Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Dissektion av Drosophila melanogaster flygmuskler för omics närmar sig

Published: October 17, 2019 doi: 10.3791/60309
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,2
1Biomedical Center, Department of Physiological Chemistry, Ludwig-Maximilians-University Munich, 2Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM), Department of Chemistry, Ludwig-Maximilians-University Munich
* These authors contributed equally

Summary

Drosophila Flight Muscle är en kraftfull modell för att studera transkriptionell reglering, alternativa skarvning, metabolism och mechanobiologi. Vi presenterar ett protokoll för dissektion av fluorescerande-märkta flygning muskler från levande puppor att generera höganrikade prover idealisk för proteomik och djup-sekvensering. Dessa prover kan erbjuda viktiga mekanistiska insikter i olika aspekter av muskelutveckling.

Abstract

Drosophila Flight Muscle är en kraftfull modell för att studera olika processer såsom transkriptionella reglering, alternativa skarvning, metabolism, och mechanobiology, som alla påverkar muskelutveckling och myofibrillogenes. Omics-data, till exempel de som genereras av masspektrometri eller djupsekvensering, kan ge viktiga mekanistiska insikter i dessa biologiska processer. För sådana metoder är det fördelaktigt att analysera vävnadsspecifika prover för att öka både selektivitet och specificitet hos omics fingeravtryck. Här presenterar vi ett protokoll för dissektion av fluorescerande-märkta flygning muskler från levande puppor att generera höganrikade muskel prover för omics applikationer. Vi beskriver först hur man dissekera flygmuskler vid tidig Pupp stadier (< 48 h efter puparium formation [APF]), när musklerna är urskiljbara av grönt fluorescerande protein (GFP) märkning. Vi beskriver sedan hur man dissekera muskler från sena puppor (> 48 h APF) eller vuxna, när musklerna är distinguishable under en dissekera Mikroskop. Det medföljande video protokollet kommer att göra dessa tekniskt krävande dissektioner mer lättillgängliga för forskarsamhällena i muskler och Drosophila . För RNA-tillämpningar, vi assay kvantitet och kvalitet av RNA som kan isoleras vid olika tidpunkter och med olika metoder. Vi visar vidare att Bruno1 (Bru1) är nödvändigt för en temporal förskjutning i myosin heavy chain (MHC) skarvning, visar att dissekerade muskler kan användas för mRNA-SEQ, masspektrometri, och omvänd Transkription polymeras kedjereaktion (RT-PCR) Program. Denna dissekeringsprotokoll kommer att bidra till att främja vävnads-specifika omics analyser och kan allmänt tillämpas för att studera flera biologiska aspekter av myogenes.

Introduction

Moderna omics Technologies ger viktiga insikter i muskelutveckling och mekanismerna bakom mänskliga muskelsjukdomar. Till exempel har analys av transkriptomics data kombinerat med genetisk och biokemisk verifiering i djurmodeller visat att förlust av skarvning faktor RBM20 orsakar dilaterad kardiomyopati på grund av dess reglering av ett mål nätverk av mer än 30 sarcomere gener som tidigare förknippats med hjärtsjukdom, inklusive Titin1,2,3.

I ett andra exempel, studier från cellkultur, djurmodeller, och mänskliga patienter har visat att internationellt dystrofi orsakas av en störning i RNA-reglering på grund av kvarstad på muscleblind (MBNL) och uppreglering av CELF14,5. Den tvär reglerande och temporala dynamiken mellan MBNL och CELF1 (även kallad CUGBP1 eller Bruno-like 2) bidra till att förklara de ihållande embryonala skarvning mönster i internationellt dystrofi patienter. Dessutom bidrar det stora nätverket av felreglerade mål till att förklara sjukdomens komplexa natur4,6,7,8. En majoritet av sådana studier utnyttjar omics metoder i genetiska modellorganismer för att förstå mekanismerna bakom människans muskelsjukdom. Dessutom, de belyser vikten av att först förstå temporala och vävnads-typ specifika genuttryck, protein modifiering, och metabola mönster i friska muskler att förstå förändringar i sjuka eller åldrande muskler.

Drosophila melanogaster är en annan väletablerad genetisk modellorganism. Strukturen i sarcomere samt enskilda sarcomere komponenter är mycket bevaras från flugor till ryggradsdjur4,9,10, och indirekta flyg musklerna (ifms) har blivit en kraftfull modell för att studera flera aspekter av muskelutveckling11,12. Först, fibrillar flygmuskler är funktionellt och morfologiskt skiljer sig från tubulär kroppens muskler11,13, vilket möjliggör utredning av muskel-typ specifika utvecklingsmekanismer. Transkriptionsfaktorer inklusive spalt Major (Salm)14, extradenticle (EXD), och Homothorax (HTH)15 har identifierats som fibrillar öde regulatorer. Dessutom, nedströms i Salm, den CELF1 homolog Bruno1 (Bru1, aret) leder en fibrillar-specifika skarvning program16,17.

För det andra, ifms är en viktig modell för att förstå processen för myogenes själv, från myoblast fusion och myotube fastsättning till myofibrillogenes och sarcomere mognad9,18,19. För det tredje tillåter Drosophila Genetics utredning av bidrag från enskilda proteiner, protein domäner och proteinisoformer till sarcomere formation, funktion och biofysiska egenskaper20,21,22 ,23. Slutligen har IFM modeller utvecklats för studier av flera mänskliga muskelsjukdomar, såsom internationellt dystrofi, myofibrillar myopatier, muskel degenerativa sjukdomar, actinopatier, etc.24,25,26 ,27, och har gett viktiga insikter om sjukdomsmekanismer och potentiella terapier28,29,30. Således är Drosophila en användbar modell för att ta itu med många öppna frågor i myogenes fältet, inklusive mekanismer för muskel-typ specifik transkription, skarvning, och kromatin reglering, samt till den roll som metabolism i muskelutveckling. Tillämpningen av modern omics-teknik, i synnerhet i kombination med det breda utbudet av genetiska, biokemiska och cellbiologiska analyser som finns i Drosophila, har potential att dramatiskt främja förståelsen av muskel utveckling, åldrande och sjukdom.

Ifms är de största musklerna i farten, som spänner över nästan 1 mm över hela längden av bröstkorgen hos vuxna31,32. Men denna lilla storlek genererar utmaningen att få tillräckligt med prov för att tillämpa omics teknik i Drosophila i ett vävnads-typ specifikt sätt. Dessutom, ifms är en del av den vuxna muskulatur som bildas under Pupp stadier. Myoblasts säkring för att bilda myotubes, som fäster på senor runt 24 h efter puparium formation (APF) och genomgå en Kompaktion steg som krävs för att initiera myofibrillogenes runt 30 h APF (figur 1a-D)18,33, 34.

Den myofibers sedan växa för att spänna över hela längden av bröstkorgen, med myofibriller genomgår en initial tillväxtfas fokuserat på sarcomere tillägg fram till ca 48 h APF, och sedan övergår till en mogning fas, där sarkomeres växa i längd och bredd och är remodeled att etablera stretch-aktivering av 72 h APF (figur 1A-D)32,35. Uppkomsten av fiber mognad är åtminstone delvis kontrolleras av Salm och E2F32,36,37, och flera IFM-specifika sarcomere protein isoformer vars skarvning styrs av Bru1 införlivas under denna fas16,17. Mogna flugor eclose från 90 – 100 h APF. Detta innebär att för att studera muskelutveckling, IFM måste isoleras med tillräcklig kvantitet, kvalitet och renhet från flera Pupp tidpunkter att underlätta analys med hjälp av omics metoder.

Flera protokoll för IFM dissektion har publicerats. Även om dessa protokoll fungerar bra för deras avsedda tillämpningar, är ingen idealisk för omics metoder. Protokoll som bevarar IFM morfologi för immunofluorescens av Pupp och vuxna ifms19, isolera IFM fibrer för mekanisk utvärdering31, eller utnyttja microdissection av Pupp IFM från kryosections38 är för specialiserade och tid och arbetsintensiva att rimligen få tillräckliga mängder av IFM vävnad för omics applikationer. Andra protokoll har utvecklats för snabb dissektion av specifikt vuxen IFM38,39, alltså inte är tillämpliga på Pupp stadier, och använda buffertar som inte är idealiska eller kan vara oförenliga med, till exempel, RNA-isolering. Därför finns det ett behov av att utveckla nya metoder för att isolera Pupp IFM för biokemi eller omics applikationer.

Här presenterar vi ett protokoll för dissektion av IFM under Pupp stadier som har använts framgångsrikt för mRNA-SEQ analys från 16 h APF genom vuxna stadier16,32. Protokollet sysselsätter en grön fluorescerande protein (GFP) etikett för att identifiera ifms i alla stadier av Pupp och vuxen utveckling, vilket möjliggör levande dissektion under en fluorescerande dissekera Mikroskop. Metoden är mindre arbetsintensiva, med ett högre dataflöde än befintliga IFM dissektion-protokoll. Detta möjliggör snabb isolering och kryopreservation av prover, genererar tillräckligt med material efter flera omgångar av dissektion för omics metoder samt för standard omvänd Transkription polymeras kedjereaktion (RT-PCR) eller Western blotting.

