉雄性C57BL/6J小鼠，用1-2%的异常胶，放置一个温暖的毯子，以防止体温过低。无卢兰经过仔细的分级，使呼吸速率保持在1赫兹（60次呼吸/分钟）。手术前麻醉的充分性将通过呼吸频率、无运动和可听到的噪音、对触觉刺激无反应以及前肢或后肢踏板退步反射来评估。
- 在腹内服用布丙诺啡（0.05毫克/千克），以防止疼痛不适。去除颈部腹腔区域的头发，用βdine和酒精对该区域进行消毒。
- 为了防止角膜干燥，在麻醉期间用无菌的眼药膏润滑小鼠的眼睛。
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CSND 程序
第1阶段：手术变性- 中线切口后，通过切除结缔组织和脂肪组织，暴露常见胡萝卜动脉的分叉。
- 识别低光泽神经，这通常是非常突出的，然后抬起它，露出紧接着的光泽神经。使用微型弹簧剪刀双边分离胡萝卜体神经。
- 用 6-0 丝质缝合关闭切口。
- 施用1 mL的正常盐水皮下，以防止脱水。
- 将小鼠安置在恢复室中，并每15分钟监测它们的行为，最初1小时，直到小鼠恢复意识，以保持胸腔性。老鼠完全康复后，将它们送回家中的笼子。在接下来的3天里，每天对老鼠进行两次监测。如果小鼠表现出任何疼痛迹象（例如，食欲下降、烦躁不安），则给予额外的丁丙诺啡。
第 2 阶段：化学变性 - 手术后一周，在从光鲜神经到CB颅杆的分枝点，用乙醇中稀释2%酚的溶液涂漆胡萝卜动脉。手术后应提供相同的术后护理，如上述手术变性部分所述。
注：对于假手术组，除胡萝卜气动神经切除外，执行相同的程序。 - 让动物在HVR测量前恢复5-7天。
4. 使用腺病毒载体（Ad-LepRb）与控制 （Ad-LacZ） 在 CB 中表达 LepRb
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Ad-LepRb和Ad-LacZ悬架
- 将带有腺病毒的小鼠（Ad-LepRb-GFP，2-5x1010 pfu/mL 用于过度表达，Ad-Lacz，1 x 1010 pfu/mL 用于控制）转移到 CB 区域。
- 在4°C的冰箱中浸入冰中的小瓶，将Matrigel基质解冻过夜。
- 在1：5（Matrigel基质的1μL和双联应用腺病毒的4μL）中轻轻悬浮在液体Matrigel基质中的腺病毒。
- 始终在冰上保持病毒悬浮液，直到在CB中应用。
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手术准备
- 使用与 CSND 协议相同的手术器械。
- 麻醉LepRb-缺乏db/db小鼠，使用鼻锥体使用 2-2.5% 的异常鲁兰，并将动物放在温暖的毯子上，以防止体温过低。无卢兰经过仔细的分级，使呼吸速率保持在1赫兹（60次呼吸/分钟）。麻醉的充分性将由呼吸频率、无运动和可听到的噪音、对触觉刺激无反应以及前肢或后肢踏板退步反射来评估。
- 内腹管内管理丁丙诺啡（0.05毫克/千克）。
- 去除颈部腹腔区域的头发，并按照 CSND 协议对区域进行 βdine 和酒精消毒。
- 为了防止角膜干燥，在麻醉期间用无菌的眼药膏润滑小鼠的眼睛。
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CB的腺病毒治疗
- 根据 CSND 协议中所述，公开 CB，并将病毒悬浮液的 5 μL 双边应用到 CB 区域。
- 等待2-3分钟，直到液体母凝胶基质变成凝胶。确认病毒悬浮液凝结后，用6.0丝缝合关闭切口。
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手术后
- 将小鼠安置在恢复室中，并每15分钟监测它们的行为，最初1小时，直到小鼠恢复意识，以保持胸腔性。老鼠完全康复后，将它们送回家中的笼子。在接下来的3天里，每天对老鼠进行两次监测。如果小鼠表现出任何疼痛迹象（例如，食欲下降、烦躁不安），则给予额外的丁丙诺啡。
- 根据需要在腹内施用布丙诺啡（0.05毫克/千克），以防止术后期间出现疼痛不适。
- 在腺病毒转染后9天测量HVR。
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Representative Results
连续输注瘦素显著增加瘦C57BL/6J小鼠的HVR，从0.23升至0.31 mL/min/g/g/-FiO2（P <0.001，图2）11。 CSND废除了HVR的瘦素诱导增加（图2），而瘦素输液后假手术组未观察到CSND对HVR的衰减效应。
LepR b 在LepRb缺乏肥胖db/db小鼠的 CB 中的 LepRb表达导致 HVR 显著增加，从 0.05 mL/min/g/μSpO2 （图 3）。在CB中用对照Ad-LacZ转染的动物中，HVR没有变化。
图 1：HVR 测量值。实验应在热中性条件下使用（A）在30°C的新生儿培养箱进行，并记录在（B） 全身胸腔内。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：瘦素增强缺氧通气反应（HVR），C57BL/6J小鼠的胡萝卜酸神经切除（CSND）消除其影响。这个数字已由卡瓦列罗-埃拉索等人11日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：LepRb-缺陷db/db小鼠的胡萝卜体（CB）中的LepRb表达增加了缺氧通气反应（HVR）。这个数字已由卡瓦列罗-埃拉索等人11日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
我们研究的主要重点是检查瘦素信号在CB中的呼吸效应。已经开发了几种协议来评估瘦素在机械方式中的作用。首先，通过仔细定量HVR在缺氧暴露的前2分钟，分析了CB对HVR的具体贡献。第二，通过两种互补的方法考察了CB在瘦素介导的呼吸控制调节中的相关性。在瘦野生型小鼠中，瘦素水平低，在基线和连续输液后测量HVR;实验在CB变性后重复。在LepRb-缺陷db/db小鼠中，HVR 在 CB 中的基线和 LepRb表达后进行测量。
已经使用几种协议来测量啮齿动物中的HVR，使动物暴露在低氧气体中。我们开发了一个HVR协议来检查CB在外围化学曲中的作用和瘦素在CB中对呼吸控制的影响。CB chemoreflex 具有相对较短的时域。缺氧的前1-2分钟的特点是呼吸反应的急性增强，随后在2分钟的胡萝卜气动神经刺激16、18、19后缓慢返回基线通气。因此，在我们的HVR协议中，分析在缺氧前30秒和10%O2暴露2分钟之间的90秒间隔内进行，对应于由CB控制的外围切莫弹性的统治。这种短时间分析避免了动物的低氧通气性抑郁症。在我们的HVR协议中，我们还在缺氧时使用固定的3%CO2张力，以规避急性缺氧暴露11期间过度通气引起的低盖帽症。 最后，我们在恒定的热中性条件下开发了HVR协议，使小鼠保持在30°C左右的温度。我们的经验显示，如果暴露在室温11下，短时间接触缺氧会降低小鼠的直肠温度，而热中性时的缺氧不会引起显著的代谢变化。
CSND在小鼠是技术上具有挑战性的，因为动物和它们的CB体积小。通过严格遵守我们的协议，我们开发了一个始终如一的成功方法，存活率接近 100%。我们的协议中受控条件包括热中性环境、精心控制的麻醉和标准的无菌显微外科技术，将光泽神经可视化为警惕的术后管理疼痛控制。我们的经验表明，单靠手术变性并不能消除缺氧的化学。第二步，化学脱硝，也是经过仔细的术后管理，以提高生存。
我们最具创新性的技术是在CB区域选择性基因过度表达。这种方法以前没有实现，因为CB规模小，而且缺乏特定的驱动程序，无法表达特定细胞类型感兴趣的基因。事实上，I型CB细胞非常类似于交感神经元或肾上腺髓细胞，而II型细胞则类似于星形细胞20，21。我们利用了db/db小鼠，它缺乏LepRb基因，我们几乎完全在CB区域应用抗病毒悬浮液的能力，以及Matrigel基质的特性，在37°C下迅速凝固。我们的新方法将来可用于研究CB中表达的任何基因的作用，使用小鼠使用全身酪氨酸羟基酶特异性（I型细胞）或GFAP特异性（II型细胞）敲除。
我们的协议有几个限制。首先，我们使用 3% CO2来确定 HVR，如果 HVR 的分数实际上可以归因于超帽反应，则问题仍然尚未解决。为了解决这一限制，调查人员可以同时测量高氧气体中3%CO2平衡的响应，这将关闭CB。第二，HVR 可能不会被 CSND22完全消除。这种现象可归因于神经可塑性，这在小鼠中尤为突出。因此，在CSND之后尽快研究HVR，并始终使用假手术控制是很重要的。第三，我们的CB基因表达方法缺乏细胞类型和器官特异性。分子技术与未来使用更多的选择性促进剂可能有助于克服这种限制。
总之，尽管有上述限制，我们的协议组合允许研究特定CB基因在生理反应对缺氧的作用。
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Disclosures
作者没有相互冲突的利益或披露。
Acknowledgments
R01HL138932，RO1HL133100，RO1HL128970，AHACDA34700025
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Insulin Syringes | BD Biosciences | 309311 | |
| 1x PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | 500 ml |
| Ad-Lacz | Dr. Christopher Rhodes (University of Chicago) | 1 x 1010 pfu/mL | |
| Ad-LepRb-GFP | Vector Biolabs | ADV-263380 | 2-5 x 1010 pfu/mL |
| Anesthetic cart | Atlantic Biomedical | ||
| Betadine | Purdue Products Ltd. | 12496-0757-5 | |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | 0.3 mg/mL |
| C57Bl/6J | Jackson laboratory | 000664 | Mice Strain |
| Cotton Gauze Sponges | Fisherbrand | 22-362-178 | |
| db/db | Jackson laboratory | 000697 | Mice Strain |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Isoflurane | Vetone | 502017 | |
| Lab Chart | Data Science International (DSI) | Software | |
| Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
| Micro Spring Scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14124 | |
| Mouse Ox Plus | STARR Life Sciences Corp. | Software | |
| Mouse Ox Plus Collar Sensor | STARR Life Sciences Corp. | 015022-2 | Medium Collar Clip Special 7” |
| Mouse Whole Body Plethysmography Chamber | Data Science International (DSI) | PLY3211 | |
| Ohio Care Plus Incubator | Ohmeda | HCHD000173 | |
| Operating Scissors | World Precision Instruments (WPI) | 501753-G | Straight |
| Osmotic Pump | Alzet | 1003D | 1 μL/h, 3 days |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P4557 | |
| Recombinant Mouse Leptin protein | R&D systems | 498-OB-05M | 5 mg |
| Saline | RICCA Chemical | 7210-16 | 0.9% Sodium Chloride |
| Sterile Surgical Suture | DemeTech | DT-639-1 | Silk, size 6-0 |
| Thermometer | Innovative Calibration Solutions (INNOCAL) | EW 20250-91 |
References
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