Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Dissektion af Drosophila melanogaster Flight muskler for omics tilgange

Published: October 17, 2019 doi: 10.3791/60309
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,2
1Biomedical Center, Department of Physiological Chemistry, Ludwig-Maximilians-University Munich, 2Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM), Department of Chemistry, Ludwig-Maximilians-University Munich
* These authors contributed equally

Summary

Drosophila Flight muskel er en kraftfuld model til at studere transkriptional regulering, alternative splicing, metabolisme, og mechanobiology. Vi præsenterer en protokol for dissektion af fluorescerende-mærket flyve muskel fra levende pupper til at generere meget berigede prøver ideel til proteomics og dybe sekvensering. Disse prøver kan tilbyde vigtig mekanistisk indsigt i forskellige aspekter af muskel udvikling.

Abstract

Drosophila Flight muskel er en kraftfuld model til at studere forskellige processer såsom transkriptional regulering, alternative splicing, metabolisme, og mechanobiology, som alle påvirker muskel udvikling og myofibrillogenesis. Omics-data, såsom dem, der genereres af massespektrometri eller dybe sekvensering, kan give vigtig mekanistisk indsigt i disse biologiske processer. For sådanne tilgange er det gavnligt at analysere vævsspecifikke prøver for at øge både selektiviteten og specificiteten af de omik-fingeraftryk. Her præsenterer vi en protokol for dissektion af fluorescerende-mærket flyve muskel fra levende pupper til at generere stærkt berigede muskel prøver for omik applikationer. Vi først beskrive, hvordan man dissekere Flight muskler i begyndelsen af før etaper (< 48 h efter puparium dannelse [APF]), når musklerne er mærkbar ved grøn fluorescerende protein (gfp) mærkning. Vi beskriver derefter, hvordan man dissekere muskler fra sent pupper (> 48 h APF) eller voksne, når musklerne kan skelnes under en dissekere mikroskop. Den medfølgende video protokol vil gøre disse teknisk krævende dissektioner mere bredt tilgængelige for musklen og Drosophila forskersamfund. For RNA-applikationer, vi assay mængden og kvaliteten af RNA, der kan isoleres på forskellige tidspunkter og med forskellige tilgange. Vi viser endvidere, at Bruno1 (Bru1) er nødvendig for en tidsmæssig forskydning i myosin Heavy Chain (MHC) splicing, hvilket viser, at dissekerede muskler kan anvendes til mRNA-SEQ, massespektrometri, og reverse transskription polymerase kædereaktion (RT-PCR) Programmer. Denne dissektion-protokol vil bidrage til at fremme vævsspecifikke omik-analyser og kan generelt anvendes til at studere flere biologiske aspekter af myogenesis.

Introduction

Moderne omik teknologier giver vigtig indsigt i muskel udvikling og de mekanismer, underliggende menneskelige muskellidelser. For eksempel har analysen af transkriptomics-data kombineret med genetisk og biokemisk verifikation i dyremodeller afsløret, at tabet af splejsning-faktoren RBM20 forårsager forstørret kardiomyopati på grund af dets regulering af et målnetværk på mere end 30 sarcomere gener, der tidligere har været forbundet med hjertesygdomme, herunder tidligere1,2,3.

I et andet eksempel har undersøgelser fra cellekultur, dyremodeller og humane patienter vist, at myotonisk dystrofi skyldes en forstyrrelse i RNA-reguleringen som følge af binding af muscleblind (mbnl) og docetaxels opregulering af CELF14,5. Den tvær regulerende og tidsmæssige dynamik mellem mbnl og CELF1 (også kaldet CUGBP1 eller Bruno-lignende 2) bidrager til at forklare de vedvarende embryonale splejsning mønstre i myotoniske dystrofi patienter. Desuden, det store netværk af fejl regulerede mål hjælper med at forklare den komplekse karakter af sygdommen4,6,7,8. Et flertal af sådanne undersøgelser udnytter omik tilgange i genetiske model organismer til at forstå de mekanismer, der ligger til grund for menneskets muskelsygdom. Desuden fremhæver de vigtigheden af første forståelse af tidsmæssig og vævstype specifikt genekspression, protein modifikation og metaboliske mønstre i raske muskler for at forstå ændringer i syge eller aldrende muskler.

Drosophila melanogaster er en anden veletableret genetisk model organisme. Strukturen af sarcomere samt individuelle sarcomere komponenter er meget bevaret fra fluer til hvirveldyr4,9,10, og indirekte Flight muskler (IFMS) er blevet en kraftfuld model til at studere flere aspekter af muskel udvikling11,12. Første, fibrillar Flight muskler er funktionelt og Morfologisk adskiller sig fra rørformede krops muskler11,13, tillader undersøgelse af muskel-typespecifikke udviklingsmekanismer. Transkriptionsfaktorer, herunder spalt Major (Salm)14, extradlole (Exd), og Homothorax (HTH)15 er blevet identificeret som fibrillar skæbne regulatorer. Desuden, nedstrøms for Salm, den CELF1 ligner Bruno1 (Bru1, aret) dirigerer en fibrillar-specifikke splejsning program16,17.

For det andet, IFMS er en vigtig model for at forstå processen med myogenesis selv, fra fremmer fusion og myotube vedhæftet fil til myofibrillogenesis og sarcomere modning9,18,19. For det tredje, Drosophila genetik tillader undersøgelse af bidrag af individuelle proteiner, protein domæner, og protein isoformer til sarcomere dannelse, funktion, og biofysiske egenskaber20,21,22 ,23. Endelig, ifm modeller er blevet udviklet til studiet af flere menneskelige muskellidelser, såsom myotonisk dystrofi, myofibrillar myopatier, muskel degenerative lidelser, aktinopatier, etc.24,25,26 ,27, og har givet vigtig indsigt i sygdomsmekanismer og potentielle terapier28,29,30. Således, Drosophila er en nyttig model til at løse mange åbne spørgsmål i myogenesis felt, herunder mekanismer af muskel-type specifik transskription, splejing, og kromatin forordning, samt til rollen af metabolisme i muskel udvikling. Anvendelsen af moderne omik-teknologier, især i kombination med de mange forskellige genetiske, biokemiske og celle biologiske analyser, der findes i Drosophila, har potentialet til dramatisk at fremme forståelsen af muskel udvikling, aldring og sygdom.

IFMS er de største muskler i flue, spænder næsten 1 mm over hele længden af thorax i voksne31,32. Men denne lille størrelse genererer udfordringen med at få nok prøve til at anvende omik teknologier i Drosophila i en vævstype specifik måde. Desuden er IFMS en del af den voksne muskulatur, der dannes under før etaper. Myoblasts Fuse til dannelse af myotubes, som Fastgør til sener omkring 24 h efter puparium dannelse (APF) og gennemgå et komprimerings trin nødvendigt at initiere myofibrillogenesis omkring 30 h APF (figur 1a-D)18,33, 34.

Den myofibers derefter vokse til at spænde hele længden af thorax, med myofibrils undergår en indledende vækstfase fokuseret på sarcomere tilsætning indtil omkring 48 h APF, og derefter overgår til en modning fase, hvor sarcomeres vokse i længde og bredde og er ombygget til at etablere stretch-aktivering af 72 h APF (figur 1A-D)32,35. Fremkomsten af fiber modning er i det mindste delvist kontrolleret af Salm og E2F32,36,37, og flere ifm-specifikke sarcomere protein isoformer, hvis splejsning styres af Bru1 er indarbejdet i denne fase16,17. Modne fluer eclose fra 90 – 100 h APF. Det betyder, at for at studere muskel udvikling, ifm skal isoleres med tilstrækkelig mængde, kvalitet og renhed fra flere før tidspunkter for at lette analyse ved hjælp af omik tilgange.

Flere protokoller for ifm dissektion er blevet offentliggjort. Mens disse protokoller fungerer godt for deres tilsigtede applikationer, ingen er ideelle til omik tilgange. Protokoller, der bevarer ifm morfologi for immunofluorescens af før og voksne IFMS19, isolere ifm fibre til mekanisk evaluering31, eller udnytte microdissection af før ifm fra cryosektioner38 er for specialiseret og tid og arbejdskraftintensiv til rimeligt at opnå tilstrækkelige mængder af ifm væv for omik applikationer. Andre protokoller er blevet udviklet til hurtig dissektion af specifikt voksne ifm38,39, således ikke gælder for før etaper, og bruge buffere, der ikke er ideelle eller kan være uforenelig med, for eksempel, RNA isolation. Der er således behov for at udvikle nye tilgange til at isolere før ifm til biokemiske eller omik applikationer.

Her præsenterer vi en protokol for dissektion af ifm under før etaper, der er blevet anvendt med succes til mRNA-SEQ analyse fra 16 h APF gennem voksne etaper16,32. Protokollen anvender en grøn fluorescerende protein (gfp) etiket til at identificere IFMS i alle stadier af før og voksen udvikling, så levende dissektion under et fluorescerende dissekere mikroskop. Tilgangen er mindre arbejdskraftintensiv, med et højere gennemløb end eksisterende ifm dissektion-protokoller. Dette giver mulighed for hurtig isolation og Kryopreservation af prøver, genererer nok materiale efter flere runder af dissektion for omik tilgange samt for standard reverse transkriptionen polymerase kædereaktion (RT-PCR) eller Western blotting.

Vi præsenterer protokollen i to dele, viser, hvordan man hurtigt dissekere IFMS både før 48 h APF (under tidlig Metamorphosis, når ifm vedhæftede filer er mere svag) og efter 48 h APF (når før krop plan og ifm vedhæftede filer er veldefinerede). Vi viser, at vi kan isolere høj kvalitet RNA fra dissekeret IFMS på alle tidspunkter og præsentere data om forskellige tilgange til RNA isolation og reverse transskription. Endelig viser vi anvendelsen af dissektion-protokollen til mRNA-SEQ, massespektrometri og RT-PCR ved hjælp af CELF1 ligner Bruno1 som et eksempel. Vi viser misexpression af sarcomere protein isoformer i proteomics data fra Bruno1 mutant IFM og undersøger Bruno1 regulering af C-Terminal Splice hændelse af myosin Heavy Chain (MHC). Disse resultater illustrerer, hvordan omik-data kan give en dybere forståelse af biologiske fænomener, der supplerer genetiske og biokemiske eksperimenter.

Protocol

1. iscenesættelse af Pupae

  1. Løft fluer af den ønskede genotype i flasker (figur 1E). Enten lave en frisk flip af dissektion bestand eller sætte et kryds med mindst 20 kvindelige jomfru fluer. Vedligehold flasker, indtil fluerne begynder at dukke op.
  2. Saml pre-pupae med en furet pensel og Overfør til befuvet filtrerpapir i en 60 mm Petri skål (figur 1F).
  3. Køn pupae, indsamle passende køn for forsøget (figur 1G). Hannerne identificeres ved tilstedeværelsen af testiklerne, som vises som gennemsigtige bolde i den ellers uigennemsigtige Pupa.
  4. Etiketten Petri skålen med tidspunkt, dato og genotype, og derefter alder pupper til den ønskede fase (figur 1H).
    Bemærk: Vedligehold krydser/bestande og alder pupper i en temperaturkontrolleret inkubator (dvs., 25 °c eller 27 °c for RNAi krydser, som øget Gal4 aktivitet ved højere temperaturer øger knock-down effektivitet40). Sørg for, at fugtigheden er tilstrækkelig høj, så pupper ikke tørrer ud, når du ælder flere dage.

2. IFM dissektion før 48 h APF

  1. Saml det nødvendige udstyr, herunder to #5 biologi kvalitet pincet, en pipette, pipettespidser, tøris, og (for RNA-prøver) isolations reagens (Se tabel over materialer). Desuden chill Black dissekere retter (Se tabel over materialer), 1x fosfat-Buffered saltvand (PBS) buffer, og 1,5 ml mikrocentrifuge rør på is.
  2. Ved hjælp af en furet pensel, overførsel iscenesat pupper til en sort dissekere parabol fyldt omkring to tredjedele med kold 1x PBS (figur 2a, B). Flytte til et fluorescerende dissekere mikroskop.
    Bemærk: Brug så mange pupper som kan dissekeret inden for en 30 min tid vindue. Afhængig af erfaring, dette spænder fra 3 – 15 pupae. Se supplerende metoder til diskussion af alternativer til sort dissekere retter.
  3. Brug #5 pincet, skubbe en af pupper til bunden af en sort dissekere parabol og justere mikroskopet zoom og fokus til klart at se Pupa (figur 2C).
  4. Tag fat i den forreste af Pupa med en pincet (figur 2D), og prik derefter pupper med en enkelt spids af de andre pincet lidt off-center i maven, lige bag brystkassen. Dette holder Pupa på plads og forhindrer IFMs i at bevæge sig ind i maven (figur 2E).
    Bemærk: Begynd timing længden af dissektion fra dette punkt, så snart før integritet er forstyrret. Brug en defineret længde af dissektion (for eksempel 20 – 30 min) for at minimere muskeldød og tilhørende transkriptomic og proteomiske forandringer. Dissekere så mange fluer som muligt i denne periode.
  5. Brug de første pincet til at fjerne den forreste halvdel af før-etuiet (figur 2F).
  6. Brug de samme pincet til at knibe den eksponerede pupper lige bag brystkassen, og Adskil maven fra brystkassen (figur 2G).
  7. Brug pincet, klem forsigtigt den forreste del af thorax (for < 35 h APF) eller rip åbne thorax at udsætte fluorescently mærket IFMs (figur 2h). IFMs vil nemt løsne sig fra epidermis, som sene vedhæftede filer på tidlige tidspunkter er skrøbelige. Kassér den resterende slagtekrop ved hjælp af pincet for at skubbe den til den modsatte side af skålen.
  8. Gentagelse af trin 2.3 – 2.7, dissekere yderligere pupae.
  9. Saml ifm fibre med pincet og organisere dem i en bunke i bunden af den sorte dissekere parabol (figur 2I, J). Fjern snavs ved at skubbe det ud af synsfeltet ved hjælp af pincet.
    Bemærk: Med øvelse kan pincet spidser bringes i umiddelbar nærhed uden at røre hinanden. Denne teknik kan bruges til løst grab IFMs uden at ødelægge dem. Alternative metoder omfatter forsigtigt skubbe eller løfte IFMs med en enkelt spids eller helt lukket pincet, eller tage nogle fedt eller andet væv med IFM og fjerne fedt som beskrevet i trin 2,10.
  10. Kvalitetskontrol IFM muskel prøve, ved hjælp af pincet til at fjerne ikke-IFM muskler, fedt, neglebånd, etc. fra prøven (figur 2K, L).
    Bemærk: Med Mef2-Gal4, IFM er mærket mere stærkt end andre muskel typer på tidlige tidspunkter (figur 2k, k '), tillader fjernelse af hoppe muskler og larve muskler baseret på fluorescens intensitet og muskel form. Fedtvæv og neglebånd ser anderledes ud og er ikke mærket med et muskel specifikt fluorescens mærke (figur 2k, k '). Se diskussionsafsnittet for andre Gal4 linjer, der har etiketten IFM.
  11. Ved hjælp af en klippede pipettespids overføres bunken af IFMs til et 1,5 mL mikrocentrifuge glas fyldt med 250 μL kølet 1x PBS (figur 2M-O). Fortsæt straks til afsnit 4.
    Bemærk: IFM-prøverne kan gå tabt ved blot at holde sig til siden af pipettespidsen. Pipette Rings buffer op og ned flere gange, før du samler IFMS kan gøre standard tips mindre klæbrig, og Silikoniseret eller perflumalkoxy (PFA) tips (Se tabel over materialer) med lavere overflade spændinger kan hjælpe med at forhindre prøve tab.

3. IFM Dissection efter 48 h APF

  1. Saml nødvendigt udstyr, herunder to #5 biologi kvalitet pincet, fin saks, standard glas mikroskop slides, dobbelt-stick tape, pipette, pipettespidser, tøris, og (for RNA-applikationer) isolations reagens (Se tabel over materialer). Chill 1x PBS og mikrocentrifuge rørene på is.
  2. Brug en let fugtet pensel til at overføre den iscenesat pupper til en stribe dobbeltklæbende tape, der er monteret på et mikroskopdias (figur 3a). Placer pupper i en linjeorienteret i samme retning (ventral ned og forreste mod bunden af diaset).
    Bemærk: Pas på ikke at bruge for meget vand på pensel eller filter, eller pupper vil ikke holde sig godt. Hvis pupper ikke klæber, skal du tørre dem ved først at overføre til et tørt filter eller silkepapir. Monter så mange pupper som kan dissekeret inden for en 30 min tid vindue, ideelt ~ 10 pupper.
  3. Tag pupaen ud af før-etuiet. Brug pincet til at drille fra hinanden og Åbn før-etuiet over de forreste Spirakler (figur 3B).
  4. Skub forsigtigt et par pincet dorsalt mod den bageste, skære før sagen som pincet flytte (figur 3B '). Vær omhyggelig med ikke at ruptur den underliggende Pupa. Frigør Pupa fra den åbnede sag og overfør det straks til en dråbe 1x PBS på en anden mikroskop slide (figur 3B ", C).
  5. Gentag trin 3,3 og 3,4 for alle pupper i linjen, og indstil derefter dobbelt-stick-tape sliden til side.
  6. Brug den fine saks, skær maven af Pupa væk fra brystkassen og skubbe den i en separat bunke (figur 3d, d '). Gentag for de resterende pupae.
    Bemærk: Begynd at timing længden af dissektion med trin 3,6, så snart før integritet er forstyrret. Dissekere så mange fluer som muligt i 20 – 30 minutter for at forhindre celledød og tilhørende transkriptomic og proteomiske forandringer. Når dissekere 1 d voksne eller > 90 h pupae, er det ofte bekvemt for senere trin til yderligere at fjerne hovedet med den fine saks.
  7. Ved hjælp af et silkepapir, fjerne størstedelen af 1x PBS (generelt overskyet med suspenderet fedt) samt bunken af mave (figur 3E). Tilsæt en dråbe frisk, kølet 1x PBS til de resterende thorakser.
  8. Brug saks til at skære thorax i halve (figur 3f, f ') ved at skære fra hovedet ned i længderetningen krop akse i en enkelt bevægelse. Alternativt, hvis hovedet er blevet fjernet, skal du først indsætte saksen, hvor hovedet var fastgjort og skåret den øverste halvdel af brystkassen langs mellem IFMs. Skær derefter den ventrale side af brystkassen med en anden udskæring i samme retning.
  9. Gentag trin 3,7 og 3,8 for alle pupper, der skal dissekteres, genererer en bunke thorax hemisections nær midten af diaset. Sørg for, at der er nok kølet 1x PBS på diaset, så hemisections ikke tørrer ud.
    Bemærk: Efter 48 h APF, IFMS er store nok til at være synlige under en standard dissekere mikroskop til det uddannede øje. På dette tidspunkt i protokollen, kan muskler med en fluorescerende etiket flyttes til en fluorescerende dissekere anvendelsesområde til støtte i ifm identifikation eller til uddannelsesformål, men dette er ikke nødvendigt.
  10. Dissekere IFMs ud af thorax. Isoler en af hemisections ved hjælp af #5 pincet (figur 3G, H). Sæt forsigtigt spidsen af en tang over og under midten af IFMs (figur 3G ', H '). Mens du holder den første pincet stadig, bruge fine saks til at skære den ene ende af IFM væk fra neglebånd og sener. Derefter skæres den anden ende af IFM fri fra neglebånd (figur 3G ' ', H ' ').
    Bemærk: Afhængigt af orienteringen af thorax efter den første IFM cut, er det nyttigt at rotere thorax 180 °, så den anden IFM cut er lettere at udføre.
  11. Fjern IFM-bundtet fra thorax med pincet (figur 3G ' ', H ' ''), og overfør det til kanten af PBS-boblen for at bruge vand spændingen til at holde den på plads (figur 3i). Skub slagtekroppen til den modsatte side af sliden. Gentag for de resterende thorax hemisections, genererer en samling af dissekeret IFMS.
    Bemærk: Hvis IFMs ikke bo i en pæn bunke, fjerne nogle af 1x PBS med et væv. Vær omhyggelig med ikke at lade alle PBS fordampe og sikre, at de dissekerede IFMs og hemithorakser forbliver dækket af buffer.
  12. Efter dissekere alle IFMS, hurtigt udføre en kvalitetskontrol på dissekeret muskel. Brug #5 pincet til at fjerne eventuelle hoppe muskler eller kutikelfragmenter, der kan have fundet vej ind i prøven (figur 3J-K ' ').
    Bemærk: Hoppe muskel vises anderledes end IFM. Hvis dissekting Mef2-Gal4 mærket muskel under fluorescens, hoppe muskel har en svagere fluorescens og en anden form og tekstur. Under normalt lys, ser det næsten gennemsigtigt, mens IFMs er en uigennemsigtig, mælkeagtig gul (figur 3j-j ' ', K).
  13. Brug vand spænding, Capture (men ikke squish) de dissekeret IFMS mellem et par tang (figur 3L). IFMs overføres til et 1,5 mL mikrocentrifuge glas fyldt med 250 μL kølet 1x PBS (figur 3M). Fortsæt straks med afsnit 4.
    Bemærk: Når pincet spidser bringes i nærheden af hinanden og løftes ud af en buffer løsning, vand spænding forårsager en boble af buffer, der skal fanges mellem pincet tips. Hvis IFMs også er til stede i denne boble, kan de løftes ud af opløsningen og let overføres til en anden buffer fyldt beholder. Det er vigtigt at klemme pincet til at bringe spidserne i nærheden af hinanden uden at røre hinanden, for at undgå Udpresningen væv fanget i buffer boble.

4. pellet og Bevar IFM-prøven

  1. De IFMs-piller ved centrifugering af 1,5 mL-mikrocentrifuge røret i 3 – 5 minutter ved 2.000 x g i en tabel-top centrifuge (figur 4a, B).
  2. Fjern bufferen ved hjælp af en pipettespids (figur 4C).
  3. For RNA-applikationer, resuspension af IFM-pellet i 50 – 100 μL af den ønskede RNA-isolations buffer (Se tabel over materialer, figur 4D). Ellers skal du fortsætte til trin 4,4.
    Bemærk: IFMs kan være tørt-frosset efter trin 4,2 for massespektrometri præparater eller isolering af RNA med kommercielle kits (Se repræsentative resultater). For RNA-applikationer opnås bedre resultater ved straks at opsuspendere og fryse IFM-pellet i isolations buffer.
  4. Fryse prøven på tøris eller snap fryse i flydende nitrogen (figur 4E). Opbevares ved-80 °C, indtil de er klar til efterfølgende trin i prøveforberedelsen til downstream-analyse.
    Bemærk: Efter Kryopreservation kan prøverne opbevares i flere måneder, inden de behandles med henblik på efterfølgende undersøgelser.

Representative Results

Dissektion protokoller præsenteret ovenfor er nyttige til at generere ifm-beriget prøver fra 16 h efter puparium dannelse (APF) indtil voksenstadiet. Dissekeret Flight muskel prøver kan bruges til flere applikationer, og er hidtil blevet anvendt med succes for RT-PCR4,17, RNA-SEQ16,32, ChIP36,37, Western blotting14,41 og massespektrometri eksperimenter (se nedenfor). For at hjælpe potentielle brugere dissekere for RNA-baserede applikationer, præsenterer vi først vores resultater fremhæve vigtige overvejelser specifikt for isolering af RNA fra IFMS. For mere bredt at demonstrere nytten af vores dissektion protokoller, vi derefter illustrere nogle af de mulige-omics applikationer ved hjælp af vores data på RNA-bindende protein Bruno1.

Ifm dissektion protokol giver høj kvalitet RNA

Det er vigtigt at bestemme antallet af fluer, der skal dissekeres på forhånd, da kodning mRNA skønnes at udgøre kun 1 – 5% af total RNA42. Vi opnåede i gennemsnit 24 ± 9 ng af total RNA per fly fra IFM dissekeret fra 1 d voksne (figur 4F og supplerende figur 1a), med udbytter typisk stigende med erfaring. Dette udbytte af total RNA per fly er relativt konstant, svingende omkring 25 ng for IFM dissekeret på 16 h APF, 24 h APF, 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF og 90 h APF (figur 4F og supplerende figur 1b, D, E). Disse observationer afspejler også eventuelle RNA isoleret fra kontaminerende fedt, sener, luftrør eller andre celletyper, som kan være højere i prøver isoleret fra tidligere tidspunkter. Således opnåede vi > 1 μg total RNA fra IFM fra 50 fluer og typisk dissekere IFM fra 100 − 150 fluer for at generere > 3 μg total RNA for RNA-SEQ-prøver.

Metoden til RNA isolation påvirker mængden og kvaliteten af genvundet RNA, og vi opfordrer brugerne til at validere deres isolation tilgang. For eksempel, mens isolation ved hjælp af metode 1 producerer i gennemsnit 1143 ± 465 ng af total RNA fra IFM fra 50 1 d voksne fluer, isolering med forskellige kommercielle kits udbytter overalt fra 186 ± 8 ng til 1261 ± 355 ng af total RNA (figur 4G og Supplerende figur 1C). RNA isoleret fra kommercielle kits er generelt af god kvalitet (figur 4H og supplerende figur 1f), men lave inddrivelser tyder på, at RNA ikke kan effektivt elueret fra kolonnerne. RNA integritet kan også blive kompromitteret ved brug af et kit som gjort i metode 2 (figur 4H, andet plot), sandsynligvis på grund af buffer forfatning og varmebehandlinger, hvilket fører til alvorlig fragmentering, der kan påvirke downstream eksperimenter.

Det er også vigtigt at observere korrekt RNase-fri teknik ved isolering og håndtering af RNA-prøver. Selvom fryse-tø cyklusser og en 4 h stuetemperatur inkubation ikke dramatisk påvirker RNA integritet profiler, selv små mængder af RNase føre til hurtig RNA nedbrydning (figur 4I og supplerende metoder). Brugere opfordres stadig til at arbejde på is og begrænse fryse-tø for at forhindre RNA hydrolyse og fragmentering. Dette blev ikke påvist her, men forebyggelse af RNase kontaminering ved hjælp af filter tips og DEPC-behandlede buffere er absolut nødvendigt.

Effektiviteten af reverse transkriptionen har også indvirkning på downstream-applikternes succes. Vi opnåede pålidelige resultater med to af tre kommercielle RT-kits, som vi testede, som begge forstærker stærke RT-PCR-bånd til ribosomale gene rp49 (figur 4J). Men RT Kit #2 kan være mere følsom for påvisning af lav-udtrykte udskrifter, da vi opnåede stærkere bånd til RNA-bindende protein bru1 for alle tre biologiske replikater (figur 4J). Tilsammen viser disse resultater, at RNA af høj kvalitet kan isoleres fra IFMs dissekeret med denne procedure.

Dissected IFMs producerer mRNA-SEQ-og proteomics-data af høj kvalitet

Ved hjælp af ifm dissekeret i henhold til ovenstående protokol på 30 h APF, 72 h APF og fra 1 d voksne fluer, vi tidligere viste, at RNA-bindende protein og CELF1-homologen Bruno1 (Bru1, anholdelse, aret) styrer en ifm-specifik splejsning vej nedstrøms for transkriptionsfaktor spalt Major (Salm)16. IFMS fra null mutanter samt fluer med muskel-specifikke bruno1 RNAi (bru1-IR) display sarcomere vækst defekter, fejl regulering af myosin aktivitet og i sidste ende hyperkontraktion og tab af muskelfibre16,17 . Nedenfor viser vi nytten af dissekeret IFMS for hele proteom massespektrometri og viser, at flere af de udtryk ændringer, vi observerede på RNA-niveau er også tydelige på Proteinniveau. Vi fremhæver yderligere en specifik udviklingsmæssige Splice-hændelse i MHC , som blev fastlagt som reguleret af Bruno1, og som illustrerer, at mRNA-SEQ og RT-PCR fra dissekeret IFMS kan anvendes til at påvise reguleringen af alternative Splice-hændelser.

Afhængigt af bibliotekets kvalitet og dybde kan mRNA-SEQ-data analyseres på niveauet af genenheder (gennemsnitlige læse tællinger over alle exoner af et gen), individuelle exoner eller Splice-vejkryds. mRNA-SEQ-data fra bru1-IR IFMS sammenlignet med dværg viser svage ændringer i ekspression på genenheds niveau16 (figur 5A). På 72 h APF, der er allerede en tendens for sarcomere gener såsom muskel LIM protein på 60A [Mlp60A], actin 57B [Act57B], muskel-specifikke protein 300 kDa [Msp300], eller Stretchin-Mlck [Strn-Mlck]), der er vigtige for korrekt muskel udvikling til at blive nedreguleret i bru1-IR- musklen (figur 5A og supplerende tabel 1). Men vi har tidligere vist, at på det niveau af individuelle exons, er der en meget stærkere nedregulering af specifikke sarcomere gen isoformer16, hvilket tyder på den vigtigste funktion af Bruno1 er at kontrollere alternative splejset (supplerende tabel 1 ).

Ved hjælp af hel-proteome massespektrometri på dissekeret IFMS, kan vi vise lignende regulering på Proteinniveau (figur 5B og supplerende tabel 2). Af de fundne 1.895 peptidgrupper var 524 (28%) af dem er fejl reguleret i Bru1m2 mutant ifm hos 1 d voksne (supplerende tabel 2). Downregulation af både Strn-Mlck og Mlp60A protein observeres også, matching observationer på udskriften niveau i vores mRNA-SEQ data. På trods af det begrænsede antal database peptider, der kortlægges til specifikke proteinisoformer (Se supplerende metoder til analyse detaljer), for sarcomere proteiner Tropomyosin 1 (Tm1), opretholdt (op/TNT), MHC, Bent (BT/projectin) og Paramyosin (PRM) vi observere docetaxels opregulering af peptider fra en isoform og downregulation af en anden (figur 5B), bekræfter vores tidligere observationer af lignende regulering på RNA-niveau16. Dette viser, at dissekeret IFMS er nyttige for både mRNA-SEQ-og proteomics-applikationer.

Som et yderligere eksempel på, hvordan omik-data kan supplere traditionelle tilgange til at forbedre og udvide biologisk indsigt, valgte vi at fokusere på splejsning ved C-terminalen af MHC. En tidligere karakteriseret protein fælde linje kaldet weeP26 indsættes i den endelige intron af MHC43,44 (Se supplerende metoder til nøjagtig placering). weeP26 indeholder en stærk Splice acceptor og er indarbejdet i formentlig alle MHC udskrifter (figur 5C). Men GFP mærket protein i IFM er indarbejdet i to "prikker" på begge sider af M-linjen, mens i benet muskler, det inkorporerer ensartet på tværs af M-line og svagt på tværs af de tykke tråde (figur 5E). Orfanos og Sparrow viste disse "prikker" i IFM-form på grund af en udviklende MHC isoform-switch: MHC -isoformen udtrykt før 48 h APF er Gfp-mærket som weeP26 exon-skær i den åbne læse ramme, mens MHC - isoform udtrykt efter 48 h APF er uden etiket, da weeP26 exon er inkluderet nedstrøms for stop codon i 3 '-utr44.

Vores mRNA-SEQ-data tillod os at karakterisere C-Terminal MHC isoform udtryk mere detaljeret. Mens der er indberettet to forskellige MHC -afslutninger43,44, tyder vores mRNA-SEQ-data og aktuelle flybase-anmærkning (FB2019_02) på, at man faktisk har tre mulige alternative Splice-hændelser ved MHC - C-Terminus (exon 34-35, 34-36 eller 34-37) (figur 5C), som bekræftes af RT-PCR (figur 5D). weeP26 GFP indsættes i intron mellem exon 36 og 37; således, som både exon 34-35 og exon 34-36 isoformer indeholder stop codons, kan GFP kun oversat i exon 34-37 isoform (resulterende i exon 34-GFP-37). Vi kunne endvidere se både tidsmæssig og geografisk regulering af alle MHC -isoformer. I ifm, vi observere en MHC isoform switch fra exon 34-37 til exon 34-35 mellem 30 h APF og 48 h APF (figur 5C, D, F) ved 27 °c, selv om dette endnu ikke er synlig ved immunofluorescenstest på 48 h APF (figur 5E). Benene udtrykker allerede en blanding af exon 34-37 og exon 34-35 ved 30 h APF, og ved 72 h APF udtrykker alle tre MHC isoformer (figur 5D, F). Voksen hoppe muskel (TDT) udtrykker også alle tre MHC isoformer (figur 5F), hvilket tyder på dette er generelt sandt for tubulære somatiske muskler. Således giver vores mRNA-SEQ-data mulighed for forlængelse af tidligere fund ved at indsnævre tidsrammen for MHC isoform-kontakten i ifm og karakterisering af MHC isoform i rørformede muskler.

MHC isoform regulering i Salm og bru1 mutant ifm blev derefter undersøgt. I begge tilfælde så vi fejl regulering af weeP26. Salm mutant IFMS undlader at fuldføre den udviklingsmæssige switch i MHC isoform udtryk og phenocopy ben splejsning mønstre på senere stadier, herunder gevinst af exon 34-36 begivenhed (figur 5F). Dette er enigt med tidligere fund, at tab af Salm resulterer i en nær-komplet skæbne omdannelse af IFM til tubulær muskel16. Bru1-IR og Bru1 mutant ifm, svarende til Salm-/- ifm, bevarer exon 34-37 Splice-hændelsen gennem voksne stadier (figur 5E, F), hvilket resulterer i et weeP26 gfp-mærknings mønster, der ligner benmusklen, men det får ikke exon 34-36-arrangementet. Dette tyder på, at Bruno1 er nødvendig i ifm til i det mindste delvis at kontrollere den udviklingsmæssige switch i MHC alternative splejsning, men det tyder på, at yderligere splejnings faktorer også er fejl reguleret i Salm-/-kontekst. Dette eksempel illustrerer desuden, hvordan RT-PCR-og mRNA-SEQ-data fra dissekeret IFM kan være værdifulde med hensyn til at opnå en dybere forståelse af udviklingsmæssige splejnings mekanismer og observerede morfologiske defekter.

Figure 1
Figur 1: ifm udvikling og iscenesættelse af pupae. (A) skematisk af ifm udvikling på 24 h apf, 32 h apf, 48 h apf, 72 h APF, og 1 d voksne viser komprimering af Flight muskler (grøn) på ~ 32 h APF og efterfølgende fiber vækst til at fylde brystkassen. Sener er i mørkegrå. (B) konfokale billeder af faste IFMS fra åbne bog dissektioner (24 h, 32 h, 48 h)19 eller thorax hemisections (72 h, 1 dag) plettet for actin (rhodamine phalloidin, magenta) og gfp (grøn). (C, D) Billeder af GFP fluorescens i levende pupper, som illustrerer intakt IFM morfologi af dissektions flue linjen i dorsale (C) eller lateral (D) plane. Asterisks Mark IFM-placering. (E) for at forberede dissektioner, bør flyve bestande vendes eller krydser sæt 3 – 4 dage i forvejen. F) prepupae udvælges efter deres hvide farve (gule pilespidser) og isoleres ved hjælp af en vådpensel (f ', f ' '). (G) prepupae bør sexed til at adskille hunner fra mænd baseret på tilstedeværelsen af testikler, der vises som bagtil placeret gennemsigtige bolde (gule asterisker). (H) pupae er lagret på befuget filtrerpapir i 60 mm retter. Skala stænger = 100 μm (B), 1 cm (C, D, E, H), 1 mm (F, F ' ', G). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: dissektion af ifms før 48 h APF. A) tilsætning af 1x PBS-buffer til en sort dissekere-skål med en overførings pipette. (B) overførsel af iscenesat pupper ved hjælp af en pensel. (C) under et fluorescerende dissekere mikroskop til at visualisere gfp, blid skubbe Pupa til bunden af en dissekere parabol ved hjælp af #5 pincet (skitseret i grå). "X" i en cirkel betegner bevægelse i billedet. (D, E) Grasping af pupper anteriorly (D), derefter poking af pupper lige bag thorax (E). Dash i en cirkel betegner ingen bevægelse. (F, G) Trække med forreste pincet (pil) for at fjerne før tilfælde (F), derefter fjernelse af maven (G). H) gentagelse af C-G for flere Pupa. Gule punkterede linjer nummereres som medvirkende pupae. (I, J) Brug af pincet (I) til at isolere IFMs fra det omgivende væv (J). Prik i en cirkel angiver bevægelse ud af siden. (K, L) Fjernelse af forurenende stoffer, herunder fedt og hoppe (TDT) muskler (K) til at generere en ren IFM prøve (L). TDT har et lavere GFP-udtryk og en anden form end IFM-fibre (K '). (M, N, O) Brug af en klippede pipettespids (M) til opsamling af dissekeret IFMs (N) og overførsel til et mikrocentrifuge glas (O). Skala stænger = 1 cm (A, B, M, O), 1 mm (C-G), 500 μm (H-L, N). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: dissektion af ifms efter 48 h APF. (A) justering af pupper på dobbelt-stick tape. B) fjernelse af pupper fra før-etuiet ved åbning af anteriorly (b), skæring af sagen dorsalt (b ') og ophævelse af Pupa (b ' '). Cirkel symbolerne repræsenterede det samme som figur 2. C) overførsel af pupper til buffer. D) fjernelse af maven ved skæring med sakse (gule dobbeltpil) og adskillelse fra thorakserne (d '). (E, F) Tilsætning af ren buffer (E) og derefter skæring af thorakler i halv længde (f, f '). (G, H) Dissektioner kan udføres under hvidt lys (G) eller fluorescens for at visualisere GFP (H); skæring af IFMs på den ene side (G '), derefter den anden side (G ' '); løft ud af brystkassen med pincet (skitseret i gråt) (G ' ' '). (I, J, K) Indsamling af IFMs i buffer (I) og fjernelse af kontaminerende ventrale nerveledning (VNC), Gut, og hoppe muskel (TDT) (J) at generere en ren IFM prøve (K). TDT har et lavere GFP-udtryk og en anden form end IFM-fibre (J ' ', K '). (L, M) Brug af pincet til at overføre IFMs (L) til et mikrocentrifuge glas (M). Skala stænger = 1 cm (A, E, M), 1 mm (B-D ', F-L). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: oplysninger om ifm-bevaring og RNA-isolering. A) IFMS er pelleteret ved centrifugering i 5 min. ved 2000 x g. B) ifm pellet (pil) og pellet under fluorescens (b '). C) fjernelse af al buffer med pipettespids. D) til RNA-ekstraktion, opblanding af pellet i isolations buffer. Dette trin kan springes over til tørfryse dissekeret IFMS. E) frysning af prøven i flydende nitrogen eller på tøris og oplagring ved-80 °c. Skala stænger = 10 cm (A), 1 mm (B, B '), 1 cm (C, D, E). F) nanogrammer (ng) af totalt RNA fra DISSEKERET ifm opnået pr. fly ved 16 h APF, 24 h APF, 30 h apf, 48 h apf, 72 h apf, 90 h APF og 1 d voksen. Fejllinjer = SD. (G) totalt RNA isoleret fra ifm dissekeret fra 50 1 d voksne fluer ved hjælp af forskellige ekstraktionsmetoder. Fejllinjer = SD. (H) repræsentative spor til kvantitativ RNA-integritet efter forskellige ekstraktionsmetoder. De ribosomale bands kører lige under 2000 nukleotider (NT) og markerings båndet ved 25 NT. yderligere spor tilgængelige i supplerende figur 1. I) repræsentative spor af en frisk isoleret RNA-prøve (top), en prøve fryse optøet 25x på tøris (andet plot), en prøve, der er tilbage i 4 timer på bænken (tredje plot), og en prøve behandlet med RNase a (bund plot). Bemærk fuldstændig nedbrydning af RNA ved tilsætning af RNase A. (J) RT-PCR gel fra kits som mærket for bru1 og rp49. Den relative intensitet af bru1 -båndet normaliseret mod rp49 afbildes nedenfor. Fejllinjer = SEM (ikke-parret t-test, p = 0,0119). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: anvendelse af ifm dissektioner til at undersøge Bruno1 funktion i alternative splicing. A) vulkan plot af mRNA-SEQ-data (genenhed) fra IFMS dissekeret ved 72 h APF. Gener, der er væsentligt differentieret mellem bru1-IR og dværg ifm (padj < 0,05, ABS (log2FC) > 1.5), er vist med blåt og ikke-signifikante gener i gråt. Sarcomere proteiner er fremhævet med rødt, og vælg gener er mærket. (B) vulkan plot af hele proteom massespektrometri resultater fra 1 d voksne IFMS. Proteiner signifikant forskellige mellem brum2mutanter og dværg (FDR < 0,05) er vist med blå, ikke-signifikante proteiner i grå. Sarcomeriske proteiner er fremhævet med rødt. Peptider svarende til gener i (A) er mærket med rødt. Sæt af peptider kortlægning til forskellige isoformer af samme protein er mærket i samme farve. C) ordning for c-endestation for MHC , som illustrerer særskilte transskriptionsisoformer og indsættelses placering af weeP26 -Genfælden (Se supplerende metoder til indsætningspunktet). RT-PCR primere er angivet som sorte streger over udskrifter. Læs antal pr. kilo base pr. million baser (rpkm) fra mRNA-SEQ er vist for IFMS dissekeret fra dværg ved 30 h APF (orange) og 72 h APF (rød), fra bru1-IR (blå) og Salm-/- (cyan) ved 72 h APF og fra hele benet (grøn) ved 72 h APF . D) RT-PCR med primere mod MHC , der viser ISOFORM kontakten i ifm mellem 30 h APF og senere tidspunkter. Exon 34-35 Splice-hændelsen er kun svagt observeret i bruM3mutant ifm eller i voksen benet. (E) konfokale billeder af weeP26 gfp lokalisering i dværg ifm sarcomeres på 48 h APF og 90 h APF sammenlignet med 90 h APF ben muskel. Skala stænger = 1 μm.f) Splice-vejkryds kvantificering fra mRNA-SEQ-data for genotyper og tidspunkter som mærket. Junction læsninger præsenteres som forholdet mellem en specifik Splice begivenhed (exon 34 til 35 i grå, 34 til 36 i lilla, og 34 til 37 i grøn) til det samlede antal begivenheder, der deler exon 34 Splice donor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplemental Figure 1
Supplerende figur 1: (a, B, C) RNA-udbytter fra prøver af samme genotype dissekeret af den samme forsker i samme uge. Efter at alle prøver blev dissekeret, blev RNA isoleret og målt samme dag. A) Nanogrammer (ng) af totalt RNA opnået fra IFM-dissektioner pr. 1 d voksen flue. Fejllinjer = SEM. B) totalt RNA opnået fra dissekeret IFM pr. fly ved 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF og 1 d voksen. C) totalt RNA isoleret fra IFM dissekeret fra 50 1 d voksne fluer med forskellige ekstraktionsmetoder. D) totale RNA-koncentrationer pr. flyvning fra dissekeret ben, hoppe muskulatur (TDT) og ifm. Mere RNA er opnået fra de større IFMs. Fejllinjer = SD. (E) totale RNA-koncentrationer pr. flue af ifm dissekeret fra kontrol sammenlignet med RNAi eller mutant prøver ved 30 h APF, 72 h APF og 1 d voksen. For mutanter blev w1118 brugt som dværg kontrol. Mutant data er kompileret fra bru1-IR, Salm-/- og en anden RNA-binding protein mutant. Bemærk, at for disse manipulationer er RNA-udbyttet faldet i 1 d voksen på grund af muskelatrofi og tab, så flere fluer skal dissekteres for at opnå tilstrækkelige mængder til omik tilgange. Fejllinjer = SD.f) yderligere spor, der viser RNA-INTEGRITETEN for RNA-isolations metoderne vist i figur 4G og i supplerende figur 1c. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplemental Methods
Supplerende metoder: En detaljeret beskrivelse af de metoder og reagenser, der anvendes i hele teksten, og navnlig for at frembringe de data, der er vist i figur 1A-D, figur 4F-K, figur 5, supplerende tabel 1, og Supplerende tabel 2. Disse data motiverer dissektion-protokollen og demonstrerer dens anvendelighed til RNA-isolation, mRNA-SEQ, RT-PCR og proteomics. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Relateret til figur 5 og tilhørende afsnit i hovedteksten
Fanenavn Data oversigt
Sarcomere proteiner Liste over sarcomere gener fra Spletter et al. Elife 2018; Her liste vi den nuværende FBgn og gen navn.
SP-gen units_DESeq2_72h Ved hjælp af data fra Spletter et al. EMBO rep 2015, vi kiggede specifikt på sarcomere gener i mRNA-SEQ data på 72 h APF. Dette er fra DESeq2 analyse, der detekterer differentialekspression på genenheds niveau mellem kontrol (Mef2-Gal4, UAS-GFM-GMA krydsede til w1118) og Mef2-Gal4, UAS-GFM-GMA x Bruno1-IR. Rækker fremhævet med gult er betydeligt op eller ned regulerede gener (over/under en tærskel på log2FC = ABS (1.5)). Disse data er den røde prik-overlejring i figur 5A. For hvert sarcomere-gen leverer vi identifikationsoplysninger, log2FC fra DESeq2, P-værdi og justeret P-værdi samt DESeq2 normaliseret ekspressions tælling.
SP exon_DEXSeq_72h Ved hjælp af data fra Spletter et al. EMBO rep 2015, vi kiggede specifikt på sarcomere gen exon brug i mRNA-SEQ data på 72 h APF. Dette er fra DEXSeq analyse påvisning differential exon brug mellem kontrol (Mef2-Gal4, UAS-GFM-GMA krydsede til w1118) og Mef2-Gal4, UAS-GFM-GMA x Bruno1-IR. Rækker fremhævet med gult er betydeligt op eller ned regulerede exons (over/under en tærskel på log2FC = ABS (1.5)). Vi leverer exon og genidentifikations oplysninger, log2FC fra DEXSeq, P-værdi og justeret P-værdi samt en liste over tilknyttede udskrifter.
Bemærk venligst, at mange gener viser regulering af en eller flere exoner i DEXSeq-analysen, ofte med høje log2FC værdier og lav P-værdi/Juster P-værdier, mens en begrænset liste over gener viser ændringer ved 72 h APF. Dette understøtter en stærk effekt af tab af Bruno om reguleringen af alternative splicing.

Supplerende tabel 1: tabel over 72 h APF mRNA-SEQ-data for sarcomere-proteiner, som identificerer differentielt udtrykte gener (via DESeq2) og exon (via dexseq) i bru1-IR vs. dværg IFMS.

Relateret til figur 5B og tilhørende afsnit i hovedteksten
Fanenavn Data oversigt
Perseus udgang Dette er et forarbejdet data regneark præsenterer massespektrometri data, der anvendes til at generere figur 5B. IFM prøver er fra 1 d voksen kontrol (w1118) og mutant (bruno1-m2) fluer. Vigtige kolonner er de transformerede intensitetsværdier for hver af de 4 replikater for hver prøve, t-test statistikken og signifikans, peptidids og tilsvarende gennavne og flybase-id'er. Signifance blev beregnet ved hjælp af standardindstillinger i Perseus (FDR <. 05). Der er påvist 1859 proteiner/peptider, hvoraf 524 (28%) er signifikant forskellige mellem prøverne.
Nedreguleret Disse er alle 252 proteiner/peptider fra Perseus output, der er nedreguleret i bruno1-m2 mutant IFM. Da flybase-id'erne og gennavnene er forældede, leverer vi desuden det aktuelle flybase-genid og gennavn.
Upregulated Disse er alle 272 proteiner/peptider fra Perseus output, der er upregulated i bruno1-m2 mutant IFM. Da flybase-id'erne og gennavnene er forældede, leverer vi desuden det aktuelle flybase-genid og gennavn.
Bemærk venligst, at sarcomere-proteinerne, der er fremhævet med rødt i figur 5B, findes i ovenstående lister. Listen over gener, der betragtes som en del af sarcomere, findes under en af fanerne i supplerende tabel 1.

Supplerende tabel 2: tabel over hele proteom massespektrometri data fra 1 d voksen, som identificerer differentielt udtrykte proteiner og proteinisoformer i brum2mutant vs. dværg IFMS.

Discussion

I denne protokol præsenterer vi den grundlæggende teknik til dissekere Drosophila IFMS fra tidlig og sene pupper til nedstrøms isolering af protein, DNA, RNA eller andre makromolekyler. Protokollen kan let tilpasses til dissekere IFM fra voksne fluer. Vi demonstrerer nytten af vores dissektion-protokol for mRNA-SEQ-, proteomics-og RT-PCR-applikationer. Med den kontinuerlige forbedring af omik teknologier for at muliggøre analyse af prøver med mindre udgangsmateriale og lavere input koncentrationer, vil disse dissektioner sandsynligvis blive værdifulde for mange ekstra applikationer. Da IFMS er en etableret model for human myopatier4,24 og muskel-type specifik udvikling9,12, vi forestiller, for eksempel, ifm-beriget metabolomics, undersøgelser af kromatin konstellation via 3c eller 4c, splejsning netværk evaluering via CLiP interaktioner eller phospho-proteomics af myofibrillogenesis.

Det er vigtigt at overveje, at dissektionerne fremstiller en prøve beriget til IFM i stedet for en ren IFM-prøve. Dette er uundgåeligt på grund af motorisk neuron innervation, sene vedhæftede filer og trakeal invasion af muskelfibre. Bioinformatik analyse kan bruges til at identificere IFM-berigede gener eller proteiner, men der kræves yderligere eksperimenter for at påvise, at de faktisk er IFM-specifikke. Prøvens renhed kan prøves ved hjælp af publicerede vævsspecifikke markører såsom Stripe45 (Tendon), Act79B4,44 (tubulær muskel), Act88F15 (ifm) eller Syb46 (neuronal specifik). Det kan være muligt at bruge sådanne markører til at normalisere datasæt til IFM-specifikke indhold, men brugere er advaret om, at tidsmæssige ændringer i ekspression af gener, der anvendes til normalisering, for eksempel af IFM-specifikke gener eller Tubulin, kan bias en sådan tilgang.

Genetisk kodede vævsspecifikke mærkningsmetoder, for eksempel EC-tagging47,48 eller pabp-mærkning49,50 for isolerende RNA er blevet udviklet i de seneste år, hvilket kan bidrage til at opnå en virkelig vævs specifik RNA-prøve. Men EF-mærkning kræver konstant fodring af fluer47 og dermed ikke anvendes under før etaper. De PABP-mærkede transkriptomes følsomhed og fuldstændighed kan have begrænsninger51. FACS tilgange til at isolere individuelle muskelfibre er kompliceret af den store størrelse og syncytial karakter af IFMs. Intakt52,53 stil tilgange kan anvendes til at isolere specifikke subcellulære-rum fra IFMS, hvilket kan vise sig nyttigt til isolering af rene populationer af ifm kerner eller mitochondrier. Manuelle dissektioner er stadig den nuværende standard for at opnå intakt IFM-væv for de fleste downstream-applikationer.

Prøve kvaliteten afhænger af flere kritiske trin i dissektions processen. Dissektionerne er teknisk krævende, med dissektion hastighed og prøve renhed stigende med erfaring. Dissekting i korte perioder (20 – 30 min) i kølet buffer uden rengøringsmiddel og straks frysning hjælper med at bevare prøvens integritet, som tidligere er observeret for mus sene isolation54. IFMs kan med held tørre-frosne efter fjernelse af alle buffer fra pellet, men specielt for RNA isolation, frysning prøver i isolation buffer tendens til at producere bedre resultater. IFMS fra op til 20 separate dissektioner kombineres før RNA eller protein isolation, tillader opskalering og indsamling nok materiale, selv fra tidlige tidspunkter eller mutanter16,32, til downstream-analyse.

For RNA-applikationer kan det mest kritiske trin være isoleringen af selve RNA. Guanidinium thiocyanat-phenol-chloroform isolation (metode 1 ovenfor) overgår de fleste kommercielle kits testet og, som tidligere bemærket, er betydeligt billigere55. Variabiliteten observeret i RNA-isolations udbyttet med kommercielle kits er i forståelse med tidligere observationer56,57. Vi tilføjer yderligere glykogen under isopropanol nedbør for at hjælpe genvinde alle RNA. Ud over RNA-udbyttet er det vigtigt at verificere RNA-integriteten for at sikre, at prøven ikke er blevet fragmenteret eller forringet under dissektions-og isolations processerne. Det er også vigtigt at arbejde RNase-fri. Endelig kan valget af RT-kit påvirke følsomheden af den omvendte transskription proces. Selv om de ikke ofte drøftes i detaljer, påvirker alle disse punkter kvaliteten af IFM-prøven og de data, som er indhentet fra downstream-ansøgningerne.

Flere vigtige ændringer sætter protokollen ud over eksisterende ifm dissektion-protokoller. Selv om en detaljeret dissektion protokol for ifm immunofluorescenstest findes19, denne protokol præsenterer en anden tilgang til før dissektioner, der giver mulighed for hurtigere isolering af ifm væv. Dette gør det muligt at indsamle store mængder ifm-væv (relativt set) med begrænsede dissektions tider for at forhindre, at proteom eller transkriptomer ændres. Andre protokoller beskriver dissektion af voksen ifm til visualisering af gfp-farvning i individuelle myofibrils39 eller til farvning af larve legeme-vægmuskler58, men de løser ikke dissektion i før stadier eller isolering af RNA eller protein. Denne fremgangsmåde adskiller sig også fra den eksisterende protokol for microdissection af før IFMS fra cryosektioner38, som kan generere en renere ifm prøve, men er mere arbejdskraftintensiv og producerer mindre materiale. Sammenlignet med andre hurtige voksne ifm dissektion-protokoller38,39, er IFMS isoleret i PBS-buffer uden rengøringsmiddel for at begrænse stress induktion og andre større udtryks ændringer.

Det vigtigste frem trin i denne protokol er medtagelsen af en levende, fluorescerende reporter, tillader isolering af IFMS på tidlige før etaper. Vi bruger indføre Mef2-GAL459 kørsel enten UAS-CD8:: gfp eller UAS-gfp:: GMA60. Dette tillader differentiel mærkning af ifm (Flight muskler er mere stærkt mærket og forskelligt formet end andre før muskler) samt ydeevne af GAL4-UAS-baserede manipulationer, for eksempel redning eller RNAi eksperimenter. Det er også muligt at kombinere Mef2-GAL4 med tub-GAL80TS for at undgå RNAi-associeret tidlig dødelighed eller med UAS-Dcr2 for at øge RNAi Efficiency40.

Der er yderligere GAL4 drivere eller gfp-linjer til rådighed, der varierer i muskel-type specificitet, temporale udtryk mønster, og føreren styrke19,61 der kan anvendes i stedet for Mef2-GAL4. For eksempel, Act88F-GAL4 er først udtrykt omkring 24 h APF, så det kan ikke bruges til tidligere tidspunkter; Men, det kraftigt mærker IFM og kan være nyttigt at undgå RNAi-associeret tidlig dødelighed. Ham-gfp eller Act88F-GFP label ifm, igen med tidsmæssige begrænsninger, men de undgår GAL4 afhængighed af markør udtryk og kan være nyttige i kombination med en mutant baggrund af interesse. Lister over andre mulige markør linjer er tilgængelige19. Det skal også bemærkes, at brugen af transgener og GAL4/UAS systemet kan forårsage genekspression artefakter, så det er vigtigt at bruge passende Kontroller, for eksempel føreren linje krydset til Wild-type baggrunds stamme, således at sådanne artefakter er formentlig det samme i alle prøver.

Med den medfølgende video, denne detaljerede protokol har til formål at gøre før ifm dissektion mere tilgængelig og fremme brugen af omik tilgange til at studere muskel udvikling. Kobling af kraften i Drosophila genetik og cellebiologi med biokemi og omik assays tilgængelige gennem dissekeret ifm har potentiale til at fremme mekanistisk forståelse af myogenesis og muskelfunktion. Fremtidige undersøgelser, der forbinder system-niveau observationer af transkriptomer og proteom regulering til metaboliske og funktionelle udgange vil give en dybere forståelse af muskel-type specifik udvikling og patogenesen af muskellidelser.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for Andreas Ladurner og Frank Schnorrer for generøs støtte. Vi takker Sandra esser for fremragende teknisk assistance og Akanksha Roy for at generere massespektrometri data. Vi anerkender Bloomington og Vienna Stock Centers for at levere fluer. Vi takker Core Facility bioimaging for hjælp med konfokale Imaging og zentrallabor für proteinanalytik til analyse af massespektrometriske prøver, både på LMU Biomedical Center (Martinsried, de). Vores arbejde blev støttet af Deutsche Forschungs Gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), Center for Integrated protein Science Munich (CIPSM) på Ludwig-Maximilians-University München (MLS), Frederich-Bauer Stiftung (MLS), og den internationale Max Planck Research School (EN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5x High Fidelity (HF) buffer Thermo Fisher F518L
60 mm culture dishes Sigma-Aldrich Z643084-600EA Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented
Black dissecting dish (glass) Augusta Laborbedarf 42021010 Lymphbecken, black glass, 4 cm x 4 cm
Black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder Sigma-Aldrich C9157 Also available from most pharmacies
Black silicon dissecting dishes: Sylgard 184 Sigma-Aldrich 761036 Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes).
Blue pestle Sigma-Aldrich Z359947-100EA Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder
Cell phone camera, Samsung Galaxy S9 Samsung SM-G960F/DS used for photos not taken under a microscope
Chloroform PanReac AppliChem A3691,0500
Confocal microscope, Leica SP8X upright confocal Leica www.leica-microsystems.com
Confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal Zeiss www.zeiss.com
Double stick tape Scotch/3M 3M ID 70005108587 Double-sided tape, available at most office supply handlers
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 mm x 0.02 mm tip
EtOH (100%, RNase free) Sigma-Aldrich 32205-M
fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera Leica www.leica-microsystems.com
Fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0 Leica www.leica-microsystems.com
Fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC Leica www.leica-microsystems.com
Fly: Bru1[M2] Fly stock; This paper
Fly: Bru1[M3] Fly stock; This paper
Fly: Mef2-GAL4 Bloomington Stock Center BDSC:27390 Fly stock
Fly: salm[1] Bloomington Stock Center 3274 Fly stock
Fly: salm[FRT] Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018
Fly: UAS-Bru1IR Vienna Drosophila Research Center GD41568 Fly stock, RNAi hairpin
Fly: UAS-GFP::Gma Bloomington Stock Center BDSC:31776 Fly stock
Fly: UAS-mCD8a::GFP Bloomington Stock Center BDSC:5130 Fly stock
Fly: w[1118] Bloomington Stock Center 3605 Fly stock
Fly: weeP26 Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003
GFP detection reagent, GFP-Booster ChromoTek gba488-100
Glycogen Invitrogen 10814-010
Image processing software, Photoshop CS6 Adobe www.adobe.com
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516-25ML 2-propanol
Method 1 (RNA isolation): TRIzol Life Technologies 15596018 Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution
Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit Invitrogen AM1907 TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA
Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit Zymo Research R2070S RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.
Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.
Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System Promega Z6110 We applied the protocol for ‘Purification of RNA from Fibrous Tissues’.
Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit New England Biolabs T2010G We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 μL of RNA Protection Reagent.
Microcentrifuge tubes Thermo Fisher AM12400 RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL
Microscope slides Thermo Fisher 12342108 Standard slides, uncharged, 1 mm
Microtome blades PFM Medical 207500003 C35 feather 80 mm
Monarch DNase I New England Biolabs T2004-21
Monarch DNase I Reaction Buffer New England Biolabs T2005-21
Normal goat serum Thermo Fisher 16210072
OneTaq Polymerase New England Biolabs M0480X
Paintbrush Marabu 1910000000 Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PBS buffer (1x) Sigma-Aldrich P4417 Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4
PFA PureTip Pipette Tips Elemental Scientific ES-7000-0101 Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice
Phusion High Fidelity Polymerase Thermo Fisher F-530XL
Pipette tips Sigma-Aldrich P5161 Universal 200 mL pipette tips
Preomics iST 8x Kit Preomics P.O.00001 peptide preparation kit for mass spectrometry
Q Exactive mass spectrometer Thermo Fisher 725500 mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center
Qubit RNA Assay Kit Life Technologies Q32855
Rhodamine-phalloidin Invitrogen, Molecular Probes 10063052
RNA concentration Approach 1 & RNA integrity traces, Bioanalyzer Agilent Technologies G2939BA
RNA concentration Approach 2, Nanodrop Thermo Fisher ND-2000
RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer Invitrogen Q33238
RNA Pico Chips Agilent Technologies 5067-1513
RNase A Promega A7937
RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758 DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.
RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit Invitrogen 18080-044 reverse transcription kit
RT Kit #2: LunaScript New England Biolabs E3010S reverse transcription kit
RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit Qiagen 205410 reverse transcription kit
Slide mounting buffer, Vectashield Vector Laboratories H-1200 containing DAPI
Statistical software: GraphPad Prism GraphPad Prism www.graphpad.com
Statistical software: Microscoft Excel Microsoft Purchased as part of the bundle: Office Home & Student 2019
Table-top centrifuge Eppendorf 5405000760 Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent
Tissue/ Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956 Standard tissue wipes
Transfer pipette Sigma-Aldrich Z350796 Plastic pipette
Triton-X100 Sigma-Aldrich T9284-500ML
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-00 3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm
Whatman paper Sigma-Aldrich 1004-070 Filter paper circles, Grade 4, 70 mm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rexiati, M., Sun, M., Guo, W. Muscle-Specific Mis-Splicing and Heart Disease Exemplified by RBM20. Genes. 9 (1), 18 (2018).
  2. Guo, W., et al. RBM20, a gene for hereditary cardiomyopathy, regulates titin splicing. Nature Medicine. 18 (5), 766-773 (2012).
  3. Guo, W., et al. Splicing Factor RBM20 Regulates Transcriptional Network of Titin Associated and Calcium Handling Genes in The Heart. International Journal of Biological Sciences. 14 (4), 369-380 (2018).
  4. Nikonova, E., Kao, S. -Y., Ravichandran, K., Wittner, A., Spletter, M. L. Conserved functions of RNA-binding proteins in muscle. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 110, 29-49 (2019).
  5. Wang, E. T., et al. Dysregulation of mRNA Localization and Translation in Genetic Disease. The Journal of Neuroscience. 36 (45), 11418-11426 (2016).
  6. Wang, E. T., et al. Antagonistic regulation of mRNA expression and splicing by CELF and MBNL proteins. Genome Research. 25 (6), 858-871 (2015).
  7. Kalsotra, A., et al. A postnatal switch of CELF and MBNL proteins reprograms alternative splicing in the developing heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20333-20338 (2008).
  8. Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. The EMBO Journal. 23 (15), 3103-3112 (2004).
  9. Lemke, S. B., Schnorrer, F. Mechanical forces during muscle development. Mechanisms of Development. 144, Pt A 92-101 (2017).
  10. Iwamoto, H. Structure, function and evolution of insect flight muscle. Biophysics. 7, 21-28 (2011).
  11. Schnorrer, F., Dickson, B. J. Muscle building; mechanisms of myotube guidance and attachment site selection. Developmental Cell. 7 (1), 9-20 (2004).
  12. Spletter, M. L., Schnorrer, F. Transcriptional regulation and alternative splicing cooperate in muscle fiber-type specification in flies and mammals. Experimental Cell Research. 321 (1), 90-98 (2014).
  13. Benoist, P., Mas, J. A., Marco, R., Cervera, M. Differential muscle-type expression of the Drosophila troponin T gene. A 3-base pair microexon is involved in visceral and adult hypodermic muscle specification. Journal of Biological Chemistry. 273 (13), 7538-7546 (1998).
  14. Schönbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
  15. Bryantsev, A. L., et al. Extradenticle and Homothorax Control Adult Muscle Fiber Identity in Drosophila. Developmental Cell. 23 (3), 664-673 (2012).
  16. Spletter, M. L., et al. The RNA-binding protein Arrest (Bruno) regulates alternative splicing to enable myofibril maturation in Drosophila flight muscle. EMBO Reports. 16 (2), 178-191 (2015).
  17. Oas, S. T., Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Arrest is a regulator of fiber-specific alternative splicing in the indirect flight muscles of Drosophila. The Journal of Cell Biology. 206 (7), 895-908 (2014).
  18. Kim, J. H., Jin, P., Duan, R., Chen, E. H. ScienceDirect Mechanisms of myoblast fusion during muscle development. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 162-170 (2015).
  19. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), San Diego, Calif. 2-14 (2014).
  20. Rai, M., Nongthomba, U., Grounds, M. D. Skeletal Muscle Degeneration and Regeneration in Mice and Flies. Mechanisms of Regeneration. 108, Elsevier Inc. 247-281 (2014).
  21. Swank, D. M., Wells, L., Kronert, W. A., Morrill, G. E., Bernstein, S. I. Determining structure/function relationships for sarcomeric myosin heavy chain by genetic and transgenic manipulation of Drosophila. Microscopy Research and Technique. 50 (6), 430-442 (2000).
  22. de Joussineau, C., Bataillé, L., Jagla, T., Jagla, K. Diversification of muscle types in Drosophila: upstream and downstream of identity genes. Current Topics in Developmental Biology. 98, 277-301 (2012).
  23. Maqbool, T., Jagla, K. Genetic control of muscle development: learning from Drosophila. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 28 (7-8), 397-407 (2008).
  24. Jagla, K., Kalman, B., Boudou, T., Hénon, S., Batonnet-Pichon, S. Beyond mice: Emerging and transdisciplinary models for the study of early-onset myopathies. Seminars in Cell & Developmental Biology. 64, 171-180 (2017).
  25. Haigh, S. E., et al. Drosophila indirect flight muscle specific Act88F actin mutants as a model system for studying congenital myopathies of the human ACTA1 skeletal muscle actin gene. Neuromuscular Disorders. 20 (6), 363-374 (2010).
  26. Batonnet-Pichon, S., et al. Myofibrillar Myopathies: New Perspectives from Animal Models to Potential Therapeutic Approaches. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (1), 1-15 (2017).
  27. Kreipke, R. E., Kwon, Y. V., Shcherbata, H. R., Ruohola-Baker, H. Drosophila melanogaster as a Model of Muscle Degeneration Disorders. Current Topics in Developmental Biology. 121, 83-109 (2017).
  28. Souidi, A., Zmojdzian, M., Jagla, K. Dissecting Pathogenetic Mechanisms and Therapeutic Strategies in Drosophila Models of Myotonic Dystrophy Type 1. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4104 (2018).
  29. Sparrow, J., Hughes, S. M., Segalat, L. Other Model Organisms for Sarcomeric Muscle Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 642, 192-206 (2008).
  30. Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 1184, 1-20 (2010).
  31. Swank, D. M. Mechanical analysis of Drosophila indirect flight and jump muscles. Methods. 56 (1), 69-77 (2012).
  32. Spletter, M. L., et al. A transcriptomics resource reveals a transcriptional transition during ordered sarcomere morphogenesis in flight muscle. eLife. 7, 1361 (2018).
  33. Weitkunat, M., Kaya-Çopur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle. Current Biology. 24 (7), 705-716 (2014).
  34. Gunage, R. D., Dhanyasi, N., Reichert, H., VijayRaghavan, K. Drosophila adult muscle development and regeneration. Seminars in Cell & Developmental Biology. 72, 56-66 (2017).
  35. Weitkunat, M., Brasse, M., Bausch, A. R., Schnorrer, F. Mechanical tension and spontaneous muscle twitching precede the formation of cross-striated muscle in vivo. Development. 144 (7), 1261-1272 (2017).
  36. Zappia, M. P., Rogers, A., Islam, A. B. M. M. K., Frolov, M. V. Rbf Activates the Myogenic Transcriptional Program to Promote Skeletal Muscle Differentiation. Cell Reports. 26 (3), 702-719 (2019).
  37. Zappia, M. P., Frolov, M. V. E2F function in muscle growth is necessary and sufficient for viability in Drosophila. Nature Communications. 7 (1), 10509 (2016).
  38. Bryantsev, A. L., et al. Myogenesis in Drosophila melanogaster: Dissection of Distinct Muscle Types for Molecular Analysis. Methods in Molecular Biology. 1889 (5), 267-281 (2019).
  39. Xiao, Y. S., Schöck, F., González-Morales, N. Rapid IFM Dissection for Visualizing Fluorescently Tagged Sarcomeric Proteins. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
  40. Kaya-Çopur, A., Schnorrer, F. RNA Interference Screening for Genes Regulating Drosophila Muscle Morphogenesis. Myogenesis. 1889, Chapter 20 331-348 (2019).
  41. Chechenova, M. B., et al. Functional redundancy and non-redundancy between two Troponin C isoforms in Drosophila adult muscles. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 760-770 (2017).
  42. Alberts, B. Molecular Biology of the Cell. , Garland Science. New York, NY. (2017).
  43. Clyne, P. J., Brotman, J. S., Sweeney, S. T., Davis, G. Green fluorescent protein tagging Drosophila proteins at their native genomic loci with small P elements. Genetics. 165 (3), 1433-1441 (2003).
  44. Orfanos, Z., Sparrow, J. C. Myosin isoform switching during assembly of the Drosophila flight muscle thick filament lattice. Journal of Cell Science. 126 (1), 139-148 (2013).
  45. Volohonsky, G., Edenfeld, G., Klambt, C., Volk, T. Muscle-dependent maturation of tendon cells is induced by post-transcriptional regulation of stripeA. Development. 134 (2), 347-356 (2007).
  46. Estes, P. S., Ho, G. L., Narayanan, R., Ramaswami, M. Synaptic localization and restricted diffusion of a Drosophila neuronal synaptobrevin--green fluorescent protein chimera in vivo. Journal of Neurogenetics. 13 (4), 233-255 (2000).
  47. Hida, N., et al. EC-tagging allows cell type-specific RNA analysis. Nucleic Acids Research. 45 (15), 138 (2017).
  48. Thomas, A., et al. A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila. PLoS ONE. 7 (7), 40276 (2012).
  49. Yang, Z. Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging. Nucleic Acids Research. 33 (17), 148 (2005).
  50. Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 14110-14115 (2007).
  51. Blazie, S. M., et al. Comparative RNA-Seq analysis reveals pervasive tissue-specific alternative polyadenylation in Caenorhabditis elegans intestine and muscles. BMC Biology. 13 (1), 1775-1821 (2015).
  52. Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic Acids Research. 40 (19), 9691-9704 (2012).
  53. Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nature Protocols. 6 (1), 56-68 (2011).
  54. Grinstein, M., Dingwall, H. L., Shah, R. R., Capellini, T. D., Galloway, J. L. A robust method for RNA extraction and purification from a single adult mouse tendon. PeerJ. 6 (8), 4664 (2018).
  55. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. , (2012).
  56. Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18 (1), 16 (2018).
  57. Ford, K. L., et al. Optimisation of laboratory methods for whole transcriptomic RNA analyses in human left ventricular biopsies and blood samples of clinical relevance. PLoS ONE. 14 (3), 02136855 (2019).
  58. Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harbor Protocols. (8), 5469 (2010).
  59. Ranganayakulu, G., Schulz, R. A., Olson, E. N. Wingless signaling induces nautilus expression in the ventral mesoderm of the Drosophila embryo. Developmental Biology. 176 (1), 143-148 (1996).
  60. Dutta, D., Bloor, J. W., Ruiz-Gómez, M., VijayRaghavan, K., Kiehart, D. P. Real-time imaging of morphogenetic movements in Drosophila using Gal4-UAS-driven expression of GFP fused to the actin-binding domain of moesin. Genesis. 34 (1-2), 146-151 (2002).
  61. Lemke, S. B., Schnorrer, F. In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae. Journal of Visualized Experiments. (132), e57312 (2018).

Tags

Genetik Drosophila udviklingsmæssige biologi indirekte flyve muskel levende dissektion før udvikling massespektrometri RNA-SEQ RNA isolation Bruno1 alternative splejsning
Dissektion af <em>Drosophila melanogaster</em> Flight muskler for omics tilgange
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kao, S. Y., Nikonova, E.,… More

Kao, S. Y., Nikonova, E., Ravichandran, K., Spletter, M. L. Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches. J. Vis. Exp. (152), e60309, doi:10.3791/60309 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter