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Biology

경동맥에서 Leptin 신호 와 호흡 제어에 미치는 영향을 검사하는 실험적 접근 법

Published: October 25, 2019 doi: 10.3791/60298
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Medicine, Johns Hopkins University, 2Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Respiratorias (CIBERES), Hospital Universitario Virgen del Rocío/Universidad de Sevilla

Summary

우리의 연구는 저산소 환기 반응 (HVR)에 경동맥 바디 (CB)에 있는 leptin 신호의 효력에 집중합니다. 우리는 CB 탈동 후 HVR에 렙틴의 효과를 측정하는 '기능 상실' 실험과 CB에서 렙틴 수용체의 과발현 후 HVR을 측정하는 '기능의 이득' 실험을 수행했습니다.

Abstract

지방세포 생성 호르몬 렙틴은 강력한 호흡기 자극제이며, 이는 비만에서 호흡기 기능을 방어하는 데 중요한 역할을 할 수 있습니다. 말초 저산소 감도의 핵심 기관인 경동맥 체(CB)는 렙틴 수용체(LepRb)의긴 기능적 이소폼을 발현하지만 호흡 조절에서 렙틴 신호의 역할은 완전히 해명되지 않았다. 우리는 저산소 환기 반응 (HVR) (1) C57BL/6J 마우스에서 기준선및 CB 탈동 후에 렙틴 주입 전후를 조사하였다; (2) LepRb-결핍비만 db/db 마우스에서 기준선 및 렙Rb 과발현 후 CB에서. C57BL/6J 마우스에서, 렙틴은 HVR을 증가시키고 HVR에 렙틴의 효과는 CB 탈동에 의해 폐지되었다. db/db 마우스에서, CB에서의 LepRb 발현은 HVR을 증강시켰다. 따라서, 우리는 leptin 저산소증에 대한 응답을 보강하기 위해 CB에서 작용한다는 결론을 내립니다.

Introduction

지방세포 생산 호르몬 렙틴 은 음식 섭취를 억제하고 신진 대사 속도를 증가시상 하부에서 작용한다. 우리의 실험실에서 수행 된 연구1,2 및 다른 조사자 에 의해3,4 렙틴은 렙틴에서 비만 저환기를 방지 (HVR) 하이퍼 카피성 환기 반응을 증가 것으로 나타났다 부족한 비만. 그러나, 비만 인의 대다수는 높은 혈장 렙틴 수준을 가지고호르몬5,6,7,8의대사 및 호흡 효과에 대한 저항성을 입증한다. 렙틴에 대한 저항성은 다인성이지만, 렙틴에 대한 혈액-뇌 장벽(BBB)의 제한된 투과성은 중요한 역할을 한다. 우리는 leptin가 비만 개별에 있는 호흡을 방어하기 위하여 말초 저산소 감도, 경동맥 바디 (CB)의 중요한 기관에서 BBB 의 밑에 작동한다는 것을 건의합니다. CB는 렙틴 수용체, 렙Rb의긴 기능성 이소폼을 발현하지만 렙틴의 호흡 효과에 대한 CB의 역할은 충분히 해명되지 않았다9,10.

우리의 방법의 목표는 HVR에 CB에 렙틴 신호의 효과를 검사하는 것이었습니다. 우리의 근거는 (a) 손상되지 않은 경동맥 바디와 hVR 측정에 선행된 denervated 경동맥 바디를 가진 마우스에 렙틴을 주입하는 기능 실험의 손실을 능력을 발휘하는 것이었습니다; (b) LepRb가결여된 db/db 마우스에서의 함수 실험의 이득은, 기준선에서 그리고 CB에서만 LepRb의 발현 후에 HVR을 측정하였다. 우리의 기술의 장점은 우리가 수면과 깨어있는 동안 억제되지 않은 unaneded 마우스에서 우리의 모든 실험을 수행했다는 것입니다. 이전 조사자는 마취하에 그들의 실험을수행하거나 수면 중 렙틴의 효과를 측정하지 않았다10. 또한, 당사의 연구는 전술한 CB에서 선택적 LepRb 발현을 통한 기능 접근법의 독특한 이득을 최초로 활용한다.