Vi presenterar protokollet i två delar, visar hur man snabbt dissekera ifms både före 48 h APF (under tidig metamorfos, när IFM bilagor är mer tenuous) och efter 48 h APF (när Pupp Body plan och IFM bilagor är väldefinierade). Vi visar att vi kan isolera högkvalitativa RNA från dissekerade IFMs vid alla tidpunkter och presentera data om olika metoder för att RNA-isolering och omvänd Transkription. Slutligen demonstrerar vi tillämpningen av dissekeringsprotokollet till mRNA-SEQ, masspektrometri och RT-PCR med hjälp av CELF1 homolog Bruno1 som exempel. Vi visar misexpression av sarcomere protein isoformer i proteomik data från Bruno1 Mutant IFM och undersöka Bruno1 reglering av C-terminalen splice händelse av myosin tung kedja (MHC). Dessa resultat illustrerar hur omics data kan ge en djupare förståelse för biologiska fenomen, som komplement till genetiska och biokemiska experiment.

Protocol

1. iscensätta puppor

  1. Höj flugor av önskad genotyp i flaskor (figur 1E). Antingen göra en ny flip av dissektion beståndet eller ställa ett kors med minst 20 kvinnliga jungfru flugor. Underhålla flaskor tills flugorna börjar pupate.
  2. Samla upp pre-puppor med en fuktad pensel och överför till fuktat filtrerpapper i en 60 mm petriskål (figur 1F).
  3. Kön puppan, samla lämpligt kön för experimentet (figur 1G). Hanar identifieras genom närvaron av testiklarna, som visas som genomskinliga bollar i den annars ogenomskinliga puppan.
  4. Märk petriskål med tid, datum och genotyp, sedan åldras puppor till önskat skede (figur 1H).
    Anmärkning: Upprätthålla kors/lager och ålders puppor i en temperaturkontrollerad inkubator (dvs., 25 ° c eller 27 ° c för RNAi korsar, eftersom ökad Gal4 aktivitet vid högre temperaturer ökar knock-down effektivitet40). Se till att luftfuktigheten är tillräckligt hög så puppor inte torkar ut när åldrande flera dagar.

2. IFM dissektion före 48 h APF

  1. Montera den utrustning som behövs, inklusive två #5 biogradig tång, en pipett, pipettspetsar, torris och (för RNA-prov) isoleringsreagens (se tabell över material). Dessutom Chill svart dissekera rätter (se tabell över material), 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) buffert, och 1,5 ml microcentrifug rör på is.
  2. Med hjälp av en fuktad pensel, överför iscensatta puppor till en svart dissekationskål fylld ungefär två tredjedelar med kallt 1x PBS (figur 2a, B). Flytta till en fluorescerande dissekera Mikroskop.
    Anmärkning: Använd så många puppor som kan dissekeras inom en 30 min tid fönster. Beroende på erfarenhet, detta varierar från 3-15 puppor. Se kompletterande metoder för diskussion av alternativ till svart dissekera rätter.
  3. Med hjälp av #5 pincett, skjut en av puppor till botten av en svart dissekera skålen och justera mikroskopet zoom och fokus för att tydligt se puppan (figur 2C).
  4. Ta tag i främre av puppan med en pinpett (figur 2D), sedan peta puppor med en enda spets på andra tång något off-Center i buken, precis bakom bröstkorgen. Detta håller Pupa på plats och förhindrar IFMs från att flytta in i buken (figur 2E).
    Anmärkning: Börja timing längden på dissektion från denna punkt, så snart Pupp integritet störs. Använd en definierad längd av dissektion (till exempel 20 – 30 min) för att minimera muskel döden och associerade transcriptomic och proteomiska förändringar. Dissekera så många flugor som möjligt under denna tidsperiod.
  5. Använd den första pinpett, ta bort den främre halvan av Pupp fallet (figur 2F).
  6. Använd samma pinpett för att nypa de exponerade puppor precis bakom bröstkorgen, och separera buken från bröstkorgen (figur 2G).
  7. Med hjälp av tång, pressa försiktigt den främre delen av bröstkorgen (för < 35 h APF) eller rippa öppna bröstkorgen för att exponera fluorescerande märkta IFMs (figur 2h). IFMs kommer lätt lossna från överhuden, som sena bilagor vid tidiga tidpunkter är bräckliga. Kassera resterande slaktkropp med hjälp av pinuper för att pressa den till den motsatta sidan av skålen.
  8. Upprepa steg 2.3 – 2.7, dissekera ytterligare puppor.
  9. Samla in IFM-fibrerna med pinps och organisera dem i en stapel i botten av den svarta dissekera skålen (figur 2I, J). Ta bort skräp genom att trycka ut den ur synfältet med hjälp av tång.
    Anmärkning: Med övning kan pinps tips föras in i närheten utan att röra varandra. Denna teknik kan användas för att löst greppa IFMs utan att förstöra dem. Alternativa metoder inkluderar försiktigt trycka eller lyfta IFMs med en enda spets eller helt slutna tång, eller ta lite fett eller annan vävnad med IFM och ta bort fettet som beskrivs i steg 2,10.
  10. Kvalitetskontrollera IFM-muskelprovet med hjälp av tång för att ta bort icke-IFM-muskler, fett, nagelband etc. från provet (figur 2K, L).
    Anmärkning: Med Mef2-Gal4 är IFM märkt starkare än andra muskel typer vid tidiga tidpunkter (figur 2k, k '), vilket gör att man kan avlägsna hopp muskler och larv muskler baserat på fluorescensintensitet och muskel form. Fett och nagelband vävnad ser olika ut och är inte märkta med en muskelspecifik fluorescens etikett (figur 2k, k). Se diskussionsavsnittet för andra Gal4 rader som etiketten IFM.
  11. Med hjälp av en klippt pipettspets överför du högen av IFMs till ett 1,5 mL microcentrifugerör fyllt med 250 μL kyld 1x PBS (figur 2M-O). Fortsätt omedelbart till avsnitt 4.
    Anmärkning: IFM-proverna kan försvinna helt enkelt genom att fastna på sidan av pipettspetsen. Pipettering buffert upp och ner flera gånger innan du samlar IFMs kan göra standard tips mindre klibbiga, och silikoniserad eller perfluoroalkoxy (PFA) tips (se tabell över material) med lägre yta spänningar kan bidra till att förhindra prov förlust.

