Summary
Çalışmamız da karotis cisimdeki leptin sinyalinin (CB) hipoksik ventilatör yanıtı (HVR) üzerine etkileri üzerinde yoğunlaştır. CB denervasyonu ndan sonra leptinin HVR üzerindeki etkisini ölçen 'fonksiyon kaybı' deneyleri ve CB'deki leptin reseptörünün aşırı ekspresyonundan sonra HVR'ı ölçen 'fonksiyon kazancı' deneyleri yaptık.
Abstract
Bir adiposit üretilen hormon leptin güçlü bir solunum uyarıcı, obezite solunum fonksiyonunu savunmada önemli bir rol oynayabilir. Periferik hipoksik duyarlılığın önemli bir organı olan karotis cisim (CB), leptin reseptörünün uzun fonksiyonel izoformunu ifade eder (LepRb) ancak solunum kontrolünde leptin sinyalizasyonunun rolü tam olarak açıklanmamıştır. C57BL/6J farelerde bazinde ve CB denervasyonundan sonra leptin infüzyonu öncesi ve sonrası hipoksik ventilatör yanıtı (HVR) (1) incelendi; (2) LepRb-eksik obez db/db farelerde taban çizgisi ve CB'lerde LepRb aşırı ekspresyonu sonrası. C57BL/6J farelerde leptin hvr artmış ve leptinin HVR üzerindeki etkileri CB denervile ortadan kaldırılmıştır. Db/db farelerde CB'deki LepRb ifadesi HVR'yi artırdı. Bu nedenle, leptin in CB'de hipoksiye verilen yanıtları arttırdığı sonucuna varıyoruz.
Introduction
Bir adiposit üretilen hormon leptin hipotalamus gıda alımını bastırmak ve metabolik hızı artırmak için hareket eder. Laboratuvarımızda yapılan çalışmalar1,2 ve diğer araştırmacılar tarafından3,4 leptin hiperkapnik ventilatör yanıtı artırır gösterdi (HVR) leptin obezite hipoventilasyon önlenmesi eksik obezite. Ancak, obez bireylerin çoğunluğu yüksek plazma leptin düzeyleri var ve hormon metabolik ve solunum etkilerine direnç göstermek5,6,7,8. Leptin direnci multifaktöriyel, ancak kan-beyin bariyerinin sınırlı geçirgenliği (BBB) leptin önemli bir rol oynar. Leptinin obez bireylerde solunumu savunmak için periferik hipoksik duyarlılık, karotis cisim (CB) önemli bir organda BBB altında hareket etmesini öneriyoruz. CBs leptin reseptörünün uzun fonksiyonel izoformunu ifade, LepRb, ancak leptin solunum etkileri CB rolü yeterince açıklanmış olmamıştır9,10.
Yöntemimizin amacı CB'deki leptin sinyalinin HVR üzerindeki etkisini incelemekti. Mantığımız (a) farelerde bozulmamış karotis cisimleri ve denervated karotis cisimleri ile HVR ölçümleri ile leptin infüzyon fonksiyon deneyleri kaybı gerçekleştirmek oldu; (b) LepRb'denyoksun db/db farelerde fonksiyon deneylerinin kazanımı, hvr'ı taban çizgisinde ve LepRb'nin sadece CB cinsinden ifadesinden sonra ölçtük. Tekniklerimizin avantajı, tüm deneylerimizi uyku ve uyanıklık sırasında kontrolsüz anestezisiz farelerde yapmamızdı. Önceki araştırmacılar ya anestezi altında deneylerini yaptı9 veya uyku sırasında leptin etkilerini ölçmek vermedi10. Buna ek olarak, çalışmamız yukarıda açıklanan CB seçici LepRb ifadesi ile fonksiyon yaklaşımıbenzersiz bir kazanç kullanmak için ilk.
Geniş bağlamda, yaklaşımımız CB ile ifade edilen diğer reseptörlere ve hipoksik duyarlılıktaki rollerine genellenebilir. Araştırmacılar ilgi reseptörüne bir ligand aşılayabilir ve temel ve CB denervasyon sonra HVR ölçmek. Tamamlayıcı bir yaklaşım olarak, cb ve HVR ölçümlerinde ilgi reseptörü aşırı ifade edilebilir önce ve bu makalede açıklanan teknolojiile aşırı ekspresyon dan sonra yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel protokoller Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (MO18M211) tarafından onaylanmıştır.
1. Leptin İnfüzyonu
NOT: Leptinin solunum üzerindeki etkisini incelemek için, obez farelerde gözlenen ler için dolaşımdaki leptin düzeylerini yükseltmek için bir ozmotik pompa ile yağsız C57BL/6J farelere deri altı leptin aşıladık.
-
Ozmotik pompa hazırlama
- Boş pompayüklü çözeltinin net ağırlığını kontrol etmek için tartın.
- Ozmotik pompaya Leptin (5 mg/mL) ekleyin (3 gün boyunca 1 μL/h). Pompayı küçük bir şırınga (1 mL) ile doldurun. Doldurduktan sonra, sağlanan künt uçlu 27 gauge dolum tüpü ile pompa kapatın.
NOT: Şırınga ve bağlı tüp hava kabarcıkları ücretsiz olmalıdır. - Doldurduktan sonra, çözeltinin net ağırlığını kontrol etmek için pompayı tekrar tartın.
-
Leptin pompasını interscapular alana deri altı içine yerleştirin.
NOT: İnfüzyona hemen başlamak istiyorsanız, steril saline önceden doldurulmuş pompayı en az 4-6 saat (tercihen bir gecede) 37 °C'de tüphaline alın.
2. Hipoksik Ventilasyon Yanıtı (HVR)
NOT: Termonötr koşullar, soğuk ortam sıcaklığının dayattığı stresli faktörleri ortadan kaldırır ve farelerdeki metabolizmayı önemli ölçüde değiştirir. Bu nedenle tüm solunum ölçümleri termonötr koşullarda (t = 30 °C) neonatal inkübatör12 (Şekil 1A)kullanılarak yapılmalıdır. Tüm vücut pletimografi odası (WBP) tüm ölçümler için kullanılmıştır. Tüm hayvanlar HVR ölçümlerinden 3-5 gün önce sonraki nabız oksimetri kaydı için barometrik pletimografi odasına ve sahte boyun yakasına alışmalıdır. HVR arasında kaydedilir 10 ve 5 PM. HVR uyku sırasında bastırılır, bu nedenle uyku ve sessiz uyanıklık sırasında ayrı ayrı ölçülebilir13. HVR ölçümü sırasında hayvanın özel uyku-uyanıklık evresini sağlamak için, EEG/EMG elektrotları daha önce açıklandığı gibi EEG/EMG headmount olarak yerleştirilmelidir14. Hayvanların baş atlayıştan sonra en az 72 saat iyileşmelerine izin verilmelidir. Uyku evreleme 5 s çağlarda yapılmalıdır. NREM uykusu, çağın %50'sinden daha fazla sını kaplayan yavaş dalga EEG aktivitesi ile tanınır. Sessiz uyanıklık hareketlerin yokluğunda alfa EEG aktivitesi ile kendini gösterir. REM uykusu, EMG'de azalmış kas tonusu varlığında baskın alfa ve teta EEG aktivitesi ile tanımlanır. Tipik olarak, REM uykusu HVR gaz sorunları sırasında gözlenmez.
- HVR kayıt protokolü
- WBP haznesini aşağıdaki boyutta kullanın: 80 mm iç çapı, yüksekliği 50,5 mm ve hacim 0,4 L. WBP odası iki oda, mühürlü ve referans odaları ve fare14 (Şekil 1B)yerleştirmek için dairesel bir platform oluşur. Oda içindeki giriş ve çıkış, atmosfer basıncını koruyan pozitif ve negatif basınç kaynakları tarafından kontrol edilir. Bu denetim haznede sabit bir sapma akışı oluşturur ve CO2 tutmasını önler. WBP kurmak hakkında daha fazla bilgi için, Hernandez ve meslektaşları15bakın.
- Fareyi WBP'ye yerleştirmeden önce odaiçindeki sıcaklığı ve odadaki bağıl nemi ölçün.
- Vücut ağırlığını ve rektal sıcaklığı ölçün.
- Oksimetre yakasını farenin boynuna koyun (alan daha önce tıraş edilmelidir).
- Fareyi WBP'nin içine yerleştirin ve hava sızıntılarını önlemek için odanın tamamen kapalı olduğundan emin olun.
- Fare sessiz ve oda sabit bir hacimde olana kadar yaklaşık 30 dakika bekleyin.
- Normoksia: 30 dakika sonra, fare sessiz ise, solunum sinyalleri ve periferik oksijen doygunluğu (SpO2) normoksia fazında kayıt başlar (21% FiO2 basınç 1 atm) için 20 dk, LabChart 7 Pro kullanarak (sürüm 7.2).
- Hipoksi: sessiz normoksi 20 dakika sonra, akut hipoksi ve SpO2ilk döngüsü kaydetmeye başlar. Hipoksi fazı için, hayvanları 5 dk için %10 O2 ve %3 CO2'den oluşan sabit bir karışık gaz akışına maruz bırakın.
- Hipoksinin ilk 30 sn sırasında, karışık gaz fio2% 21 (basınç 1 atm)% 10 düşmesine izin tabanında 2 küçük yan bağlantı noktası üzerinden oda akar.
- İlk 30'lardan sonra, WBP odasının küçük yan bağlantı noktalarından birini kapatın ve sabit hipokside %10 FiO2'de 5 dakika boyunca kaydı tutun.
NOT: Hipokside %10 O2 ve %3 CO2 karışımı eukapne11'ikorumak için kullanılır.
- 5 dk hipoksiden sonra, giriş kaynağını değiştirerek fareyi tekrar oda havasına (1 atm basınçta %21 FiO2) maruz bırakın.
- Ventilatör roll-off fenomeni önlemek için önceki hipoksik maruziyet kurtarmak için bir sonraki normoksia kaydı kadar en az 30 dakika bekleyin (yani, hipoksi sırasında solunum merkezi bastırma16).
NOT: Ölçümlerin tekrarlanabilirliğini sağlamak için normoksia/hipoksi döngülerini her farede üç kez tekrarlayın. Bizim deneyim, ek (belirli bir günde 3 kez daha fazla) hipoksik maruzkalma kaçınılmalıdır, ventilatör adaptasyon nedeniyle (roll-off fenomen). - Deneyin sonunda, odanın tabanındaki küçük yan bağlantı noktalarından birine takılı bir şırınga ile 3 kez 1 mL oda havası enjekte ederek WBP odasını (fare hala içeride) kalibre edin.
- Odadaki hayvanı tekrar ölçün.
- Odayı açın ve fareyi ev kafesine geri koymadan önce rektal sıcaklığı ölçün.
- HVR hesaplama
- HVR hesaplaması için tüm sinyalleri 1.000 Hz (kanal başına örnekleme frekansı) olarak dijitalleştirin.
NOT: WBP gelgit hacim analizi Drorbaugh ve Fenn denklemi17dayalı Lab Chart 7 yapılır. Gerekli değişkenler fare rektal sıcaklığı ve oda sıcaklığı (HVR ölçümü öncesi ve sonrası), bağıl nem ve oda gazı sabitini kapsar. Bu sabit, kalibrasyon aşamasında ki 1 mL hava enjeksiyonundan sonra WBP basınç saptırıcılığısonucu ortaya çıkar. Daha fazla bilgi için, Hernandez ve meslektaşları15bakın. - Drorbaugh ve Fenn denklemini hesapladıktan sonra, gelgit hacmi (Vt) oda kanalını sabitle çarpın.
-
Analiz için kayıtların seçimi
- Normoxia: sabit gelgit hacmi ile sürekli nefes sadece bölümleri seçin. Farenin hareketlerine yakın bölümlerden kaçının.
- Hipoksi: O2 düzeyleri %21'den %10'a düştüğünde ilk 30 s'yi atın, 30 s'den 2 dakikaya kadar %10 O2 pozlama (90 s aralığı) bölümlerini seçin. Bu aralıkta, sabit gelgit hacmiile sabit nefes alan yalnızca bölümleri seçin. Farenin hareketlerine yakın bölümlerden kaçının. Her döngüde en az 10 s hipoksi seçilirse analiz güvenilirdir.
NOT: CB tarafından yönetilen chemoreflex periferik bileşeni maruz kalma ilk 1-2 dakika sırasında hakim16,18,19. İkinci aşamada, 2 dakika ile 5 dk arasında hipoksik maruziyet, hem periferik hem de santral bileşen rol oynar. Son olarak, üçüncü faz, > 5 dk, hipoventilasyon ile karakterizedir (roll-off fenomeni) merkezi kemoreseptörler tarafından ağırlıklı olarak yönetilir. Deneyimlerimiz, hava akımı kaynağındaki manuel anahtarlar nedeniyle farelerin hipoksik sergi sırasında genellikle uyanık olduğunu göstermektedir.
- Seçimden sonra, normoksik ve hipoksik koşullarda ortalama dakika ventilasyonunu (VE)formül VE = solunum hızı X gelgit hacmini kullanarak hesaplayın.
- Normoksi ve hipoksi koşullarında ortalama SpO2'yi hesaplayın.
- HVR formülünü kullanarak HVR'ı manuel olarak hesaplayın = (VE (%10 O2) - VE (21%O2)) / (SpO2 (%10 O2) – SpO2 (%21 O2)).
NOT: C57BL/6J farelerde, leptin infüzyonu için ozmotik pompa boyun yaka tarafından doğru SpO2 sinyal algılama bozabilir. Bu durumda HVR normoksik ve hipoksik koşullarda FiO2 değerlerine göre HVR = ΔVE / ΔFiO211olarak hesaplanır.
- HVR hesaplaması için tüm sinyalleri 1.000 Hz (kanal başına örnekleme frekansı) olarak dijitalleştirin.
3. Karotis Vücut Denervasyon veya Karotis Sinüs Sinir Diseksiyonu (CSND)
NOT: Bir hafta arayla kombine cerrahi ve kimyasal denervasyon uyguladık, çünkü cerrahi denervasyon tek başına hipoksik chemoreflex'i ortadan kaldırmaz.
-
Cerrahi hazırlık
- Yetişkin erkek C57BL/6J fareler üzerinde tüm prosedürleri gerçekleştirin. Tüm cerrahi aletleri sterilize edin. Steril cerrahi eldivenler, şırıngalar ve pamuk uçlu aplikatörler kullanın.
- Bir burun konisi kullanarak% 1-2 isofluran ile erkek C57BL/6J fareler anestezi ve hipotermi önlemek için sıcak bir battaniye yerleştirin. Isoflurane 1 Hz (60 nefes/dk) solunum hızını korumak için dikkatle titre edilir. Ameliyatlara başlamadan önce anestezinin yeterliliği solunum sıklığı, hareketlerin ve duyulabilir seslerin yokluğu, dokunsal uyaranlara yanıt olmaması ve ön veya arka bacak pedalı çekilme refleksi ile değerlendirilecektir.
- Ağrı rahatsızlıklarını önlemek için buprenorfin (0.05 mg/kg) intraperitoneal olarak uygulayın. Boynun ventral bölgesinde saç çıkarın ve betadine ve alkol ile bölgeyi dezenfekte.
- Kornea nın kurumasını önlemek için, anestezi sırasında farelerin gözlerini steril oftalmik merhem ile yağlatın.
-
CSND prosedürleri
Evre 1: Cerrahi denervasyon- Orta hat insizyonu sonra, bağ dokuları ve yağ dokusu kaldırarak ortak karotis arterlerin bifurkasyon ortaya.
- Hipoglossal sinir tanımlayın, genellikle çok belirgindir, ve sonra hemen altında glossopharyngeal sinir ortaya çıkarmak için yukarı kaldırın. Mikro yay makaskullanarak karotis sinüs sinirlerini iki taraflı olarak diseksiyon.
- Kesiyi 6-0 ipek sütür ile kapatın.
- Dehidratasyonu önlemek için 1 mL normal tuzlu su altı deri sini uygulayın.
- Fareleri bir kurtarma odasında barındırın ve fareler göğüs selremiyetini korumak için bilincini geri kazanana kadar ilk 15 dakikada bir davranışlarını izleyin. Fareler tamamen iyileştikten sonra ev kafeslerine geri dönün. Önümüzdeki 3 gün boyunca günde iki kez fareleri izlemeye devam edin. Fareler ağrı belirtileri gösteriyorsa ek buprenorfin verin (örn. iştah azalması, huzursuzluk).
Aşama 2: Kimyasal denervasyon - Ameliyattan bir hafta sonra, kaftanofarengeal sinirden CB'nin kranial direğine dallanma noktalarında etanolle seyreltilmiş %2 fenol çözeltisi ile karotis arteri boyayın. Cerrahi denervasyon bölümünde yukarıda açıklandığı gibi kimyasal denervasyon dan sonra aynı postoperatif bakım sağlanmalıdır.
NOT: Sahte cerrahi grubu için karotis sinüs sinir diseksiyonu dışında aynı işlemler yapılır. - HVR ölçümlerini yapmadan önce hayvanların 5-7 gün iyileşmesini sağlar.
4. Cb'de LepRb'nin adenoviral vektör(Ad-LepRb) vs kontrol (Ad-LacZ) kullanarak ekspresyonu
-
Ad-LepRb ve Ad-LacZ süspansiyon
- Transfect adenovirüs ile fareler (Ad-LepRb-GFP, 2-5x1010 pfu/mL aşırı ekspresyon için, Ad-Lacz, 1 x 1010 pfu/mL kontrol için) CB alanına.
- Matrigel matrisini bir gecede 4 °C'lik bir buzdolabında şişeyi buza batırarak eritin.
- Sıvı Matrigel matrisindeki adenovirüs hafifçe 1:5'te (1 μL Matrigel matrisi ve 4 μL adenovirüs iki taraflı olarak uygulanır).
- CB'de uygulanana kadar her zaman viral süspansiyonu buzüzerinde tutun.
-
Cerrahi hazırlık
- CSND protokolü ile aynı cerrahi aletleri kullanın.
- Bir burun konisi kullanarak% 2-2.5 izofluran ile LepRb-eksik db/db fareler anestezi ve hipotermi önlemek için sıcak bir battaniye üzerine hayvanları yerleştirin. Isoflurane 1 Hz (60 nefes/dk) solunum hızını korumak için dikkatle titre edilir. Anestezinin yeterliliği solunum sıklığı, hareketlerin ve duyulabilir seslerin yokluğu, dokunsal uyaranlara yanıt ın olmaması ve ön veya arka bacak pedalı çekilme refleksi ile değerlendirilecektir.
- Buprenorfin (0.05 mg/kg) intraperitoneal olarak uygulayın.
- Boynun ventral bölgesindeki tüyleri çıkarın ve CSND protokolünde olduğu gibi bölgeyi betadin ve alkolle dezenfekte edin.
- Kornea nın kurumasını önlemek için, anestezi sırasında farelerin gözlerini steril oftalmik merhem ile yağlatın.
-
CB adenovirüs tedavisi
- CSND protokolünde açıklandığı gibi CB'leri ortaya çıkarın ve viral süspansiyonun 5 μL'sini CB bölgesine iki taraflı olarak uygulayın.
- Sıvı Matrigel matris bir jel haline gelene kadar 2-3 dk bekleyin. Viral süspansiyonun kapatıldığını doğruladıktan sonra, kesiyi 6.0 ipek sütür ile kapatın.
-
Ameliyat sonrası
- Fareleri bir kurtarma odasında barındırın ve fareler göğüs selremiyetini korumak için bilincini geri kazanana kadar ilk 15 dakikada bir davranışlarını izleyin. Fareler tamamen iyileştikten sonra ev kafeslerine geri dönün. Önümüzdeki 3 gün boyunca günde iki kez fareleri izlemeye devam edin. Fareler ağrı belirtileri gösteriyorsa ek buprenorfin verin (örn. iştah azalması, huzursuzluk).
- Postoperatif dönemde ağrı rahatsızlıklarını önlemek için gerektiğinde Buprenorfin (0.05 mg/kg) intraperitoneal olarak uygulayın.
- Adenovirüs transfeksiyonundan 9 gün sonra HVR ölçün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yalın C57BL/6J farelerde sürekli leptin infüzyonu HVR'ı 0,23'ten 0,31 mL/dk/g/ΔFiO2'ye yükseltti (P < 0,001, Şekil 2)11. CSND, Leptin infüzyonu sonrası sham cerrahi grubunda CSND'nin HVR üzerinde zayıflatıcı etkisi gözlenmezken, HVR'da leptin kaynaklı artışı(Şekil 2)ortadan kaldırmış ve hiçbir zayıflatıcı etkisi gözlenmemiştir.
LepRb-eksik obez db/db farelerin CB'sinde LepRb ekspresyonu HVR'da 0,05'ten 0,06 mL/mL/mL/g/ΔSpO2'ye önemli bir artış alabilmiştir(Şekil 3). CB'de Kontrol Ad-LacZ ile transfected hayvanlarda, HVR değişmedi.
Şekil 1: HVR ölçümleri. Deneyler 30 °C'de yenidoğan inkübatörü(A)kullanılarak termonötr koşullarda yapılmalı ve a (B) tüm vücut pletismografi odasında kaydedilmelidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Leptin hipoksik ventilatör yanıtını (HVR) artırdı ve etkileri C57BL/6J farelerde karotis sinüs sinir diseksiyonu (CSND) ile kaldırıldı. Bu rakam Caballero-Eraso ve ark.11'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: LepRb-eksik db/db farelerin karotis cisimlerinde (CB) LepRb ekspresyonu hipoksik ventilatör yanıtını (HVR) artırmıştır. Bu rakam Caballero-Eraso ve ark.11'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çalışmamızın ana odak noktası CB'de leptin sinyalinin solunum etkilerini incelemekti. Çeşitli protokoller mekanistik bir şekilde leptin rolünü değerlendirmek için geliştirilmiştir. İlk olarak, CB'nin HVR'ye özel katkısı hipoksik maruziyetin ilk 2 dakikasında HVR'nin dikkatli bir şekilde ölçülmesi ile analiz edildi. İkinci olarak, solunum kontrolünün leptin aracılı yukarı düzenlenmesinde CB'nin önemi iki tamamlayıcı yaklaşımla incelenmiştir. Düşük leptin düzeylerine sahip yalın yabani farelerde HVR taban çizgisi ve sürekli leptin infüzyonu sonrasında ölçüldü; deney CB denervasyonundan sonra tekrarlandı. LepRb-eksik db/db farelerde HVR, CB'de LepRb ekspresyonundan sonra bazal olarak ölçüldü.
Kemirgenlerde HVR ölçmek için çeşitli protokoller kullanılmıştır, hipoksik gazlara hayvanlar maruz. Cb'nin periferik chemoreflex'teki rolünü ve CB'deki leptinin solunum kontrolü üzerindeki etkilerini incelemek için bir HVR protokolü geliştirdik. CB chemoreflex nispeten kısa bir zaman etki alanına sahiptir. Hipoksi ilk 1-2 dakika karotis sinüs sinir stimülasyonu 2 dakika sonra bazal ventilasyon yavaş bir dönüş takip ventilatör yanıtı akut bir büyütme ile karakterizedir16,18,19. Böylece, HVR protokolümüzde analizler, ilk 30 s hipoksi ile %10 O2 pozlama arasında 90 s aralıkta yapılır ve CB tarafından yönetilen periferik chemoreflex hakimiyetine karşılık gelir. Bu kısa süreli analiz hayvanlarda hipoksik ventilatör depresyon önler. HVR protokolümüzde, akut hipoksik maruziyet sırasında hiperventilasyonun neden olduğu hipokapnianın atlatması için hipokside %3 CO2 gerilimi de kullanıldı11. Son olarak, fareleri 30 °C civarında tutarak sabit termonötr koşullarda HVR protokolünü geliştirdik. Deneyimlerimiz hipoksiye kısa maruz kalma oda sıcaklığında oluşureğer farelerde rektal sıcaklığı azaltabilir gösterir11, termonötralitede hipoksi önemli metabolik değişikliklere neden olmaz ise12.
Farelerde CSND, hayvanların ve onların CB'lerinin küçük boyutu nedeniyle teknik olarak zordur. Protokolümüze sıkı bir şekilde bağlı kalarak yaklaşık %100 sağkalım oranı ile sürekli olarak başarılı bir yaklaşım geliştirdik. Protokolümüzdeki kontrollü koşullar termonötr ortam, dikkatle kontrol edilen anestezi ve standart steril mikrocerrahi teknikleri içerir ve glossofastereal sinirin ağrıile birlikte uyanık postoperatif yönetim olarak görselleştirilmesi ile Denetim. Deneyimlerimiz cerrahi denervasyon un tek başına hipoksik chemoreflex ortadan kaldırmadığını göstermektedir. İkinci adım, kimyasal denervasyon, aynı zamanda sağkalımı artırmak için dikkatli post-operatif yönetim tarafından takip edilir.
En yenilikçi tekniğimiz CB alanındaki seçici gen aşırı ekspresyonudur. Bu yaklaşım, CB'lerin küçük boyutu ve belirli bir hücre tipinde ilgi genini ifade etmeye izin veren belirli sürücülerin olmaması nedeniyle daha önce uygulanmamıştır. Aslında, tip I CB hücreleri sempatik nöronlar veya adrenal medulla hücreleri çok benzer, tip II hücreleri astrositler benzer ise20,21. LepRb geni olmayan db/db farelerden, adenoviral süspansiyonu neredeyse sadece CB bölgesine uygulayabilme yeteneğimizden ve 37 °C'de hızla katılaşan Matrigel matrisinin özelliklerinden yararlandık. Yeni yaklaşımımız gelecekte tüm vücut tirozin hidroksilaz spesifik (tip I hücreleri) veya GFAP spesifik (tip II hücreleri) nakavtları ile fareler kullanarak CB ifade edilen herhangi bir genin rolünü incelemek için kullanılabilir.
Protokollerimizin bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, HVR belirlemek için% 3 CO2 kullanılan ve HVR fraksiyonu aslında hiperkapnik yanıt atfedilebilir eğer soru açık kalır. Bu sınırlamayı gidermek için, araştırmacılar aynı anda hiperoksik gazdengeli% 3 CO2 yanıtları ölçebilirsiniz, hangi CB kapatacak. İkinci olarak, HVR tamamen CSND22tarafından ortadan kaldırılmış olmayabilir. Bu fenomen nöroplastisite atfedilebilir, özellikle farelerde belirgindir. Bu nedenle CSND'den sonra hvr çalışması ve her zaman sahte cerrahi kontrolü kullanmak önemlidir. Üçüncü olarak, CB gen ekspresyonu yaklaşımımızda hücre tipi ve organ özgüllüğü yoktu. Daha seçici organizatörlerin gelecekteki kullanımı ile Moleküler teknikler bu sınırlama karşı yardımcı olabilir.
Sonuç olarak, yukarıda açıklanan sınırlamalara rağmen, birlikte protokollerimiz hipoksiye fizyolojik yanıtlarda belirli CB genlerinin rolünü araştırmaya olanak sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çakışan çıkarları veya açıklamaları yoktur.
Acknowledgments
R01HL138932, RO1HL133100, RO1HL128970, AHACDA34700025
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Insulin Syringes | BD Biosciences | 309311 | |
| 1x PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | 500 ml |
| Ad-Lacz | Dr. Christopher Rhodes (University of Chicago) | 1 x 1010 pfu/mL | |
| Ad-LepRb-GFP | Vector Biolabs | ADV-263380 | 2-5 x 1010 pfu/mL |
| Anesthetic cart | Atlantic Biomedical | ||
| Betadine | Purdue Products Ltd. | 12496-0757-5 | |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | 0.3 mg/mL |
| C57Bl/6J | Jackson laboratory | 000664 | Mice Strain |
| Cotton Gauze Sponges | Fisherbrand | 22-362-178 | |
| db/db | Jackson laboratory | 000697 | Mice Strain |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Isoflurane | Vetone | 502017 | |
| Lab Chart | Data Science International (DSI) | Software | |
| Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
| Micro Spring Scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14124 | |
| Mouse Ox Plus | STARR Life Sciences Corp. | Software | |
| Mouse Ox Plus Collar Sensor | STARR Life Sciences Corp. | 015022-2 | Medium Collar Clip Special 7” |
| Mouse Whole Body Plethysmography Chamber | Data Science International (DSI) | PLY3211 | |
| Ohio Care Plus Incubator | Ohmeda | HCHD000173 | |
| Operating Scissors | World Precision Instruments (WPI) | 501753-G | Straight |
| Osmotic Pump | Alzet | 1003D | 1 μL/h, 3 days |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P4557 | |
| Recombinant Mouse Leptin protein | R&D systems | 498-OB-05M | 5 mg |
| Saline | RICCA Chemical | 7210-16 | 0.9% Sodium Chloride |
| Sterile Surgical Suture | DemeTech | DT-639-1 | Silk, size 6-0 |
| Thermometer | Innovative Calibration Solutions (INNOCAL) | EW 20250-91 |
References
- O'donnell, C. P., et al.
- Polotsky, V. Y., et al. Female gender exacerbates respiratory depression in leptin-deficient obesity. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164, 1470-1475 (2001).
- Bassi, M., et al. Central leptin replacement enhances chemorespiratory responses in leptin-deficient mice independent of changes in body weight. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 145-153 (2012).
- Inyushkina, E. M., Merkulova, N. A., Inyushkin, A. N. Mechanisms of the respiratory activity of leptin at the level of the solitary tract nucleus. Neuroscience and Behavioral Physiology. 40, 707-713 (2010).
- Considine, R. V., et al. Serum immunoreactive-leptin concentrations in normal-weight and obese humans. New England Journal of Medicine. 334, 292-295 (1996).
- Maffei, M., et al. Leptin levels in human and rodent: measurement of plasma leptin and ob RNA in obese and weight-reduced subjects. Nature Medicine. 1, 1155-1161 (1995).
- Phipps, P. R., Starritt, E., Caterson, I., Grunstein, R. R. Association of serum leptin with hypoventilation in human obesity. Thorax. 57, 75-76 (2002).
- Berger, S., Polotsky, V. Y. Leptin and Leptin Resistance in the Pathogenesis of Obstructive Sleep Apnea: A Possible Link to Oxidative Stress and Cardiovascular Complications. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 5137947 (2018).
- Ribeiro, M. J., et al. High fat diet blunts the effects of leptin on ventilation and on carotid body activity. The Journal of Physiology. 96, 3187-3199 (2018).
- Yuan, F., et al. Leptin signaling in the carotid body regulates a hypoxic ventilatory response through altering TASK channel expression. Frontiers in Physiology. 9, 249 (2018).
- Caballero-Eraso, C., et al. Leptin acts in the carotid bodies to increase minute ventilation during wakefulness and sleep and augment the hypoxic ventilatory response. The Journal of Physiology. 591, 151-172 (2018).
- Jun, J. C., Shin, M. K., Yao, Q., Devera, R., Fonti-Bevans, S., Polotsky, V. Y. Thermoneutrality modifies the impact of hypoxia on lipid metabolism. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 304, 424-435 (2012).
- Polotsky, V. Y., et al. Impact of interrupted leptin pathways on ventilatory control. Journal of Applied Physiology. 96, 991-998 (2004).
- Pho, H., et al. The effect of leptin replacement on sleep-disordered breathing in the leptin-deficient ob/ob mouse. Journal of Applied Physiology. 120, 78-86 (2016).
- Hernandez, A. B., et al. Novel whole body plethysmography system for the continuous characterization of sleep and breathing in a mouse. Journal of Applied Physiology. 112, 671-680 (2012).
- Powell, F. L., Milsom, W. K., Mitchell, G. S. Time domains of the hypoxic ventilatory response. Respiration Physiology. 112, 123-134 (1998).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16, 81-87 (1955).
- Duffin, J. Measuring the ventilatory response to hypoxia. The Journal of Physiology. 587, 285-293 (2007).
- Teppema, L. J., Dahan, A. The Ventilatory Response to Hypoxia in Mammals: Mechanisms, Measurement, and Analysis. Physiological Reviews. 90, 675-754 (2010).
- Nurse, C. A., Fearon, I. M. Carotid body chemoreceptors in dissociated cell culture. Microscopy Research and Technique. 59, 249-255 (2002).
- Kumar, P., Prabhakar, N. R. Peripheral chemoreceptors: function and plasticity of the carotid body. Comprehensive Physiology. 2, 141-219 (2012).
- Roux, J. C., Peyronnet, J., Pascual, O., Dalmaz, Y., Pequignot, J. M. Ventilatory and central neurochemical reorganisation of O2 chemoreflex after carotid sinus nerve transection in rat. The Journal of Physiology. 522, 493-501 (2000).