넓은 맥락에서, 우리의 접근은 저산소 감도에 있는 CB 그리고 그들의 역할에 표현된 그밖 수용체에 일반화될 수 있습니다. 조사자는 관심있는 수용체에 리간드를 주입하고 기준선및 CB 탈동 후에 HVR을 측정할 수 있다. 상보적 접근법으로서, 관심 있는 수용체는 CB에서 과발현될 수 있고 HVR 측정은 이 원고에 기술된 우리의 기술을 사용하여 과발현 전후에 수행될 수 있다.

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Protocol

모든 실험 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (MO18M211)에 의해 승인되었습니다.

1. 렙틴 주입

참고: 호흡에 렙틴의 효과를 검사하기 위해, 우리는 비만 마우스에서 관찰 된 사람들에게 순환 렙틴 수준을 높이기 위해 삼투 펌프에 의해 린 C57BL / 6J 마우스에 피하 적으로 렙틴을 주입.

  1. 삼투펌프 제제
    1. 로드된 용액의 순 중량을 확인하기 위해 빈 펌프의 무게를 측정합니다.
    2. 삼투압 펌프에 Leptin (5 mg/mL)을 추가하십시오 (3 일 동안 1 μL / h). 펌프를 작은 주사기(1mL)로 채웁니다. 충전 후 제공된 무딘 기울어진 27 게이지 충전 튜브로 펌프를 닫습니다.
      참고: 주사기와 부착 된 튜브는 기포가 없어야합니다.
    3. 충전 후 펌프의 무게를 다시 측정하여 용액의 순 중량을 확인합니다.
    4. 렙틴 펌프를 중간 부위에 피하로 삽입합니다.
      참고 :       주입을 즉시 시작하려면 멸균 식염수에 미리 채워진 펌프를 37 °C에서 적어도 4 ~ 6 시간 (바람직하게는 하룻밤)에 인큐베이션하십시오.

2. 저산소 환기 반응 (HVR)

참고: 열중성 조건은 시원한 주변 온도에 의해 부과된 스트레스 요인을 제거하고 마우스의 신진 대사를 크게 수정합니다. 따라서 모든 호흡 측정은 신생아 인큐베이터12(도 1A)를사용하여 열중립 조건(t= 30°C)에서 수행되어야 한다. 전신 과다 모그래피 챔버 (WBP)는 모든 측정에 사용되었습니다. 모든 동물은 HVR 측정 전에 3-5 일 동안 후속 펄스 산소 측정 기록을 위해 기압 과 목 칼라와 샴 넥 칼라에 적응해야합니다. HVR은 오전 10시에서 오후 5시 사이에기록됩니다. HVR 측정 동안 동물의 특정 수면-항적 단계를 보장하기 위해, EEG/EMG 전극은 앞서 설명한 바와 같이 EEG/EMG 헤드마운트로 이식되어야 한다14. 동물은 헤드 마운트 후 적어도 72 시간 동안 회복 할 수 있어야합니다. 수면 스테이징은 5s 시대에 수행되어야합니다. NREM 수면은 시대의 50% 이상을 차지하는 느린 파뇌 EEG 활성에 의해 인식된다. 조용한 깨어 운동의 부재에서 알파 EEG 활동에 의해 명시. REM 수면은 EMG상에서 감소된 근육색조의 존재에서 우세한 알파 및 세타 EEG 활성에 의해 확인된다. 전형적으로, REM 수면은 HVR 가스 도전 동안 관찰되지 않는다.

  1. HVR 레코딩 프로토콜
    1. 내부 직경 80mm, 높이 50.5mm, 부피 0.4L의 WBP 챔버를 사용하십시오. WBP 챔버는 2개의 챔버, 밀봉 및 참조 챔버, 및마우스를 배치하는 원형 플랫폼(도1B)으로구성된다. 챔버 내부의 유입 및 유출은 대기압을 유지하는 양수 및 음압 소스에 의해 제어됩니다. 이 제어는 챔버에서 꾸준한 바이어스 흐름을 생성하고CO2 고정을 방지합니다. WBP 설정에 대한 자세한 내용은 에르난데스와 동료15를참조하십시오.
    2. WBP에 마우스를 배치하기 전에 챔버 내부의 온도와 실내의 상대 습도를 측정합니다.
    3. 체중과 직장 온도를 측정합니다.
    4. 마우스의 목에 산화계 칼라를 넣습니다 (영역은 이전에 면도해야합니다).
    5. WBP 내부에 마우스를 놓고 공기 누출을 방지하기 위해 챔버가 완전히 밀봉되었는지 확인하십시오.
    6. 마우스가 조용하고 챔버가 일정한 볼륨이 될 때까지 약 30분 동안 기다립니다.
    7. Normoxia: 30분 후에 마우스가 조용하면 LabChart 7 Pro(버전 7.2)를 사용하여 노르목실단계(압력의 1atm에서 21% FiO2)에서 호흡 신호 및 말초 산소 포화도(SpO2)를20분 동안 기록합니다.
    8. 저산소증 : 조용한 노르목시아의 20 분 후, 급성 저산소증과 SpO2의첫 번째 주기를 기록하기 시작하십시오. 저산소증 상을 위해, 동물을 5분 동안 10%O2 및 3%CO2로 구성된 일정한 혼합 가스 흐름에 노출시다.
      1. 저산소증의 처음 30초 동안, 혼합 된 가스는 베이스의 2 개의 작은 측면 포트를 통해 챔버를 통해 흐르므로 FiO2가 21 %(압력의 1 atm에서)에서 10 %로 떨어질 수 있습니다.
      2. 초기 30 초 후, WBP 챔버의 작은 측면 포트 중 하나를 닫고 5 분 동안 10 % FiO2에서 일정한 저산소증에서 기록을 유지하십시오.
        참고: 저산소증에서 10%O2 및 3%CO2의 혼합물은 유카프네아(11)를 유지하기 위해 사용된다.
    9. 저산소증의 5분 후, 유입원을 전환하여 마우스를 다시 실내 공기에 노출(압력의 1atm에서 21% FiO2).
    10. 환기 롤오프 현상을 피하기 위해 이전의 저산소 노출에서 회복하기 위해 다음 normoxia 기록까지 적어도 30 분 동안 기다립니다 (즉, 저산소증 동안 호흡의 중앙 억제16).
      참고: 노름증/저산소증을 각 마우스에서 세 번 반복하여 측정의 재현성을 보장합니다. 우리의 경험에서, 추가 (주어진 된 날에 3 번 이상) 저산소 노출을 피해 야 한다, 환기 적응 때문에 (롤 오프 현상).
    11. 실험이 끝나면 챔버의 베이스에있는 작은 측면 포트 중 하나에 연결된 주사기로 3 번 실내 공기 1 mL을 주입하여 WBP 챔버 (마우스가 여전히 내부에 있음)를 교정하십시오.
    12. 그 안에 있는 동물과 함께 챔버의 온도를 다시 측정합니다.
    13. 챔버를 열고 홈 케이지에 다시 배치하기 전에 마우스의 직장 온도를 측정합니다.
  2. HVR 계산
    1. 1,000Hz(채널당 샘플링 주파수)에서 HVR 계산을 위한 모든 신호를 디지털화합니다.
      참고: WBP 조수량 분석은 Drorbaugh 및 Fenn 방정식17에기초하여 실험실 차트 7에서 수행됩니다. 필요한 변수는 마우스 직장 온도 및 챔버 온도(HVR 측정 전후), 상대 습도 및 챔버 가스 상수를 포함한다. 이 상수는 교정 단계에서 1 mL 의 공기 주입 후 WBP 압력 편향으로 인해 발생합니다. 자세한 내용은 에르난데스와 동료15를참조하십시오.
    2. Drorbaugh 및 Fenn 방정식을 계산한 후 조수 부피(Vt) 챔버 채널을 상수로 곱합니다.
    3. 분석을 위한 레코딩 선택
      1. 노르목시아: 일정한 조수 부피로 꾸준한 호흡의 섹션만 선택하십시오. 마우스의 움직임에 근접한 섹션을 피하십시오.
      2. 저산소증:O2 수준이 21%에서 10%로 감소할 때 처음 30초를 버리고, 30초에서 2분까지 10%O2 노출(90초 간격)의 섹션을 선택합니다. 이 간격 내에서 일정한 조수 볼륨으로 호흡이 안정적인 섹션만 선택합니다. 마우스의 움직임에 근접한 섹션을 피하십시오. 분석은 각 주기에서 저산소증의 적어도 10 s가 선택되는 경우에 믿을 수 있습니다.
        참고: CB에 의해 지배되는 chemoreflex의 주변 성분은 노출16,18,19의첫번째 1-2 분 도중 우세합니다. 저산소 노출의 2 분에서 5 분 사이, 두 번째 단계 도중, 둘 다 주변 및 중앙 분대 역할을 합니다. 마지막으로, 세 번째 단계, > 5 분, 중앙 화학 수용체에 의해 주로 지배 되는 저환기 (롤 오프 현상)에 의해 특징입니다. 우리의 경험은 마우스가 공기 흐름 소스에 있는 수동 스위치 때문에 저산소 박람회 도중 수시로 깨어 있다는 것을 보여줍니다.
    4. 선택 후, V조식 V=호흡률X 조석부량을 사용하여 노르목성 및 저산소 조건에서 평균 환기(VE)를 계산한다.
    5. 노르목시아 및 저산소증 조건에서 평균 SpO2를 계산합니다.
    6. HVR =(VE(10% O2)-VE(21%O2)))를 사용하여 HVR을 수동으로 계산한다(21%O2)-SpO 2(21% O2)).)
      참고: C57BL/6J 마우스에서 렙틴 주입을 위한 삼투펌프는 목 칼라에 의한 정확한 SpO2 신호 검출을 손상시킬 수 있다. 이 경우 HVR은 규범및 저산소 조건에서 의 FiO2 값을 기준으로 계산되며 HVR = ΔVE /ΔFiO211입니다.

3. 경동맥 신체 탈동 또는 경동맥 부비동 신경 해부 (CSND)

참고: 우리는 수술 변성만으로는 저산소 체모플렉스를 폐지하지 않기 때문에 1 주일 간격으로 수술및 화학 적 탈연을 수행했습니다.

  1. 외과 준비
    1. 성인 남성 C57BL/6J 마우스에 대한 모든 절차를 수행합니다. 모든 수술 기구를 살균하십시오. 멸균 수술 장갑, 주사기 및 면 팁 어플리케이터를 사용하십시오.
    2. 코 콘을 사용하여 1-2 % 이소플루란으로 남성 C57BL / 6J 마우스를 마취시키고 저체온증을 예방하기 위해 따뜻한 담요를 놓습니다. 이소플루란은 1Hz(60회 호흡/분)로 호흡률을 유지하기 위해 신중하게 적정됩니다. 수술을 시작하기 전에 마취의 적절성은 호흡 빈도, 움직임과 가청 소음의 부재, 촉각 자극에 대한 반응의 부재 및 앞다리 또는 뒷다리 페달 철수 반사에 의해 평가됩니다.
    3. 통증 불편을 방지하기 위해 복강 내 부프레노르핀 (0.05 mg/kg)을 투여하십시오. 목의 복부 부위에서 머리카락을 제거하고 베타딘과 알코올로 부위를 소독하십시오.
    4. 각막 건조를 방지하기 위해 마취 중 멸균 안과 연고로 쥐의 눈을 윤활하십시오.
  2. CSND 절차
    1 단계: 외과 탈수
    1. 중간 선 절개 후, 결합 조직과 지방 조직을 제거하여 일반적인 경동맥의 분기를 노출.
    2. 일반적으로 매우 눈에 띄는 저기압 신경을 식별 한 다음 바로 밑에 광택 인두 신경을 노출시키기 위해 들어 올립니다. 마이크로 스프링 가위를 사용하여 양측 경동맥 부비동 신경을 해부합니다.
    3. 절개를 6-0 실크 봉합사로 닫습니다.
    4. 탈수를 방지하기 위해 정상적인 식염수 1 mL을 피하투여하십시오.
    5. 회복 챔버에 마우스를 수용하고 마우스가 흉골 의힘을 유지하기 위해 의식을 회복 할 때까지 초기 1 시간 마다 15 분마다 자신의 행동을 모니터링합니다. 마우스가 완전히 회복된 후 마우스를 홈 케이지로 되돌리시고 되돌려 보냅니다. 다음 3 일 동안 하루에 두 번 마우스를 모니터링 유지. 마우스가 통증의 흔적을 보여주는 경우 추가 buprenorphine을 제공 (예를 들어, 감소 된 식욕, 쉼 없는).
      2단계: 화학적 변성
    6. 수술 후 1 주일 후, 광택 두근 두 경 신경에서 CB의 두개골 극으로 분기 지점에서 에탄올로 희석 된 2 % 페놀용액으로 경동맥을 페인트하십시오. 수술 후 치료는 외과 적 변동 섹션에서 전술한 바와 같이 화학 변동 후에 제공되어야한다.
      참고 : 가짜 수술 그룹의 경우 경동맥 부비동 신경 해부를 제외하고 동일한 절차가 수행됩니다.
    7. 동물이 HVR 측정 전에 5-7 일 동안 회복시키십시오.

4. 아데노 바이러스 벡터를 사용하여 CB에서 LepRb의 발현(Ad-LepRb) 대 대조군(Ad-LacZ)

  1. Ad-LepRb 및 Ad-LacZ 서스펜션
    1. 아데노바이러스(Ad-LepRb-GFP,2-5x1010 pfu/mL) 과발현, Ad-Lacz,1 x 1010 pfu/mL로 마우스를 CB 영역으로 트랜스펙트한다.
    2. 매트리겔 매트릭스를 밤새 4°C 냉장고에 얼음에 담가 서 해동한다.
    3. 액체 마트리겔 매트릭스에서 아데노바이러스를 1:5(마트리겔 매트릭스 1 μL, 양자 간 적용된 아데노바이러스 4 μL)에서 부드럽게 중단시다.
    4. 항상 CB에 적용 될 때까지 얼음에 바이러스 성 현탁액을 유지.
  2. 외과 준비
    1. CSND 프로토콜과 동일한 수술 기구를 사용하십시오.
    2. LepRb-결핍 db/db 마우스를 코 콘을 사용하여 2-2.5% 이소플루란으로 마취시키고 동물을 따뜻한 담요위에 두어 저체온증을 예방합니다. 이소플루란은 1Hz(60회 호흡/분)로 호흡률을 유지하기 위해 신중하게 적정됩니다. 마취의 적절성은 호흡 주파수, 움직임및 가청 소음의 부재, 촉각 자극에 대한 반응의 부재 및 앞다리 또는 뒷다리 페달 철수 반사에 의해 평가됩니다.
    3. 복강 내 부프레노르핀(0.05 mg/kg)을 투여하십시오.
    4. 목의 복부 부위에서 모발을 제거하고 CSND 프로토콜과 같이 베타딘과 알코올로 부위를 소독합니다.
    5. 각막 건조를 방지하기 위해 마취 중 멸균 안과 연고로 쥐의 눈을 윤활하십시오.
  3. CB의 아데노바이러스 치료
    1. CSND 프로토콜에 기재된 바와 같이 CB를 노출시키고 CB 부위에 바이러스 성 현탁액의 5 μL을 양측으로 적용한다.
    2. 액체 마트리겔 매트릭스가 젤이 될 때까지 2-3 분 기다립니다. 바이러스 성 현탁액이 응고되었다는 것을 확인한 후 6.0 실크 봉합사로 절개를 닫습니다.
  4. 수술 후
    1. 회복 챔버에 마우스를 수용하고 마우스가 흉골 의힘을 유지하기 위해 의식을 회복 할 때까지 초기 1 시간 마다 15 분마다 자신의 행동을 모니터링합니다. 마우스가 완전히 회복된 후 마우스를 홈 케이지로 되돌리시고 되돌려 보냅니다. 다음 3 일 동안 하루에 두 번 마우스를 모니터링 유지. 마우스가 통증의 흔적을 보여주는 경우 추가 buprenorphine을 제공 (예를 들어, 감소 된 식욕, 쉼 없는).
    2. 수술 후 기간 동안 통증 불편을 방지하기 위해 필요에 따라 부프레노르핀 (0.05 mg/kg)을 복강 내로 투여하십시오.
    3. 아데노바이러스 형질감염 후 9일 후에 HVR을 측정합니다.

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Representative Results

렙틴의 지속적인 주입은 린 C57BL/6J 마우스에서 HVR을 0.23에서 0.31 mL/min/g/ΔFiO 2(P< 0.001, 그림 2) 11로크게 증가시었다. CSND는 HVR에 렙틴 유도 증가를 폐지(그림 2),HVR에 CSND의 감쇠 효과는 렙틴 주입 후 가짜 수술 그룹에서 관찰된 동안.

LepRb의 CB에서의 LepR b 발현은 0.05 내지 0.06 mL/min/g/ΔSpO 2(그림 3)에서HVR의 현저한 증가를 유도하였다. CB에서 제어 Ad-LacZ로 형질 감염된 동물에서, HVR은 변경되지 않았다.

Figure 1
그림 1: HVR 측정. 실험은(A)30°C에서 신생아 인큐베이터를 사용하여 열중성 조건에서 수행되어야하며(B)전신 과다 조영술 챔버에 기록된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: Leptin저산소 성 환기 반응 (HVR)을 증강 하 고 효과 C57BL/6J 마우스에서 경동맥 부 비 동 신경 해 부에 의해 폐지 되었다 (CSND). 이 수치는 카바예로 에라소 외11에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: LepRb-결핍 db/db 마우스의 경동맥 체(CB)에서의 렙Rb 발현은 저산소 환기 반응(HVR)을 증가시었다. 이 수치는 카바예로 에라소 외11에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

우리의 연구의 주요 초점은 CB에 있는 렙틴 신호의 호흡 효력을 검토하기 위한 것이었습니다. 기계론적 방식으로 렙틴의 역할을 평가하기 위해 몇 가지 프로토콜이 개발되었습니다. 첫째, HVR에 대한 CB의 구체적인 기여는 저산소 노출의 처음 2분 동안 HVR의 신중한 정량화에 의해 분석되었다. 둘째, 렙틴 중재 된 호흡 조절에서 CB의 관련성은 두 가지 상호 보완적 인 접근법에 의해 조사되었습니다. 낮은 렙틴 수준을 가진 마른 야생 형 마우스에서, HVR은 기준선과 렙틴의 연속 주입 후에 측정되었다; 실험은 CB 탈수 후 반복되었다. LepRb-결핍 db/db 마우스에서, HVR은 기준선및 CB에서의 LepRb 발현 후에 측정되었다.

설치류에서 HVR을 측정하기 위해 여러 프로토콜이 사용되어 동물을 저산소 가스에 노출시되었습니다. 우리는 말초 chemoreflex에 있는 CB의 역할 및 호흡의 통제에 CB에 있는 렙틴의 효력을 검토하기 위하여 HVR 프로토콜을 개발했습니다. CB 체모어플렉스는 상대적으로 짧은 시간 도메인을 가지고 있습니다. 저산소증의 처음 1-2분은 경동맥부비동 신경 자극16,18,19의2분 후에 기저부 환기로 천천히 복귀한 후 인공호흡기 반응의 급성 증강을 특징으로 한다. 따라서, 우리의 HVR 프로토콜에서, 분석은 CB에 의해 지배되는 말초 chemoreflex의 지배에 대응하는 저산소증의 처음 30 s와 10%O2 노출의 2 분 사이 90 s 간격 내로 실행됩니다. 이 짧은 시간 분석은 동물에 있는 저산소 호흡 불경기를 피합니다. 우리의 HVR 프로토콜에서, 우리는 또한 급성 저산소 노출 동안 환기에 의해 유도된 저산소증을 우회하기 위해 저산소증에서 고정된 3%CO2 장력을 사용했다11. 마지막으로, 우리는 일정한 열중립 조건 하에서 HVR 프로토콜을 개발하여 마우스를 약 30 °C의 온도로 유지했습니다. 우리의 경험은 저산소증에 짧은 노출이 실온11에서발생하는 경우에 마우스에 있는 직장 온도를 감소시킬 수 있다는 것을 보여줍니다, 열중성에서 저산소증은 중요한 신진 대사 변경을 유도하지 않는 동안12.

마우스에 있는 CSND는 동물 과 그들의 CBS의 작은 크기 때문에 기술적으로 도전적입니다. 우리는 우리의 프로토콜을 엄격하게 준수하여 거의 100 % 생존율로 일관되게 성공적인 접근 법을 개발했습니다. 우리의 프로토콜에 있는 통제된 조건은 고통을 가진 경계 한 수술 후 관리로 윤두 두경부 신경의 시각화를 가진 열중립환경, 신중하게 통제된 마취 및 표준 멸균 미세 수술 기술을 포함합니다 컨트롤. 우리의 경험은 외과 적 탈수만으로는 저산소 체모플렉스를 폐지하지 않는다는 것을 보여줍니다. 두 번째 단계, 화학 탈동, 또한 생존을 개선하기 위해 주의 사후 관리에 의해 다음.

우리의 가장 혁신적인 기술은 CB 지역에 있는 선택적인 유전자 과발현입니다. 이 접근법은 이전에 구현되지 않았습니다, 때문에 특정 세포 유형에 관심의 유전자를 표현할 수 있도록 특정 드라이버의 작은 크기와 부족. 실제로, 타입 I CB 세포는 부신 수질의 교감 뉴런 또는 세포와 매우 유사하지만, 타입 II 세포는 성상 세포20,21과유사하다. 우리는 LepRb 유전자가 결여된 db/db 마우스, CB 영역에 거의 독점적으로 아데노바이러스 현탁액을 적용하는 능력, 37°C에서 빠르게 응고되는 마트리겔 매트릭스의 특성을 활용했습니다. 우리의 새로운 접근법은 미래에 전신 티로신 하이드록실라제 특이적(타입 I 세포) 또는 GFAP 특이적(타입 II 세포) 녹아웃을 가진 마우스를 사용하여 CB에서 발현되는 임의의 유전자의 역할을 연구하는데 사용될 수 있다.

당사의 프로토콜에는 몇 가지 제한사항이 있습니다. 첫째, 우리는 HVR을 결정하기 위해 3 % CO2를 사용했으며 HVR의 일부가 실제로 하이퍼 캡닉 반응에 기인 할 수있는 경우 질문은 열려 있습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 조사원은 고산소 가스에서 균형잡힌 3%CO2에 대한 응답을 동시에 측정하여 CB를 해제할 수 있습니다. 둘째, HVR은 CSND22에의해 완전히 제거되지 않을 수 있습니다. 이 현상은 마우스에서 특히 두드러지는 신경 가소성에 기인할 수 있습니다. 따라서 CSND 후 가능한 한 빨리 HVR을 연구하고 항상 가짜 수술 제어를 사용하는 것이 중요합니다. 셋째, 우리의 CB 유전자 발현 접근법은 세포 유형 및 장기 특이성이 결백했다. 향후 보다 선택적인 프로모터를 사용하는 분자 기술은 이러한 제한에 대응하는 데 도움이 될 수 있다.

결론적으로, 위에서 설명한 한계에도 불구하고, 당사의 프로토콜은 저산소증에 대한 생리학적 반응에서 특정 CB 유전자의 역할을 연구할 수 있게 한다.

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Disclosures

저자는 상충하는 이해 관계나 공개가 없습니다.

Acknowledgments

R01HL138932, RO1HL133100, RO1HL128970, AHACDA347000025

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Insulin Syringes BD Biosciences 309311
1x PBS (pH 7.4) Gibco 10010-023 500 ml
Ad-Lacz Dr. Christopher Rhodes (University of Chicago) 1 x 1010 pfu/mL
Ad-LepRb-GFP Vector Biolabs ADV-263380 2-5 x 1010 pfu/mL
Anesthetic cart Atlantic Biomedical
Betadine Purdue Products Ltd. 12496-0757-5
Buprenorphine (Buprenex) Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. 12496-0757-5 0.3 mg/mL
C57Bl/6J Jackson laboratory 000664 Mice Strain
Cotton Gauze Sponges Fisherbrand 22-362-178
db/db Jackson laboratory 000697 Mice Strain
Ethanol Pharmco-AAPER 111000200
Isoflurane Vetone 502017
Lab Chart Data Science International (DSI) Software
Matrigel Matrix BD Biosciences 356234
Micro Spring Scissors World Precision Instruments (WPI) 14124
Mouse Ox Plus STARR Life Sciences Corp. Software
Mouse Ox Plus Collar Sensor STARR Life Sciences Corp. 015022-2 Medium Collar Clip Special 7”
Mouse Whole Body Plethysmography Chamber Data Science International (DSI) PLY3211
Ohio Care Plus Incubator Ohmeda HCHD000173
Operating Scissors World Precision Instruments (WPI) 501753-G Straight
Osmotic Pump Alzet 1003D 1 μL/h, 3 days
Phenol Sigma-Aldrich P4557
Recombinant Mouse Leptin protein R&D systems 498-OB-05M 5 mg
Saline RICCA Chemical 7210-16 0.9% Sodium Chloride
Sterile Surgical Suture DemeTech DT-639-1 Silk, size 6-0
Thermometer Innovative Calibration Solutions (INNOCAL) EW 20250-91

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References

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생물학 문제 152 렙틴 경동맥 몸 저산소 인공 호흡 반응 경동맥 부비동 신경 바이러스 벡터 비만
경동맥에서 Leptin 신호 와 호흡 제어에 미치는 영향을 검사하는 실험적 접근 법
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Shin, M. K., Kim, L. J.,… More

Shin, M. K., Kim, L. J., Caballero-Eraso, C., Polotsky, V. Y. Experimental Approach to Examine Leptin Signaling in the Carotid Bodies and its Effects on Control of Breathing. J. Vis. Exp. (152), e60298, doi:10.3791/60298 (2019).

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