3. IFM dissektion efter 48 h APF

  1. Montera nödvändig utrustning inklusive två #5 biologi grade forceps, fin sax, standardglas Mikroskop diabilder, dubbel-stick tejp, pipett, pipettspetsar, torris, och (för RNA-applikationer) isoleringsreagens (se tabell över material). Kyla 1x PBS och microcentrifug rören på isen.
  2. Använd en lätt fuktad pensel och överför den mellanlagrade puppan till en remsa av dubbelhäftande tejp monterad på en Mikroskop bild (figur 3a). Placera puppor i en linje orienterad i samma orientering (ventral ner och främre mot botten av bilden).
    Anmärkning: Var noga med att inte använda för mycket vatten på pensel eller filter, eller puppor kommer inte att sticka bra. Om puppor inte fastnar, torka dem genom att först överföra till ett torrt filter eller mjukpapper. Montera så många puppor som kan dissekeras inom en 30 min tid fönster, helst ~ 10 puppor.
  3. Ta bort Pupa från Pupp-fodralet. Använd pinpett att retas isär och öppna Pupp fallet ovanför de främre trakeer (figur 3B).
  4. Skjut försiktigt ett par tång dorsalt mot den bakre, skära Pupp fallet som pincett flytta (figur 3B). Var noga med att inte brista den underliggande Pupa. Befria pupan från det öppnade fodralet och överför den omedelbart till en droppe 1x PBS på en andra Mikroskop bild (figur 3B ", C).
  5. Upprepa steg 3,3 och 3,4 för alla puppor i linjen, sedan ställa in dubbel-stick band glida åt sidan.
  6. Med hjälp av den fina saxen, skär buken av puppan bort från bröstkorgen och skjut in den i en separat stapel (figur 3d, d). Upprepa för återstående puppor.
    Anmärkning: Börja timing längden på dissektion med steg 3,6, så snart Pupp integritet störs. Dissekera så många flugor som möjligt i 20 – 30 min för att förhindra celldöd och tillhörande transkriptomiska och proteomiska förändringar. När dissekera 1 d vuxna eller > 90 h puppor, är det ofta bekvämt för senare steg för att dessutom ta bort huvudet med fin sax.
  7. Med hjälp av ett mjukpapper, ta bort majoriteten av 1x PBS (allmänt grumlig med suspenderat fett) samt högen av abdomens (figur 3E). Tillsätt en droppe färsk, kyld 1x PBS till de kvarvarande bröst axlarna.
  8. Använd saxen för att skära bröstkorgen i hälften (figur 3f, f) genom att skära från huvudet nedåt den längsgående kropps axeln i en enda rörelse. Växelvis, om huvudet har tagits bort, först in saxen där huvudet var fäst och skär den övre halvan av bröstkorgen längsled mellan IFMs. Skär sedan den ventrala sidan av bröstkorgen med en andra skära i samma orientering.
  9. Upprepa steg 3,7 och 3,8 för alla puppor att dissekeras, generera en hög med bröstkorgen hemisections nära mitten av bilden. Se till att det finns tillräckligt med kyld 1x PBS på bilden så att hemisektionerna inte torkar ut.
    Anmärkning: Efter 48 h APF, IFMs är tillräckligt stora för att vara synlig under en standard dissekera Mikroskop till tränade ögat. Vid denna punkt i protokollet, kan muskler med en fluorescerande etikett flyttas till en fluorescerande dissekera utrymme till stöd i IFM identifiering eller för utbildningsändamål, men detta är inte nödvändigt.
  10. Dissekera IFMs ur bröstkorgen. Isolera en av hemisektionerna med hjälp av #5 tång (figur 3G, H). Sätt försiktigt i spetsarna på en tång ovanför och under mitten av IFMs (figur 3G ', H '). Medan du håller den första tång fortfarande, Använd fin sax för att skära ena änden av IFM bort från nagelbanden och senor. Skär sedan den andra änden av IFM fritt från nagelbanden (figur 3G ' ', H ' ').
    Anmärkning: Beroende på riktningen av bröstkorgen efter den första IFM skära, är det lämpligt att rotera bröstkorgen 180 ° så att den andra IFM skära är lättare att utföra.
  11. Ta bort IFM-paketet från bröstkorgen med pintippar (figur 3G ' ', H ' ' '), och överför det till kanten av PBS-bubblan för att använda vatten spänningen för att hålla den på plats (figur 3i). Skjut kadaver till motsatt sida av bilden. Upprepa för de återstående bröstkorgen-hemisektionerna, vilket genererar en samling dissekerade ifms.
    Anmärkning: Om IFMs inte stanna i en snygg hög, ta bort några av 1x PBS med en vävnad. Var noga med att inte låta alla PBS avdungra, och se till att dissekerade IFMs och hemithoraxes fortfarande omfattas av buffert.
  12. Efter dissekera alla IFMs, snabbt utföra en kvalitetskontroll på dissekerade muskler. Med hjälp av #5 tång, ta bort alla hoppa muskler eller nagelband fragment som kan ha funnit sin väg in i provet (figur 3J-K ' ').
    Anmärkning: Hoppa muskler verkar skilja från IFM. Om dissekera Mef2-Gal4 märkt muskler under fluorescens, Jump muskel har en svagare fluorescens och en annan form och textur. Under normalt ljus, verkar det nästan genomskinligt medan IFMs är en ogenomskinlig, mjölkig gul (figur 3j-j ' ', K).
  13. Använda vatten spänning, fånga (men inte squish) dissekerade IFMs mellan ett par tång (figur 3L). Överför IFMs till ett 1,5 mL microcentrifugerör som är förfylld med 250 μL kyld 1x PBS (figur 3M). Fortsätt omedelbart med avsnitt 4.
    Anmärkning: När tång tips tas i närheten av varandra och lyfts ut ur en buffertlösning, orsakar vatten spänningar en bubbla av buffert som skall fångas mellan pinps tips. Om IFMs finns också i denna bubbla, kan de lyftas ut ur lösningen och lätt överföras till en annan buffert fyllda kärlet. Det är viktigt att pressa tång för att få tips nära varandra utan att röra varandra, för att undvika lakats vävnaden fångas i bufferten bubblan.

4. pellets och bevara IFM-provet

  1. Pellets den IFMs genom centrifugering av 1,5 mL microcentrifug röret för 3 – 5 min vid 2 000 x g i en bordsskiva centrifug (figur 4a, B).
  2. Ta bort bufferten med pipettspetsen (figur 4C).
  3. För RNA-tillämpningar, Omsuspendera IFM-pelleten i 50 – 100 μL av den önskade RNA-isoleringsbufferten (se tabell över material, figur 4D). Annars går du vidare till steg 4,4.
    Anmärkning: IFMs kan frysas efter steg 4,2 för masspektrometri preparat eller isolering av RNA med kommersiella Kit (se representativa resultat). För RNA-tillämpningar erhålls bättre resultat genom att omedelbart omlägga och frysa IFM-pelleten i isoleringsbufferten.
  4. Frys provet på torris eller tryck frysning i flytande kväve (figur 4E). Förvara vid-80 ° c till klar för efterföljande steg i provberedning för nedströms analys.
    Anmärkning: Efter frysförvaring kan prover lagras i flera månader före bearbetningen för nedströmsundersökningar.

Representative Results

Dissekering protokollen som presenteras ovan är användbara för att generera IFM-berikade prover från 16 h efter puparium formation (APF) tills vuxen stadiet. Dissekerade flyg muskel prov kan användas för flera applikationer, och har hittills tillämpats framgångsrikt för RT-PCR4,17, RNA-SEQ16,32, chip36,37, Western blotting14,41 och masspektrometri experiment (se nedan). För att hjälpa potentiella användare att dissekera för RNA-baserade applikationer, presenterar vi först våra resultat lyfta fram viktiga överväganden specifikt för isolering av RNA från IFMs. För att mer allmänt Visa nyttan av våra dissekering protokoll, illustrerar vi sedan några av de möjliga-omics applikationer med hjälp av våra data på RNA-bindande protein Bruno1.

IFM dissektion protokollet ger hög kvalitet RNA

Det är viktigt att bestämma antalet flugor som ska dissekeras i förväg, eftersom kodning mRNA beräknas utgöra endast 1 – 5% av totala RNA42. Vi erhöll i genomsnitt 24 ± 9 ng av totalt RNA per fluga från IFM dissekeras från 1 d vuxna (figur 4F och kompletterande figur 1a), med avkastning som vanligtvis ökar med erfarenhet. Denna avkastning på totalt RNA per fluga är relativt konstant, fluktuerande runt 25 ng för IFM dissekeras vid 16 h APF, 24 h APF, 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF och 90 h APF (figur 4F och kompletterande figur 1b, D, E). Observationerna återspeglar också alla RNA som isolerats från att förorda fett, senor, luftstrupe eller andra celltyper, vilket kan vara högre i prover isolerade från tidigare tidpunkter. Således fick vi > 1 μg totalt RNA från IFM från 50 flugor och typiskt dissekera IFM från 100 − 150 flugor för att generera > 3 μg totalt RNA för RNA-SEQ prover.

Metoden för RNA-isolering påverkar mängden och kvaliteten på återhämtat RNA, och vi uppmuntrar användarna att validera sin isoleringsmetod. Till exempel, medan isolering med metod 1 producerar i genomsnitt 1143 ± 465 ng av totalt RNA från IFM från 50 1 d vuxna flugor, isolering med olika kommersiella Kit ger allt från 186 ± 8 ng till 1261 ± 355 ng av totalt RNA (figur 4G och Kompletterande figur 1C). RNA isolerat från kommersiella kit är i allmänhet av god kvalitet (figur 4H och kompletterande figur 1f), men låga återvinningar tyder på att RNA inte kan effektivt elueras från kolumnerna. RNA integritet kan också äventyras genom användning av ett kit som görs i metod 2 (figur 4H, andra observationsområdet), sannolikt på grund av buffert konstitution och värmebehandling, vilket leder till svår fragmentering som kan påverka nedströms experiment.

Det är också viktigt att iaktta korrekt RNase-fri teknik vid isolering och hantering av RNA-prover. Även frys-Tina cykler och en 4 h rumstemperatur inkubering inte dramatiskt påverkar RNA integritet profiler, även små mängder RNase leda till snabb RNA-nedbrytning (figur 4I och kompletterande metoder). Användare uppmuntras fortfarande att arbeta på is och begränsa frys-Tina för att förhindra RNA-hydrolys och fragmentering. Detta upptäcktes inte här, men att förhindra RNase förorening med hjälp av filter tips och DEPC-behandlade buffertar är absolut nödvändigt.

Effektiviteten i omvänd Transkription påverkar också framgången för nedströmsprogram. Vi fick pålitliga resultat med två av tre kommersiella RT kit vi testade, som båda förstärker starka RT-PCR-band för ribosomal Gene rp49 (figur 4J). Men RT kit #2 kan vara känsligare för detektering av låg-uttryckta utskrifter, som vi fått starkare band för RNA-bindande protein bru1 för alla tre biologiska replikat (figur 4J). Sammantaget visar dessa resultat att högkvalitativt RNA kan isoleras från ifms dissekerade med denna procedur.

Dissekerade IFMs producera hög kvalitet mRNA-SEQ och proteomik data

Använda IFM dissekeras enligt ovanstående protokoll vid 30 h APF, 72 h APF och från 1 d vuxen flugor, vi visade tidigare att RNA-bindande protein och CELF1-homologue Bruno1 (Bru1, gripande, aret) styr en IFM-specifika skarvning väg nedströms transkription faktor spalt Major (Salm)16. Ifms från null mutanter samt flugor med muskelspecifika bruno1 RNAi (bru1-IR) display sarcomere tillväxt defekter, felaktig av myosin aktivitet och slutligen hyperkontraktion och förlust av muskelfibrer16,17 . Nedan visar vi nyttan av dissekerade IFMs för hela proteomet masspektrometri och visar att flera av de uttryck förändringar vi observerade på RNA-nivå är också tydligt på proteinnivån. Vi belyser ytterligare en specifik utveckling splice händelse i MHC som konstaterades regleras av Bruno1, illustrerar att mRNA-SEQ och RT-PCR från dissekerade ifms kan användas för att demonstrera regleringen av alternativa splice händelser.

Beroende på bibliotekets kvalitet och djup, kan mRNA-SEQ data analyseras på nivån av gen enheter (genomsnitt läsa räknas över alla exoner av en gen), enskilda exoner, eller skarvar korsningar. mRNA-SEQ data från bru1-IR ifms jämfört med vildtyp visar svaga förändringar i uttrycket på gen enhetens nivå16 (figur 5A). Vid 72 h APF, det finns redan en trend för sarcomere gener såsom Muscle lim protein vid 60A [Mlp60A], aktin 57b [Act57B], muskelspecifikt protein 300 kDa [Msp300], eller stretchin-mlck [strn-mlck]) som är viktiga för korrekt muskelutveckling att vara nedreglerad i bru1-IR- muskeln (figur 5A och kompletterande tabell 1). Vi har dock visat tidigare att på nivån för enskilda exoner, det finns en mycket starkare nedreglering av specifika sarcomere gen isoformer16, vilket tyder på den viktigaste funktionen av Bruno1 är att kontrollera alternativa skarvning (kompletterande tabell 1 ).

Med hjälp av hela Proteome masspektrometri på dissekerade IFMs, kan vi visa liknande reglering på proteinnivån (figur 5B och kompletterande tabell 2). Av de 1 895 peptid grupper som upptäcktes, 524 (28%) av dem är felreglerade i Bru1m2 Mutant IFM i 1 d vuxna (kompletterande tabell 2). Nedreglering av både Strn-Mlck och Mlp60A protein observeras också, matchande observationer på avskrift nivå i vår mRNA-SEQ data. Trots det begränsade antalet databas peptider som mappas till specifika protein isoformer (se kompletterande metoder för analys Detaljer), för sarcomere proteiner Tropomyosin 1 (TM1), upprätthålls (upp/TNT), MHC, Bent (BT/projectin) och paramyosin (PRM) vi Observera uppreglering av peptider från en isoform och nedreglering av en annan (figur 5B), vilket bekräftar våra tidigare observationer av liknande reglering på RNA-nivå16. Detta visar att dissekerade ifms är användbara för både mRNA-SEQ och proteomik applikationer.

Som ett ytterligare exempel på hur omics data kan komplettera traditionella metoder för att förbättra och utvidga biologisk insikt, valde vi att fokusera på skarvning vid C-terminus av MHC. En tidigare karakteriserad protein fälla linje som kallas weeP26 infogas i den slutliga intron av MHC43,44 (se kompletterande metoder för exakt plats). weeP26 innehåller en stark skarvar acceptor och införlivas förmodligen alla MHC avskrifter (figur 5C). Dock är GFP märkt protein i IFM införlivas i två "prickar" på vardera sidan av M-line, medan i benet muskler, den innehåller jämnt över M-linjen och svagt över de tjocka glödtrådar (figur 5E). Orfans och sparv visade dessa "prickar" i IFM form på grund av en utvecklingsmässig MHC isoform switch: den MHC isoform uttryckt före 48 h APF är GFP-märkta som weeP26 exon infogar i den öppna Läs ramen, medan MHC isoform uttryckt efter 48 h APF är omärkt, eftersom weeP26 exon ingår nedströms av stopp kodon i 3 '-utr44.

Vår mRNA-SEQ data tillät oss att karakterisera C-Terminal MHC isoform uttryck mer i detalj. Medan två olika MHC termineringar har rapporterats43,44, vår mRNA-SEQ data och nuvarande flybase Annotation (FB2019_02) tyder på att det finns faktiskt tre möjliga alternativa splice händelser vid MHC C-Terminus (exon 34-35, 34-36, eller 34-37) (figur 5C), som bekräftas av RT-PCR (figur 5D). weeP26 GFP skall införas i intron mellan exon 36 och 37; eftersom både exon 34-35 och exon 34-36 isoformer innehåller stopp kodons, kan GFP endast översättas i exon 34-37 isoform (vilket resulterar i exon 34-GFP-37). Vi kunde också se både tidsmässiga och rumsliga regleringen av alla MHC -isoformer. I IFM observerar vi en MHC isoform switch från exon 34-37 till exon 34-35 mellan 30 h APF och 48 h APF (figur 5C, D, F) vid 27 ° c, även om detta ännu inte är synlig genom immunofluorescens vid 48 h APF (figur 5E). Benen uttrycker redan en blandning av exon 34-37 och exon 34-35 vid 30 h APF, och av 72 h APF uttrycker alla tre MHC -isoformerna (figur 5D, F). Adult Jump Muscle (TDT) uttrycker också alla tre MHC -isoformerna (figur 5F), vilket tyder på detta är i allmänhet sant för tubulär somatiska muskler. Därför tillåter våra mRNA-SEQ-data en utökning av tidigare resultat genom att minska tidsramen för isoform-växeln MHC i IFM och karakterisera MHC isoform-användning i tubulär muskler.

MHC isoform regulation i Salm och bru1 Mutant IFM granskades sedan. I båda fallen såg vi felaktig av weeP26. Salm Mutant ifms misslyckas med att slutföra utvecklingen switch i MHC isoform Expression och phenocopy ben skarvning mönster i senare skeden, inklusive vinst av exon 34-36 händelse (figur 5F). Detta instämmer med tidigare fynd att förlust av Salm resulterar i en nästan fullständig omvandling omvandling av IFM till tubulär muskel16. Bru1-IR och Bru1 Mutant IFM, liknar Salm-/- IFM, behåller exon 34-37 splice händelse genom vuxna stadier (figur 5E, F), vilket resulterar i en weeP26 GFP märkning mönster som liknar ben muskler, men det får inte exon 34-36 händelse. Detta tyder på att Bruno1 är nödvändigt i IFM att åtminstone delvis kontrollera utvecklingen switch i MHC alternativa skarvning, men det tyder på att ytterligare splitsning faktorer är också felreglerade i Salm-/-sammanhang. Dessutom visar det här exemplet hur RT-PCR och mRNA-SEQ data från dissekerade IFM kan vara värdefulla för att få en djupare förståelse för utvecklingsplicing mekanismer och observerade morfologiska defekter.

Figure 1
Bild 1: IFM utveckling och iscensättning av puppor. (A) Schematisk av IFM utveckling vid 24 h apf, 32 h apf, 48 h apf, 72 h APF, och 1 d vuxna som visar packning av flygmuskler (grön) på ~ 32 h APF och efterföljande fiber tillväxt för att fylla bröstkorgen. Senor är i mörkgrå. (B) konfokala bilder av fasta ifms från öppen bok dissektioner (24 h, 32 h, 48 h)19 eller bröstkorgen hemisections (72 h, 1 dag) färgas för aktin (rhodamine phalloidin, magenta) och GFP (grön). (C, D) Bilder av GFP fluorescens i levande puppor som illustrerar intakt IFM morfologi av dissektion flug linje i dorsala (C) eller lateral (D) planet. Asterisker Markera IFM plats. (E) för att förbereda dissektioner bör flug bestånd vändas eller korsar Set 3 – 4 dagar i förväg. F) prepupae väljs genom sin vita färg (gula pilspetsar) och isoleras med en fuktad pensel (f ', f ' '). (G) prepupae bör könsbestämmas att separera honor från män baserat på närvaron av testiklar som visas som posteriort belägna genomskinliga bollar (gula asterisker). (H) puppor är åldrade på fuktat filtrerpapper i 60 mm rätter. Skalstreck = 100 μm (B), 1 cm (C, D, E, H), 1 mm (F, F ' ', G). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: dissektion av ifms före 48 h APF. (A) tillsats av 1x PBS-buffert till en svart dissekterande skål med överföringspipett. (B) överföring av mellanlagrad puppa med hjälp av en pensel. (C) under en fluorescerande dissekera Mikroskop för att visualisera GFP, mild trycka på puppan till botten av en dissekera skålen med hjälp av #5 pincett (beskrivs i grått). "X" i en cirkel betecknar rörelse i bilden. (D, E) Greppa puppor anteriorly (D), sedan peta av puppor precis bakom bröstkorgen (E). Streck i en cirkel betecknar ingen rörelse. (F, G) Dra med den främre tången (pil) för att ta bort Pupp fallet (F), sedan avlägsnande av buken (G). Hupprepning av C-G för flera Pupa. Gula prickade linjer är numrerade som betecknar bidragande puppor. (I, J) Användning av tångep (I) för att isolera IFMs från omgivande vävnad (J). Punkt i en cirkel betecknar rörelse utanför sidan. (K, L) Avlägsnande av föroreningar inklusive fett och Jump (TDT) muskler (K) för att generera en ren IFM prov (L). TDT har lägre GFP-uttryck och en annan form än IFM-fibrer (K). (M, N, O) Användning av en klippt pipettspets (M) för att samla upp dissekerade IFMs (N) och dess överföring till ett microcentrifugerör (O). Skalstreck = 1 cm (A, B, M, O), 1 mm (C-G), 500 μm (H-L, N). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: dissektion av ifms efter 48 h APF. (A) anpassning av puppor på dubbel-stick tejp. (B) avlägsnande av puppor från Pupp fallet genom att öppna anteriorly (b), skära fallet dorsalt (b), och lyfta ut Pupa (b ' '). Cirkel symbolerna representerade samma som figur 2. (C) överföring av puppor till buffert. (D) avlägsnande av buken genom skärning med sax (gula Dubbelpilar) och separation från Thoraxes (d'). (E, F) Tillsats av ren buffert (E), sedan kapning av thoraxes i halv längsled (f, f '). (G, H) Dissektioner kan utföras under vitt ljus (G) eller fluorescens för att visualisera GFP (H); kapning av IFMs på ena sidan (G), sedan den andra sidan (G ' '); Lyft ur bröstkorgen med tång (anges i grått) (G ' ' '). (I, J, K) Insamling av IFMs i buffert (i) och avlägsnande av förorenande ventrala nerv sladden (VNC), Gut, och hoppa muskel (TDT) (J) för att generera en ren IFM prov (K). TDT har lägre GFP-uttryck och en annan form än IFM-fibrer (J ' ', K '). (L, M) Användning av tång för att överföra IFMs (L) till ett microcentrifugerör (M). Skalstreck = 1 cm (A, E, M), 1 mm (B-D ', F-L). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: information om IFM-bevarande och RNA-isolering. (A) ifms pelleterat genom centrifugering i 5 min vid 2000 x g. B) IFM-pelleten (pil) och pellet under fluorescens (b). Cavlägsnande av all buffert med pipettspetsen. D) för RNA-extraktion, resuspension av pelleten i isoleringsbufferten. Detta steg kan hoppas över till torr-Freeze dissekerade IFMs. Efrysning av provet i flytande kväve eller på torris och förvaring vid-80 ° c. Skalstreck = 10 cm (A), 1 mm (B, B '), 1 cm (C, D, E). (F) nanogram (ng) av totalt RNA från DISSEKERAS IFM erhålls per fluga vid 16 h APF, 24 h APF, 30 h apf, 48 h apf, 72 h apf, 90 h APF, och 1 d vuxen. Felstaplar = SD. (G) totalt RNA ISOLERAT från IFM dissekeras från 50 1 d vuxen flugor med hjälp av olika extraktionsmetoder. Felstaplar = SD. (H) representativa spår till analysens RNA-integritet efter olika extraktionsmetoder. De ribosomala banden löper strax under 2000 nukleotider (NT) och markör bandet vid 25 NT. ytterligare spår finns i kompletterande figur 1. I) representativa spår av ett nyligen isolerat RNA-prov (överst), ett prov frysning-tinat 25x på torris (andra observationsområdet), ett prov som lämnas för 4 timmar på bänken (tredje observationsområdet) och ett prov som behandlats med RNase a (bottenplan). Notera fullständig nedbrytning av RNA vid tillsats av RNase A. (J) RT-PCR gel från satser som är märkta för bru1 och rp49. Den relativa intensiteten av bru1 bandet normaliserade mot rp49 ritas nedan. Felstaplar = SEM (ej ihopparad t-test, p = 0,0119). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: tillämpning av IFM-dissektioner för att undersöka Bruno1-funktionen i alternativ splitsning. (A) Volcano Plot av mRNA-SEQ data (Gene Unit) från ifms dissekeras vid 72 h APF. Gener som är signifikant Differentiellt reglerade mellan bru1-IR och vildtyp IFM (padj < 0,05, ABS (log2FC) > 1.5) visas i blått och icke-signifikanta gener i grått. Sarcomere proteiner är markerade i rött, och välj gener är märkta. (B) Volcano Plot av hela proteomet masspektrometri resultat från 1 d vuxen ifms. Proteiner som skiljer mellan BRUm2mutanter och vildtyp (FDR < 0,05) visas i blått, icke-signifikanta proteiner i grått. Sarcomeric proteiner är markerade i rött. Peptider som motsvarar gener i (A) är märkta i rött. Uppsättningar av peptider kartläggning till olika isoformer av samma protein är märkta i samma färg. C) system för c-Terminus i MHC som illustrerar distinkta avskrift-isoformer och weeP26 -genfällan (se kompletterande metoder för insättningspunkten). RT-PCR-primers betecknas som svarta linjer ovanför utskrifter. Läs antal per kilobase per miljon baser (rpkm) från mRNA-SEQ visas för ifms dissekerade från vildtyp vid 30 h APF (orange) och 72 h APF (röd), från bru1-IR (blå) och Salm-/- (cyan) vid 72 h APF och från hela benet (grön) på 72 h APF . DRT-PCR med primers mot MHC som visar isoform-omkopplaren i IFM mellan 30 h APF och senare tidpunkter. Händelsen exon 34-35 Splice är endast svagt observerad i BRUM3Mutant IFM eller i vuxen benet. (E) konfokala bilder av weeP26 GFP lokalisering i vildtyp IFM sarkomerer på 48 h APF och 90 h APF jämfört med 90 h APF ben muskler. Skalstreck = 1 μm. (F) splice Junction-kvantifiering från mRNA-SEQ-data för genotyper och tidpunkter som märkta. Junction läsningar presenteras som förhållandet mellan en specifik splice händelse (exon 34 till 35 i grått, 34 till 36 i lila och 34 till 37 i grönt) till det totala antalet händelser som delar exon 34 splice givare. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplemental Figure 1
Kompletterande figur 1: (a, B, C) RNA avkastningar från prover av samma genotyp dissekeras av samma forskare i samma vecka. Efter alla prover dissekeras, RNA isolerades och mättes samma dag. (A) nanogram (ng) av totalt RNA som erhållits från IFM dissektioner per 1 d vuxen fluga. Felstaplar = SEM. (B) totalt RNA som erhålls från dissekerade IFM per fluga vid 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF och 1 d vuxen. (C) totalt RNA isolerat från IFM dissekeras från 50 1 d vuxen flugor med hjälp av olika extraktionsmetoder. Dtotala RNA-koncentrationer per fluga från dissekerade ben, hopp muskel (TDT) och IFM. Mer RNA erhålls från de större IFMs. Felstaplar = SD. (E) totala RNA-koncentrationer per fluga av IFM dissekeras från kontroller jämfört med RNAi eller muterade prover vid 30 h APF, 72 h APF och 1 d vuxen. För mutanter, w1118 användes som vildtyp kontroll. Mutant data sammanställs från bru1-IR, Salm-/- och en annan RNA-bindande protein Mutant. Observera att för dessa manipulationer, RNA avkastningen minskas i 1 d vuxen på grund av muskelatrofi och förlust, så mer flugor måste dissekeras för att få tillräckliga mängder för omics metoder. Fel staplar = SD. (F) ytterligare spår som visar RNA-integritet för de RNA-isoleringsmetoder som visas i figur 4G och i tilläggs figur 1c. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplemental Methods
Kompletterande metoder: En detaljerad beskrivning av de metoder och reagenser som används i hela texten och, i synnerhet, för att generera de data som visas i figur 1A-D, figur 4F-K, figur 5, kompletterande tabell 1, och Kompletterande tabell 2. Dessa data motiverar dissekeringsprotokollet och demonstrerar dess användbarhet för RNA-isolering, mRNA-SEQ, RT-PCR och proteomik. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Relaterade till figur 5 och associerade stycken i huvudtexten
Fliknamn Data Sammanfattning
Sarcomere proteiner Lista över sarcomere gener från Spletter et al. Elife 2018; Här listar vi den nuvarande FBgn och gen namn.
SP-genen units_DESeq2_72h Med hjälp av data från Spletter et al. EMBO rep 2015, tittade vi särskilt på sarcomere gener i mRNA-SEQ data på 72 h APF. Detta är från DESeq2 analys upptäcka differential uttryck på gen enheten nivå mellan kontroll (Mef2-Gal4, UAS-GFM-GMA korsade till w1118) och Mef2-Gal4, UAS-GFM-GMA x Bruno1-IR. Rader markerade i gult signficantly upp eller ner reglerade gener (över/under ett tröskelvärde för log2FC = ABS (1.5)). Dessa data är den röda pricken i figur 5A. För varje sarcomere gen, vi ger identifierarinformation, den log2FC från DESeq2, P värde och justerat P värde, samt DESeq2 normaliserade uttryck räknas.
SP exon_DEXSeq_72h Med hjälp av data från Spletter et al. EMBO rep 2015, tittade vi specifikt på sarcomere Gene exon användning i mRNA-SEQ data på 72 h APF. Detta är från DEXSeq analys upptäcka differentiell exon användning mellan kontroll (Mef2-Gal4, UAS-GFM-GMA korsade till w1118) och Mef2-Gal4, UAS-GFM-GMA x Bruno1-IR. Rader markerade i gult signficantly upp eller ner reglerade exonerna (över/under en tröskel på log2FC = ABS (1.5)). Vi tillhandahåller information om exon och gen identifierare, log2FC från DEXSeq, P-värde och justerat P-värde samt en lista över associerade utskrifter.
Observera att många gener visar reglering av en eller flera exoner i DEXSeq-analysen, ofta med höga log2FC värden och låga P-värde/ADJUST P-värden, medan en begränsad lista över gener visar förändringar vid 72 h APF. Detta stöder en stark effekt av förlust av Bruno om regleringen av alternativa skarvning.

Kompletterande tabell 1: tabell 72 h APF mRNA-SEQ data för sarcomere proteiner som identifierar Differentiellt uttryckta gener (via DESeq2) och exoner (via dexseq) i bru1-IR kontravildtyp ifms.

Som rör figur 5B och associerade stycken i huvudtexten
Fliknamn Data Sammanfattning
Perseus produktion Detta är ett bearbetat data kalkylblad som presenterar de masspektrometridata som används för att generera figur 5B. IFM-exempel är från 1 d Adult Control (w1118) och Mutant (bruno1-m2) flugor. Viktiga kolumner är de transformerade intensitetsvärdena för var och en av de 4 replikaterna för varje prov, t-test-statistiken och signifikans, peptid-ID och motsvarande gen namn och Flybase-ID. Signifance beräknades med standardinställningar i Perseus (FDR <. 05). Det finns 1859 proteiner/peptider som upptäckts, varav 524 (28%) skiljer sig markant mellan proverna.
Nedreglerade Dessa är alla de 252 proteiner/peptider från Perseus produktion som är nedreglerade i bruno1-m2 Mutant IFM. Eftersom Flybase ID och gen namn är föråldrade, vi ger dessutom den nuvarande Flybase gen-ID och gen namn.
Uppreglerad Dessa är alla de 272 proteiner/peptider från Perseus produktion som är uppreglerad i bruno1-m2 Mutant IFM. Eftersom Flybase ID och gen namn är föråldrade, vi ger dessutom den nuvarande Flybase gen-ID och gen namn.
Observera att de sarcomere proteiner som är markerade i rött i figur 5B finns i ovanstående listor. Listan över gener anses vara en del av sarcomere finns i en av flikarna i kompletterande tabell 1.

Kompletterande tabell 2: tabell över hela proteomet Mass-Spectrometry Data från 1 d vuxen som identifierar Differentiellt uttryckta proteiner och protein isoformer i BRUm2Mutant vs. vildtyp ifms.

Discussion

I detta protokoll presenterar vi den grundläggande tekniken för att dissekera Drosophila ifms från tidiga och sena stadier av puppor för nedströms isolering av protein, DNA, RNA eller andra makromolekyler. Protokollet kan enkelt anpassas för att dissekera IFM från vuxna flugor. Vi visar nyttan med vårt dissekeringsprotokoll för mRNA-SEQ, proteomik och RT-PCR-program. Med kontinuerlig förbättring av omics-teknik för att möjliggöra analys av prover med mindre utgångsmaterial och lägre ingångs koncentrationer kommer dessa dissektioner sannolikt att bli värdefulla för många ytterligare tillämpningar. Som ifms är en etablerad modell för mänskliga myopatier4,24 och muskel-typ specifik utveckling9,12, vi föreställa, till exempel, IFM-berikad metabolomics, undersökningar av kromatin konformation via 3C eller 4C, skarvning nätverks utvärdering via CLiP interaktioner eller Phospho-proteomik av myofibrillogenes.

Det är viktigt att tänka på att dessa dissektioner producerar ett prov berikat för IFM i stället för ett rent IFM-prov. Detta är oundvikligt på grund av motoriska neuron innervation, senor bilagor och luftrör invasion av muskelfibrer. Bioinformatik analys kan användas för att identifiera IFM berikade gener eller proteiner, men ytterligare experiment krävs för att visa att de är i själva verket IFM-specifika. Prov renhet kan analyseras med hjälp av publicerade vävnadsspecifika markörer som stripe45 (senan), Act79B4,44 (tubulär muskel), Act88F15 (IFM) eller SYB46 (neuronala specifika). Det kan vara möjligt att använda sådana markörer för att normalisera datauppsättningar till IFM-specifikt innehåll, men användarna varnas för att temporala förändringar i uttrycket av gener som används för normalisering, till exempel av IFM-specifika gener eller tubulin, kan bias ett sådant tillvägagångssätt.

Genetiskt kodade vävnadsspecifika märkningsmetoder, till exempel EC-märkning47,48 eller pabp-märkning49,50 för att isolera RNA har utvecklats under de senaste åren, vilket kan bidra till att få en verkligt vävnadspecifikt RNA-prov. Men EG-märkning kräver konstant utfodring av flugor47 och därmed är inte tillämplig under Pupp stadier. Känsligheten och fullständigheten hos PABP-märkta transkriptomer kan ha begränsningar51. FACS metoder för att isolera enskilda muskelfibrer kompliceras av den stora storleken och syncytial natur av IFMs. Intakt52,53 stil metoder kan tillämpas för att isolera specifika subcellulära-avdelningar från ifms, vilket kan visa sig användbart för att isolera rena populationer av IFM kärnor eller mitokonen. Manuella dissektioner är fortfarande den nuvarande standarden för att få intakt IFM vävnad för de flesta nedströms applikationer.

Prov kvaliteten beror på flera kritiska steg i dissekeringsprocessen. Dissektioner är tekniskt krävande, med dissektionshastighet och prov renhet ökar med erfarenhet. Dissekera för korta tidsperioder (20 – 30 min) i kyld buffert utan rengöringsmedel och omedelbart frysning hjälper till att bevara prov integriteten, som har observerats tidigare för mus senan isolering54. IFMs kan framgångsrikt frysas efter avlägsnande av alla buffert från pelleten, men specifikt för RNA isolering, frysning prover i isolering buffert tenderar att ge bättre resultat. Ifms från upp till 20 separata dissektioner kombineras före RNA eller protein isolering, vilket gör att skala upp och samla tillräckligt med material, även från tidiga tidpunkter eller mutanter16,32, för nedströms analys.

För RNA-tillämpningar kan det mest kritiska steget vara isoleringen av RNA självt. Guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform isolering (metod 1 ovan) överträffar de flesta kommersiella kit testade och, som tidigare nämnts, är betydligt billigare55. Variationen som observerades i RNA-isolationsavkastningar med kommersiella Kits är i samförstånd med tidigare observationer56,57. Vi lägger ytterligare glykogen under isopropanol nederbörd att hjälpa till att återvinna alla RNA. Bortom RNA avkastning, är det viktigt att kontrollera RNA integritet för att säkerställa att provet inte har fragmenterats eller försämrats under dissektion och isolerings processer. Det är också viktigt att arbeta RNase-fri. Slutligen kan valet av RT-kit påverka känsligheten för omvänd Transkription processen. Även om de inte ofta diskuteras i detalj, påverkar alla dessa punkter kvaliteten på IFM-provet och de data som erhålls från nedströmsprogram.

Flera viktiga ändringar ställer in protokollet bortsett från befintliga IFM dissekeringsprotokoll. Även om en detaljerad dissekeringsprotokoll för IFM immunofluorescens finns19, presenterar detta protokoll en annan metod för Pupp dissektioner som möjliggör en snabbare isolering av IFM vävnad. Detta möjliggör insamling av stora mängder IFM vävnad (relativt sett) med begränsad dissekera gånger för att förhindra proteomet eller transkriptome förändringar. Andra protokoll beskriver dissektion av vuxna IFM för att visualisera GFP färgning i enskilda myofibriller39 eller för färgning av larv Body-Wall muskler58, men de inte adress dissektion vid Pupp stadier eller för isolering av RNA eller protein. Denna metod skiljer sig också från det befintliga protokollet för microdissektion av Pupp ifms från kryosections38, som kan generera en renare IFM prov men är mer arbetsintensiva och producerar mindre material. Jämfört med andra Rapid Adult IFM dissektion protokoll38,39, ifms isoleras i PBS buffert utan rengöringsmedel för att begränsa stress induktion och andra stora förändringar uttryck.

Den viktigaste förskott i detta protokoll är införandet av en levande, fluorescerande reporter, vilket gör isolering av ifms vid tidiga Pupp stadier. Vi använder standardmässigt Mef2-GAL459 köra antingen UAS-CD8:: GFP eller UAS-GFP:: GMA60. Detta möjliggör differentiell märkning av IFM (flygmuskler är starkare märkta och annorlunda formade än andra Pupp muskler) samt prestanda GAL4-UAS-baserade manipulationer, till exempel Rescue eller RNAi experiment. Det är också möjligt att kombinera Mef2-GAL4 med tub-GAL80TS för att undvika RNAi-associerad tidig dödlighet eller med UAS-Dcr2 för att öka RNAi Efficiency40.

Det finns ytterligare GAL4 drivrutiner eller GFP-linjer tillgängliga som varierar i muskel-typ specificitet, temporal uttryck mönster och föraren styrka19,61 som kan användas i stället för Mef2-GAL4. Till exempel, Act88F-GAL4 uttrycks först runt 24 h APF, så det kan inte användas för tidigare tidpunkter; Det är dock starkt etiketter IFM och kan vara användbart för att undvika RNAi-associerad tidig dödlighet. Honom-GFP eller Act88F-GFP Label IFM, återigen med temporala restriktioner, men de undviker GAL4 beroende av markör uttryck och kan vara användbara i kombination med en mutant bakgrund av intresse. Listor över andra möjliga markör linjer finns tillgängliga19. Det bör också noteras att användning av transgener och GAL4/UAS systemet kan orsaka gener Expression artefakter, så det är viktigt att använda lämpliga kontroller, till exempel föraren linje korsas till Wild-typ bakgrund stam, så att sådana artefakter är förmodligen samma i alla prover.

Med den medföljande videon syftar detta detaljerade protokoll till att göra Pupp IFM dissektion mer tillgänglig och främja användningen av omics metoder för att studera muskelutveckling. Koppling kraften i Drosophila genetik och cellbiologi med biokemi och omics analyser tillgängliga genom DISSEKERADE IFM har potential att avancera mekanistisk förståelse av myogenes och muskelfunktion. Framtidsstudier länka system-nivå observationer av transkriptome och proteomet reglering till metaboliska och funktionella utgångar kommer att ge en djupare förståelse av muskel-typ specifik utveckling och patogenesen av muskelsjukdomar.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi är tacksamma mot Andreas Ladurner och Frank Schnorrer för generöst stöd. Vi tackar Sandra Esser för utmärkt teknisk assistans och Akanksha Roy för att generera masspektrometri data. Vi erkänner Bloomington och Wien lager centra för att tillhandahålla flugor. Vi tackar Core facility bioimaging för hjälp med konfokalmikroskopi Imaging och zentrallabor für proteinanalytik för analys av masspektrometriprover, både på LMU Biomedical Center (Martinsried, de). Vårt arbete stöddes av Deutsche Forschungs Gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), centrum för Integrated protein Science Munich (CIPSM) vid Ludwig-Maximilians-University München (MLS), Frederich-Bauer Stiftung (MLS) och International Max Planck-Forskningsskolan (EN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5x High Fidelity (HF) buffer Thermo Fisher F518L
60 mm culture dishes Sigma-Aldrich Z643084-600EA Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented
Black dissecting dish (glass) Augusta Laborbedarf 42021010 Lymphbecken, black glass, 4 cm x 4 cm
Black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder Sigma-Aldrich C9157 Also available from most pharmacies
Black silicon dissecting dishes: Sylgard 184 Sigma-Aldrich 761036 Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes).
Blue pestle Sigma-Aldrich Z359947-100EA Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder
Cell phone camera, Samsung Galaxy S9 Samsung SM-G960F/DS used for photos not taken under a microscope
Chloroform PanReac AppliChem A3691,0500
Confocal microscope, Leica SP8X upright confocal Leica www.leica-microsystems.com
Confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal Zeiss www.zeiss.com
Double stick tape Scotch/3M 3M ID 70005108587 Double-sided tape, available at most office supply handlers
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 mm x 0.02 mm tip
EtOH (100%, RNase free) Sigma-Aldrich 32205-M
fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera Leica www.leica-microsystems.com
Fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0 Leica www.leica-microsystems.com
Fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC Leica www.leica-microsystems.com
Fly: Bru1[M2] Fly stock; This paper
Fly: Bru1[M3] Fly stock; This paper
Fly: Mef2-GAL4 Bloomington Stock Center BDSC:27390 Fly stock
Fly: salm[1] Bloomington Stock Center 3274 Fly stock
Fly: salm[FRT] Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018
Fly: UAS-Bru1IR Vienna Drosophila Research Center GD41568 Fly stock, RNAi hairpin
Fly: UAS-GFP::Gma Bloomington Stock Center BDSC:31776 Fly stock
Fly: UAS-mCD8a::GFP Bloomington Stock Center BDSC:5130 Fly stock
Fly: w[1118] Bloomington Stock Center 3605 Fly stock
Fly: weeP26 Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003
GFP detection reagent, GFP-Booster ChromoTek gba488-100
Glycogen Invitrogen 10814-010
Image processing software, Photoshop CS6 Adobe www.adobe.com
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516-25ML 2-propanol
Method 1 (RNA isolation): TRIzol Life Technologies 15596018 Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution
Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit Invitrogen AM1907 TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA
Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit Zymo Research R2070S RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.
Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.
Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System Promega Z6110 We applied the protocol for ‘Purification of RNA from Fibrous Tissues’.
Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit New England Biolabs T2010G We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 μL of RNA Protection Reagent.
Microcentrifuge tubes Thermo Fisher AM12400 RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL
Microscope slides Thermo Fisher 12342108 Standard slides, uncharged, 1 mm
Microtome blades PFM Medical 207500003 C35 feather 80 mm
Monarch DNase I New England Biolabs T2004-21
Monarch DNase I Reaction Buffer New England Biolabs T2005-21
Normal goat serum Thermo Fisher 16210072
OneTaq Polymerase New England Biolabs M0480X
Paintbrush Marabu 1910000000 Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PBS buffer (1x) Sigma-Aldrich P4417 Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4
PFA PureTip Pipette Tips Elemental Scientific ES-7000-0101 Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice
Phusion High Fidelity Polymerase Thermo Fisher F-530XL
Pipette tips Sigma-Aldrich P5161 Universal 200 mL pipette tips
Preomics iST 8x Kit Preomics P.O.00001 peptide preparation kit for mass spectrometry
Q Exactive mass spectrometer Thermo Fisher 725500 mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center
Qubit RNA Assay Kit Life Technologies Q32855
Rhodamine-phalloidin Invitrogen, Molecular Probes 10063052
RNA concentration Approach 1 & RNA integrity traces, Bioanalyzer Agilent Technologies G2939BA
RNA concentration Approach 2, Nanodrop Thermo Fisher ND-2000
RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer Invitrogen Q33238
RNA Pico Chips Agilent Technologies 5067-1513
RNase A Promega A7937
RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758 DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.
RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit Invitrogen 18080-044 reverse transcription kit
RT Kit #2: LunaScript New England Biolabs E3010S reverse transcription kit
RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit Qiagen 205410 reverse transcription kit
Slide mounting buffer, Vectashield Vector Laboratories H-1200 containing DAPI
Statistical software: GraphPad Prism GraphPad Prism www.graphpad.com
Statistical software: Microscoft Excel Microsoft Purchased as part of the bundle: Office Home & Student 2019
Table-top centrifuge Eppendorf 5405000760 Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent
Tissue/ Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956 Standard tissue wipes
Transfer pipette Sigma-Aldrich Z350796 Plastic pipette
Triton-X100 Sigma-Aldrich T9284-500ML
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-00 3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm
Whatman paper Sigma-Aldrich 1004-070 Filter paper circles, Grade 4, 70 mm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rexiati, M., Sun, M., Guo, W. Muscle-Specific Mis-Splicing and Heart Disease Exemplified by RBM20. Genes. 9 (1), 18 (2018).
  2. Guo, W., et al. RBM20, a gene for hereditary cardiomyopathy, regulates titin splicing. Nature Medicine. 18 (5), 766-773 (2012).
  3. Guo, W., et al. Splicing Factor RBM20 Regulates Transcriptional Network of Titin Associated and Calcium Handling Genes in The Heart. International Journal of Biological Sciences. 14 (4), 369-380 (2018).
  4. Nikonova, E., Kao, S. -Y., Ravichandran, K., Wittner, A., Spletter, M. L. Conserved functions of RNA-binding proteins in muscle. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 110, 29-49 (2019).
  5. Wang, E. T., et al. Dysregulation of mRNA Localization and Translation in Genetic Disease. The Journal of Neuroscience. 36 (45), 11418-11426 (2016).
  6. Wang, E. T., et al. Antagonistic regulation of mRNA expression and splicing by CELF and MBNL proteins. Genome Research. 25 (6), 858-871 (2015).
  7. Kalsotra, A., et al. A postnatal switch of CELF and MBNL proteins reprograms alternative splicing in the developing heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20333-20338 (2008).
  8. Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. The EMBO Journal. 23 (15), 3103-3112 (2004).
  9. Lemke, S. B., Schnorrer, F. Mechanical forces during muscle development. Mechanisms of Development. 144, Pt A 92-101 (2017).
  10. Iwamoto, H. Structure, function and evolution of insect flight muscle. Biophysics. 7, 21-28 (2011).
  11. Schnorrer, F., Dickson, B. J. Muscle building; mechanisms of myotube guidance and attachment site selection. Developmental Cell. 7 (1), 9-20 (2004).
  12. Spletter, M. L., Schnorrer, F. Transcriptional regulation and alternative splicing cooperate in muscle fiber-type specification in flies and mammals. Experimental Cell Research. 321 (1), 90-98 (2014).
  13. Benoist, P., Mas, J. A., Marco, R., Cervera, M. Differential muscle-type expression of the Drosophila troponin T gene. A 3-base pair microexon is involved in visceral and adult hypodermic muscle specification. Journal of Biological Chemistry. 273 (13), 7538-7546 (1998).
  14. Schönbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
  15. Bryantsev, A. L., et al. Extradenticle and Homothorax Control Adult Muscle Fiber Identity in Drosophila. Developmental Cell. 23 (3), 664-673 (2012).
  16. Spletter, M. L., et al. The RNA-binding protein Arrest (Bruno) regulates alternative splicing to enable myofibril maturation in Drosophila flight muscle. EMBO Reports. 16 (2), 178-191 (2015).
  17. Oas, S. T., Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Arrest is a regulator of fiber-specific alternative splicing in the indirect flight muscles of Drosophila. The Journal of Cell Biology. 206 (7), 895-908 (2014).
  18. Kim, J. H., Jin, P., Duan, R., Chen, E. H. ScienceDirect Mechanisms of myoblast fusion during muscle development. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 162-170 (2015).
  19. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), San Diego, Calif. 2-14 (2014).
  20. Rai, M., Nongthomba, U., Grounds, M. D. Skeletal Muscle Degeneration and Regeneration in Mice and Flies. Mechanisms of Regeneration. 108, Elsevier Inc. 247-281 (2014).
  21. Swank, D. M., Wells, L., Kronert, W. A., Morrill, G. E., Bernstein, S. I. Determining structure/function relationships for sarcomeric myosin heavy chain by genetic and transgenic manipulation of Drosophila. Microscopy Research and Technique. 50 (6), 430-442 (2000).
  22. de Joussineau, C., Bataillé, L., Jagla, T., Jagla, K. Diversification of muscle types in Drosophila: upstream and downstream of identity genes. Current Topics in Developmental Biology. 98, 277-301 (2012).
  23. Maqbool, T., Jagla, K. Genetic control of muscle development: learning from Drosophila. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 28 (7-8), 397-407 (2008).
  24. Jagla, K., Kalman, B., Boudou, T., Hénon, S., Batonnet-Pichon, S. Beyond mice: Emerging and transdisciplinary models for the study of early-onset myopathies. Seminars in Cell & Developmental Biology. 64, 171-180 (2017).
  25. Haigh, S. E., et al. Drosophila indirect flight muscle specific Act88F actin mutants as a model system for studying congenital myopathies of the human ACTA1 skeletal muscle actin gene. Neuromuscular Disorders. 20 (6), 363-374 (2010).
  26. Batonnet-Pichon, S., et al. Myofibrillar Myopathies: New Perspectives from Animal Models to Potential Therapeutic Approaches. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (1), 1-15 (2017).
  27. Kreipke, R. E., Kwon, Y. V., Shcherbata, H. R., Ruohola-Baker, H. Drosophila melanogaster as a Model of Muscle Degeneration Disorders. Current Topics in Developmental Biology. 121, 83-109 (2017).
  28. Souidi, A., Zmojdzian, M., Jagla, K. Dissecting Pathogenetic Mechanisms and Therapeutic Strategies in Drosophila Models of Myotonic Dystrophy Type 1. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4104 (2018).
  29. Sparrow, J., Hughes, S. M., Segalat, L. Other Model Organisms for Sarcomeric Muscle Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 642, 192-206 (2008).
  30. Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 1184, 1-20 (2010).
  31. Swank, D. M. Mechanical analysis of Drosophila indirect flight and jump muscles. Methods. 56 (1), 69-77 (2012).
  32. Spletter, M. L., et al. A transcriptomics resource reveals a transcriptional transition during ordered sarcomere morphogenesis in flight muscle. eLife. 7, 1361 (2018).
  33. Weitkunat, M., Kaya-Çopur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle. Current Biology. 24 (7), 705-716 (2014).
  34. Gunage, R. D., Dhanyasi, N., Reichert, H., VijayRaghavan, K. Drosophila adult muscle development and regeneration. Seminars in Cell & Developmental Biology. 72, 56-66 (2017).
  35. Weitkunat, M., Brasse, M., Bausch, A. R., Schnorrer, F. Mechanical tension and spontaneous muscle twitching precede the formation of cross-striated muscle in vivo. Development. 144 (7), 1261-1272 (2017).
  36. Zappia, M. P., Rogers, A., Islam, A. B. M. M. K., Frolov, M. V. Rbf Activates the Myogenic Transcriptional Program to Promote Skeletal Muscle Differentiation. Cell Reports. 26 (3), 702-719 (2019).
  37. Zappia, M. P., Frolov, M. V. E2F function in muscle growth is necessary and sufficient for viability in Drosophila. Nature Communications. 7 (1), 10509 (2016).
  38. Bryantsev, A. L., et al. Myogenesis in Drosophila melanogaster: Dissection of Distinct Muscle Types for Molecular Analysis. Methods in Molecular Biology. 1889 (5), 267-281 (2019).
  39. Xiao, Y. S., Schöck, F., González-Morales, N. Rapid IFM Dissection for Visualizing Fluorescently Tagged Sarcomeric Proteins. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
  40. Kaya-Çopur, A., Schnorrer, F. RNA Interference Screening for Genes Regulating Drosophila Muscle Morphogenesis. Myogenesis. 1889, Chapter 20 331-348 (2019).
  41. Chechenova, M. B., et al. Functional redundancy and non-redundancy between two Troponin C isoforms in Drosophila adult muscles. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 760-770 (2017).
  42. Alberts, B. Molecular Biology of the Cell. , Garland Science. New York, NY. (2017).
  43. Clyne, P. J., Brotman, J. S., Sweeney, S. T., Davis, G. Green fluorescent protein tagging Drosophila proteins at their native genomic loci with small P elements. Genetics. 165 (3), 1433-1441 (2003).
  44. Orfanos, Z., Sparrow, J. C. Myosin isoform switching during assembly of the Drosophila flight muscle thick filament lattice. Journal of Cell Science. 126 (1), 139-148 (2013).
  45. Volohonsky, G., Edenfeld, G., Klambt, C., Volk, T. Muscle-dependent maturation of tendon cells is induced by post-transcriptional regulation of stripeA. Development. 134 (2), 347-356 (2007).
  46. Estes, P. S., Ho, G. L., Narayanan, R., Ramaswami, M. Synaptic localization and restricted diffusion of a Drosophila neuronal synaptobrevin--green fluorescent protein chimera in vivo. Journal of Neurogenetics. 13 (4), 233-255 (2000).
  47. Hida, N., et al. EC-tagging allows cell type-specific RNA analysis. Nucleic Acids Research. 45 (15), 138 (2017).
  48. Thomas, A., et al. A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila. PLoS ONE. 7 (7), 40276 (2012).
  49. Yang, Z. Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging. Nucleic Acids Research. 33 (17), 148 (2005).
  50. Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 14110-14115 (2007).
  51. Blazie, S. M., et al. Comparative RNA-Seq analysis reveals pervasive tissue-specific alternative polyadenylation in Caenorhabditis elegans intestine and muscles. BMC Biology. 13 (1), 1775-1821 (2015).
  52. Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic Acids Research. 40 (19), 9691-9704 (2012).
  53. Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nature Protocols. 6 (1), 56-68 (2011).
  54. Grinstein, M., Dingwall, H. L., Shah, R. R., Capellini, T. D., Galloway, J. L. A robust method for RNA extraction and purification from a single adult mouse tendon. PeerJ. 6 (8), 4664 (2018).
  55. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. , (2012).
  56. Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18 (1), 16 (2018).
  57. Ford, K. L., et al. Optimisation of laboratory methods for whole transcriptomic RNA analyses in human left ventricular biopsies and blood samples of clinical relevance. PLoS ONE. 14 (3), 02136855 (2019).
  58. Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harbor Protocols. (8), 5469 (2010).
  59. Ranganayakulu, G., Schulz, R. A., Olson, E. N. Wingless signaling induces nautilus expression in the ventral mesoderm of the Drosophila embryo. Developmental Biology. 176 (1), 143-148 (1996).
  60. Dutta, D., Bloor, J. W., Ruiz-Gómez, M., VijayRaghavan, K., Kiehart, D. P. Real-time imaging of morphogenetic movements in Drosophila using Gal4-UAS-driven expression of GFP fused to the actin-binding domain of moesin. Genesis. 34 (1-2), 146-151 (2002).
  61. Lemke, S. B., Schnorrer, F. In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae. Journal of Visualized Experiments. (132), e57312 (2018).

Tags

Genetik Drosophila utvecklingsbiologi indirekta flygmuskler levande dissektion Pupp utveckling masspektrometri RNA-SEQ RNA-isolering Bruno1 alternativa skarvning
Dissektion av <em>Drosophila melanogaster</em> flygmuskler för omics närmar sig
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kao, S. Y., Nikonova, E.,… More

Kao, S. Y., Nikonova, E., Ravichandran, K., Spletter, M. L. Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches. J. Vis. Exp. (152), e60309, doi:10.3791/60309 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter