Summary
ショウジョウバエ飛行筋は、転写調節、代替スプライシング、代謝、およびメカノバイオロジーを研究するための強力なモデルです。我々は、プロテオミクスおよび深いシーケンシングに最適な高濃縮サンプルを生成するために、生きている子犬から蛍光標識飛行筋を解剖するためのプロトコルを提示する。これらのサンプルは、筋肉の発達の多様な側面に重要な機械的洞察を提供することができます。
Abstract
ショウジョウバエ飛行筋は、転写調節、代替スプライシング、代謝、メカノバイオロジーなどの多様なプロセスを研究するための強力なモデルであり、筋肉の発達と筋線維新症に影響を与えます。質量分析や深いシーケンシングによって生成されたようなオミクスデータは、これらの生物学的プロセスに重要な機械的洞察を提供することができます。このようなアプローチでは、オミクス指紋の選択性と特異性の両方を高めるために、組織特異的なサンプルを分析することが有益です。ここでは、オミクス用途に対して高濃縮された筋肉サンプルを生成するために、生きている子犬から蛍光標識飛行筋を解剖するためのプロトコルを提示する。最初に、緑色蛍光タンパク質(GFP)標識によって筋肉が識別可能な初期の水疱の段階(<48hの子犬の形成後(<48 h)で飛行筋肉を解剖する方法について説明します。次に、解剖顕微鏡下で筋肉が区別可能な場合に、後期の子犬(>48 h APF)または成人から筋肉を解剖する方法について説明します。付属のビデオプロトコルは、これらの技術的に要求の厳しい解剖は、筋肉とショウジョウバエ研究コミュニティに広くアクセスできるようになります。RNAアプリケーションでは、異なる時点で、異なるアプローチで単離できるRNAの量と品質をアッセイします。さらに、Bruno1(Bru1)がミオシン重鎖(Mhc)スプライシングの時間的シフトに必要であることを示し、解剖された筋肉がmRNA-Seq、質量分析、および逆転転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)に使用できることを実証する。アプリケーション。この解剖プロトコルは、組織特異的なオミクス分析を促進するのに役立ち、一般的に筋形成の複数の生物学的側面を研究するために適用することができる。
Introduction
現代のオミクス技術は、筋肉の発達と人間の筋肉障害の根底にあるメカニズムに重要な洞察を提供します。例えば、動物モデルにおける遺伝的および生化学的検証と組み合わせたトランスクリプトミクスデータの分析は、30以上のサルコメアの標的ネットワークの調節に起因する拡張型心筋症を引き起こすスプライシング因子RBM20の喪失を引き起こすことを明らかにした。以前に心臓病に関連した遺伝子, ティチン1,2,3を含む.
第2の例では、細胞培養、動物モデル、およびヒト患者からの研究は、筋緊張性ジストロフィーが筋盲目(MBNL)の隔離およびCELF14、5のアップレギュレーションによるRNA調節の中断によって引き起こされたことを示している。MBNLとCELF1(CUGBP1またはブルーノ様2とも呼ばれる)間の交差調節および時間的ダイナミクスは、筋力ジストロフィー患者における持続的な胚性スプライシングパターンを説明するのに役立つ。さらに、誤って規制された標的の大規模なネットワークは、病気4、6、7、8の複雑な性質を説明するのに役立ちます。このような研究の大半は、ヒトの筋肉疾患の根底にあるメカニズムを理解するために、遺伝モデル生物におけるオミクスアプローチを利用しています。さらに、健康な筋肉における時間的および組織型の特定遺伝子発現、タンパク質修飾、代謝パターンを最初に理解し、病気や老化した筋肉の変化を理解することの重要性を強調する。
ショウジョウバエメラノガスターは、もう一つの確立された遺伝モデル生物です。サルコメアの構造と個々のサルコメア成分は、ハエから脊椎動物4、9、10まで高度に保存され、間接飛行筋肉(IFM)は研究する強力なモデルとなっています。筋肉の発達の複数の側面11,12.第1に、線維飛行筋は、管状体筋11、13とは機能的および形態的に異なり、筋肉型特異的発達機構の調査を可能にする。スパルトメジャー(Salm)14、エクスデンティクル(Exd)、およびホモソラックス(Hth)15を含む転写因子は、フィブリル運命調節因子として同定されている。さらに、サルムの下流、CELF1ホモログブルーノ1(Bru1、アレット)は、フィブリル特異的スプライシングプログラム16、17を指示します。
第二に、IFMは筋芽生全性融合および筋管愛着から筋症形成およびサルコメア成熟9、18、19に至る筋形成の過程を理解するための重要なモデルである。第三に、ショウジョウバエ遺伝学は、個々のタンパク質、タンパク質ドメイン、およびタンパク質アイソフォームによるサルコメア形成、機能、および生物物理学的特性20、21、22への寄与の調査を可能にする。 、23.最後に、IFMモデルは、筋緊張性ジストロフィー、筋頭筋筋症、筋変性疾患、アクチノパシーなど、複数のヒト筋障害の研究のために開発されました24,25,26 、27、および疾患メカニズムおよび潜在的な治療法に関する重要な洞察を提供している28,29,30.したがって、ショウジョウバエは、筋肉型特異的転写、スプライシング、クロマチン調節のメカニズム、ならびに筋肉発達における代謝の役割を含む、筋形成分野における多くの未解決の質問に対処するのに有用なモデルである。現代のオミクス技術の応用は、特にショウジョウバエで利用可能な多種多様な遺伝的、生化学的および細胞生物学的アッセイと組み合わせることで、筋肉の理解を劇的に進める可能性を秘めている。発達、老化、病気。
IFMは、大人31、32の胸郭の全長にわたってほぼ1ミリメートルに及ぶハエの最大の筋肉です。しかし、この小さなサイズは、組織型の特定の方法でショウジョウバエのオミクス技術を適用するのに十分なサンプルを得ることに挑戦を生成します。さらに、IFMは、子犬の段階で形成される成人の筋肉の一部です。ミオブラストヒューズは、子宮形成後24時間後に腱に付着し、30時間APF(図1A-D)18,33の周り筋線形成を開始するために必要な圧縮ステップを受ける筋管を形成する。 34.
筋線維は胸郭の全長に及ぶまで成長し、筋線維は約48h APFまでサルコメア添加に焦点を当てた初期成長期を経て、その後、サルコメアが長さと幅で成長し、成熟期に移行し、72 h APF (図 1A-D)32,35によってストレッチ活性化を確立するために改造。繊維成熟の発症は、少なくとも部分的にSalmおよびE2F32、36、37によって制御され、そのスプライシングがBru1によって制御される複数のIFM特異的サルコメアタンパク質アイソフォームは、この間に組み込まれるフェーズ16,17.成熟したハエは90-100 h APFから閉じます。これは、筋肉の発達を研究するために、IFMは、オミクスアプローチを使用して分析を容易にするために、複数の水疱のタイムポイントから十分な量、品質、および純度で分離されなくてはならないことを意味します。
IFM 解剖用のプロトコルがいくつか公開されています。これらのプロトコルは、意図したアプリケーションに適していますが、オミクスアプローチに最適なものはありません。プパールおよび成人IFM19の免疫蛍光のためのIFM形態を保存するプロトコルは、機械的評価31のためにIFM繊維を単離するか、または凍結切除38からプパルIFMの微小解剖を利用するはあまりにも専門的で時間が多すぎるオミクスの適用のための十分な量のIFMティッシュを合理的に得るために集中的にする。他のプロトコルは、特異的に成人IFM38、39の迅速な解剖のために開発され、従って、pupal段階には適用されず、理想的でないか、またはRNA単離と互換性がない可能性のあるバッファーを使用する。したがって、生化学またはオミクス用途用のpupal IFMを分離するための新しいアプローチを開発する必要がある。
ここでは、成人段階16、32を通じて16h APFからmRNA-Seq分析に成功したプパル段階中のIFMの解剖のためのプロトコルを提示する。このプロトコルは、緑色蛍光タンパク質(GFP)ラベルを採用して、蛍光および成人の発達のすべての段階でIFMを同定し、蛍光解剖顕微鏡下での生解剖を可能にします。このアプローチは、既存の IFM 解剖プロトコルよりも高いスループットを持つ、より少ない労力を伴います。これにより、サンプルの迅速な単離および凍結保存が可能になり、オミクスアプローチの解剖の数回のラウンド後に十分な材料を生成するだけでなく、標準的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)またはウェスタンブロッティングを生成します。
このプロトコルは2つの部分で示し、48 h APFの前(初期変態時、IFMアタッチメントがより緊張している場合)と48 h APF後(pupalボディプランとIFMアタッチメントが明確に定義されている場合)の両方でIFMを迅速に解剖する方法を示します。我々は、すべての時点で解剖されたIFMから高品質のRNAを分離し、RNA分離および逆転転写に対する異なるアプローチに関するデータを提示できることを実証する。最後に、CELF1ホモログブルーノ1を例にしたmRNA-Seq、質量分析、RT-PCRへの解剖プロトコルの応用を示す。ブルーノ1変異体IFMからのプロテオミクスデータにおけるサルコメアタンパク質アイソフォームの誤発現を示し、ミオシン重鎖のC末端スプライス事象のBruno1調節を調べる(Mhc)。これらの結果は、オミクスデータが生物学的現象をより深く理解し、遺伝的および生化学的実験を補完する方法を示している。
Protocol
1. プパエのステージング
- ボトル内の所望の遺伝子型のハエを上げる(図1E)。解剖ストックの新鮮なフリップを作るか、少なくとも20人の女性の処女ハエと十字架を設定します。ハエが子犬を始めるまでボトルを維持します。
- 濡れたペイントブラシでプリパペを収集し、60mmペトリ皿で濡れたフィルターペーパーに転送します(図1F)。
- 子犬をセックスし、実験に適した性別を収集する(図1G)。男性は精巣の存在によって識別され、それ以外の場合は不透明なパパに半透明のボールとして現れる。
- 時間、日付、遺伝子型でペトリ皿にラベルを付け、その後、所望の段階に子犬を熟出します(図1H)。
注:温度制御されたインキュベーターで十字架/ストックと年齢の子犬を維持します(すなわち、RNAiクロスの場合は25°Cまたは27 °C、高温でのGal4活性の増加はノックダウン効率40を増加させます)。数日熟成時に子犬が乾燥しないように湿度が十分に高いことを確認してください。
2. 48 h APF 前のIFM解剖
- 2つの#5バイオロジーグレード鉗子、ピペット、ピペットチップ、ドライアイス、および(RNAサンプル用)絶縁試薬を含む必要な機器を組み立てます(材料の表を参照)。さらに、チルブラック解剖皿(材料の表を参照)、1xリン酸緩衝生理食べ物(PBS)バッファ、および氷上の1.5mLマイクロ遠心管を参照してください。
- 濡れたペイントブラシを使用して、ステージングされたpupaeを冷たい1x PBSで約3分の2を満たした黒い解剖皿に移します(図2A,B)。蛍光解剖顕微鏡に移動します。
注:30分の時間枠内で解剖できる限り多くの子犬を使用してください。経験に応じて、これは3-15パペの範囲です。黒い解剖料理の代替案の議論については、「補足方法」を参照してください。 - #5鉗子を使用して、黒い解剖皿の底に子犬の1つを押し、顕微鏡ズームを調整し、pupaをはっきりと見るように焦点を合わせます(図2C)。
- 1つの鉗子(図2D)で子犬の前部をつかみ、その後、胸部のすぐ後ろに、腹部のわずかに中央から離れた他の鉗子の単一の先端で子犬を突く。これにより、子犬が所定の位置に保持され、IFMが腹部に移動するのを防ぎます(図2E)。
注:この時点から解剖の長さのタイミングを開始します。解剖の定義された長さ(例えば20-30分)を使用して、筋肉死および関連する転写およびプロテオミクスの変化を最小限に抑える。この期間にできるだけ多くのハエを解剖します。 - 最初の鉗子を使用して、プパルケースの前半分を取り外します(図2F)。
- 同じ鉗子を使用して、露出した子犬を胸部のすぐ後ろにつまみ、腹部を胸郭から分離します(図2G)。
- 鉗子を使用して、胸郭の前部を静かに絞るか(<35 h APF用)、または胸郭を開けて蛍光標識IFM(図2 H)を露出させる。IFMは、初期の時点で腱の取り付けが壊れやすいので、表皮から簡単に切り離されます。残りの死体を鉗子で捨てて皿の反対側に押し込みます。
- ステップ2.3-2.7を繰り返し、追加の子犬を解剖する。
- 鉗子でIFM繊維を収集し、黒い解剖皿の底部の山にそれらを整理する(図2I,J)。鉗子を使用して視野からそれを押し出すことによって、任意の破片を削除します。
注:練習では、鉗子の先端は互いに触れることなく近くに持って来ることができる。この手法を使用すると、IFM を破棄せずにゆるやかにつかむことができます。別の方法は、単一の先端または完全に閉じた鉗子でIFMを静かに押し上げたり持ち上げたり、IFMで脂肪や他の組織を取り出し、ステップ2.10で説明するように脂肪を除去することです。 - 品質管理 IFM 筋肉サンプル, 鉗子を使用してサンプルから非IFM筋肉, 脂肪, キューティクルなどを除去する (図 2K, L).
注:Mef2-Gal4では、IFMは初期の時点で他の筋肉タイプよりも強く標識され(図2K,K')、蛍光強度と筋肉形状に基づいてジャンプ筋および幼虫筋の除去を可能にする。脂肪およびキューティクル組織は異なって見え、筋肉特異的蛍光標識によって標識されていない(図2K,K')。IFM にラベルを付け、その他の Gal4 行については、「ディスカッション」セクションを参照してください。 - 切り取られたピペット先端を使用して、IFMの山を1.5mLのマイクロ遠心分離管に移し、250 μLの冷蔵1x PBS(図2M-O)で満たします。直ちにセクション 4 に進みます。
注:IFMサンプルは、ピペット先端の側面に貼り付けるだけで失われる可能性があります。IFMを収集する前にバッファを数回上下に動かせば、標準的なチップの粘着性が低くなり、表面張力が低いシリファイドまたはパーフルオロアルコキシー(PFA)のヒント(材料の表を参照)がサンプル損失を防ぐのに役立ちます。
3. 48 h APF後のIFM解剖
- 2つの#5生物学グレード鉗子、ファインハサミ、標準的なガラス顕微鏡スライド、ダブルスティックテープ、ピペット、ピペットチップ、ドライアイス、および(RNAアプリケーション用)絶縁試薬を含む必要な機器を組み立てます(材料の表を参照)。氷の上に1x PBSとマイクロ遠心管を冷やします。
- 軽く濡れたペイントブラシを使用して、段階的な子犬を顕微鏡スライドに取り付けた両面粘着テープのストリップに移します(図3A)。同じ向きの線に子犬を置きます(スライドの下部に向かって腹部を下にして前にします)。
注:ペンキブラシやフィルターに水を多く使いすぎないように注意してください。子犬が付いていない場合は、まず乾いたフィルターまたはティッシュペーパーに移して乾燥させます。30分の時間枠内で解剖できる限り多くの子犬をマウントし、理想的には〜10パペ。 - 子犬を子犬のケースから取り除く。鉗子を使って離れて、前の尖塔の上の子犬のケースを開きます(図3B)。
- 鉗子のペアを後部に向かってそっとスライドさせ、鉗子が動くにつれて子犬のケースを切り取る(図3B')。下の子犬を破裂しないように注意してください。開いた場合からpupaを解放し、すぐに2番目の顕微鏡スライド上の1x PBSの滴に移します(図3B",C)。
- ライン内のすべての子犬に対して手順 3.3 と 3.4 を繰り返し、ダブルスティック テープ スライドを脇に置きます。
- 細かいはさみを使って、子犬の腹部を胸郭から切り取り、別の杭に押し込む(図3D,D')。残りの子犬についても同じ手順を繰り返します。
注:ステップ3.6で解剖の長さのタイミングを開始します, pupalの完全性が中断されるとすぐに.細胞死および関連する転写およびプロテオミクスの変化を防ぐために、20-30分でできるだけ多くのハエを解剖する。1 d 大人または >90 h pupae を解剖する場合は、後で細かいはさみで頭部を取り除くのに便利です。 - ティッシュペーパーを使用して、1x PBSの大部分(一般的に浮遊脂肪で曇り)と腹部の山を取り除きます(図3E)。残りの胸部に新鮮な、冷やされた1x PBSの滴を追加します。
- はさみを使って胸郭を半分に切ります(図3F、F')。または、頭部を取り外した場合は、まず頭部が取り付けられたはさみを挿入し、胸郭の上半分をIFMの間で縦方向に切ります。次いで、胸郭の腹部側を同じ向きで第2の切り取りで切断する。
- すべての子犬を解剖するために手順3.7と3.8を繰り返し、スライドの中心付近に胸部の方面標本の山を生成します。多続部分が乾燥しないように、スライド上に十分な冷やされた1x PBSがあることを確認します。
注:48 h APF の後、IFM は、訓練を受けた目に標準的な解剖顕微鏡の下で見えるのに十分な大きさです。プロトコルのこの時点で、蛍光標識を持つ筋肉は、IFM同定またはトレーニング目的のために役立つ蛍光解剖範囲に移動することができますが、これは必要ありません。 - 胸部からIFMを解剖します。#5鉗子を使用してヘミセクションの 1 つを分離します (図 3G,H)。IFMの真ん中の上下に1つの鉗子の先端を静かに挿入します(図3G',H')。最初の鉗子をまだ保持しながら、細かいはさみを使用して、キューティクルと腱からIFMの一方の端を切り取ります。次に、IFMのもう一方の端をキューティクルから切り取る(図3G',H'')。
注:最初のIFMカット後の胸郭の向きに応じて、2番目のIFMカットが実行しやすくなるように胸部を180°回転させることが有用である。 - 鉗子で胸部からIFMバンドルを取り出し(図3G'''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''を、PBSバブルの端に移して、水張力を使用して所定の位置に保持します(図3I)。死体をスライドの反対側に押します。残りの胸郭の各部を繰り返し、解剖された IFM のコレクションを生成します。
注:IFMがきちんとした山の中にとどまらない場合は、ティッシュで1x PBSの一部を取り除きます。すべての PBS が蒸発しないように注意し、解剖された IFM とヘミソラックスがバッファーで覆われたままであることを確認してください。 - すべてのIFMを解剖した後、すぐに解剖された筋肉の品質管理を行います。#5鉗子を使用して、サンプルに入り込んだ可能性のあるジャンプ筋またはキューティクル断片を取り除きます(図3J-K')。
注:ジャンプ筋肉はIFMとは異なって表示されます。蛍光下でMef2-Gal4標識筋を解剖した場合、ジャンプ筋は蛍光が弱く、形状や質感が異なる。通常の光の下では、IFMが不透明で乳白色の黄色である間、それはほぼ半透明に見えます(図3J-J'',K)。 - 水張力を使用して、鉗子のペア間で解剖されたIFMを捕捉する(ただし、つぶさない)(図3L)。IFMを1.5mLのマイクロ遠心分離管に移し、250 μLの冷蔵1x PBS(図3M)であらかじめ充填した。セクション 4 に直ちに進みます。
注:鉗子の先端が互いに近接して持ち上げられ、バッファー溶液から持ち上げられると、水張りは鉗子の先端の間で捕捉されるバッファーの泡を引き起こす。IFMもこのバブルに存在する場合、溶液から持ち上げられ、別のバッファー充填容器に簡単に転送できます。バッファーバブルで捕捉された組織をマセレーションしないように、互いに触れることなく互いに近くに先端を持って来るために鉗子を絞ることが重要です。
4. ペレットとIFMサンプルの保存
- テーブルトップ遠心分離機で2,000 x gで3〜5分間1.5mLマイクロ遠心分離管を遠心分離することによりIFMをペレットします(図4A,B)。
- ピペットチップ(図4C)を使用してバッファを取り外します。
- RNA アプリケーションの場合、所望の RNA 単離バッファーの 50 ~ 100 μL で IFM ペレットを再中断します (材料表、図 4Dを参照)。それ以外の場合は、手順 4.4 に進みます。
注:IFMは、質量分析製剤または市販キットでRNAを単離するためにステップ4.2の後に乾燥凍結することができる(代表的な結果を参照)。RNAアプリケーションの場合、IFMペレットを絶縁バッファー内で直ちに再中断および凍結することにより、より良い結果が得られます。 - ドライアイスでサンプルを凍結するか、液体窒素でスナップ凍結する(図4E)。下流分析のためのサンプル準備の後続のステップの準備ができるまで-80 °Cで貯える。
注:凍結保存後、サンプルは下流調査のために処理する前に数ヶ月間保存することができます。
Representative Results
上記の解剖プロトコルは、成人期まで、パパリウム形成(APF)後16時間からIFM富化サンプルを生成するのに有用である。解剖された飛行筋肉サンプルは、複数のアプリケーションに使用することができ、これまでのところ、RT-PCR4、17、RNA-Seq16、32、ChIP36、37、西洋に正常に適用されていますブロッティング14、41および質量分析実験(下記参照)。RNA ベースのアプリケーションを解剖する潜在的なユーザーを支援するために、まず、IFM からの RNA の分離に関する重要な考慮事項を強調する結果を示します。解剖プロトコルの有用性をより広く実証するために、RNA結合タンパク質Bruno1に関するデータを使用して、可能な-omicsアプリケーションのいくつかを説明します。
IFM解剖プロトコルは、高品質のRNAを生み出します
コードmRNAは全RNA42のわずか1~5%しか構成されないと推定されるので、予め解剖されるハエの数を決定することが重要である。1d成人から解剖したIFMからフライ当たりの総RNAの平均24±9ngを得た(図4Fおよび補足図1A)。このフライ当たりの総RNAの収量は比較的一定であり、16h APF、24h APF、30 h APF、48 h APF、72 h APFおよび90 h APF(図4Fおよび補足図1B、D,E)で解剖されたIFMについて約25ng変動する。これらの観察はまた、脂肪、腱、気管または他の細胞タイプを汚染から単離された任意のRNAを反映し、以前の時点から単離されたサンプルで高い可能性があります。そこで、50ハエからIFMから総RNAの>1 μgを得て、通常100~150ハエからIFMを解剖し、RNA-Seqサンプルの総RNAの>3 μgを生成しました。
RNA単離の方法は、回収されたRNAの量と質に影響を与え、ユーザーが単離アプローチを検証することを奨励します。例えば、方法1を用いた単離は、50 1 d大人のハエからIFMからの総RNAの平均1143±465ngを生成するが、様々な市販キットとの単離は、186±8 ngから1261±355ngの総RNA(図4Gおよび補足図 1C)市販キットから単離されたRNAは、一般的に良好な品質である(図4Hおよび補足図1F)が、低い回収はRNAがカラムから効率的にelelyが行われない可能性を示唆している。RNAの完全性はまた、方法2(図4H、第2プロット)で行われるようにキットを使用することによって損なわれ、バッファー体質および熱処理に起因する可能性が高く、下流実験に影響を与えうる重大な断片化を引き起こす可能性がある。
また、RNAサンプルを分離して取り扱う際には、適切なRNaseフリー技術を観察することも重要です。凍結融解サイクルと4時間室温インキュベーションはRNA完全性プロファイルに劇的な影響を与えませんが、少量のRNaseでも急速なRNA分解につながります(図4Iおよび補足法)。ユーザーはまだ氷に取り組み、RNA加水分解と断片化を防ぐために凍結融解を制限することをお勧めします。これはここで検出されませんでしたが、フィルタチップとDEPC処理バッファを使用してRNase汚染を防ぐことは絶対に不可欠です。
逆転写の効率は、ダウンストリームアプリケーションの成功にも影響を与えます。我々がテストした3つの市販RTキットのうち2つで信頼できる結果を得たが、これはいずれもリボソーム遺伝子rp49に対する強力なRT-PCRバンドを増幅する(図4J)。しかし、RTキット#2は、3つの生物学的複製物すべてに対してRNA結合タンパク質bru1に対してより強いバンドを得たため、低発現転写物の検出に対してより敏感である可能性がある(図4J)。これらの結果をまとめると、この手順で解剖されたIFMから高品質のRNAを単離できることを示しています。
解剖されたIFMは、高品質のmRNA-Seqおよびプロテオミクスデータを生成する
上記のプロトコルに従って解剖されたIFMを30 h APF、72 h APFおよび1d大人のハエから、我々は以前にRNA結合タンパク質およびCELF1-ホモログブルーノ1(Bru1、アレスト、アレット)が下流のIFM特異的スプライシング経路を制御することを示した。転写因子スパルトメジャー(サルム)16.ヌル変異体からのIFMだけでなく、筋肉特異的なbruno1 RNAi(bru1-IR)は、サルコメア成長欠陥、ミオシン活性の誤った調節、最終的には筋線維の過収縮および損失を示す16,17.以下では、プロテオーム質量分析全体に対する解剖IFMの有用性を示し、RNAレベルで観察された発現変化のいくつかがタンパク質レベルでも明らかであることを示す。さらに、Bruno1によって調節されたMhcにおける特定の発達スプライス事象を強調し、mRNA-SeqおよびRT-PCRが解剖されたIFMから代替スプライス事象の調節を実証するために使用できることを示した。
ライブラリーの品質と深さに応じて、mRNA-Seqデータは遺伝子単位のレベル(遺伝子のすべてのエキソン、個々のエキソン、またはスプライスジャンクションの平均読み取り数)で分析できます。野生型と比較したbru1-IR IFMからのmRNA-Seqデータは、遺伝子ユニットレベル16における発現の弱い変化を示す(図5A)。72 h APFでは、60A[Mlp60A]、アクチン57B[Act57B]、筋肉特異的タンパク質300kDa[Msp300]、またはストレッチン・ムルク[Strn-Mlck]などのサルコメア遺伝子が既に規制下に重要な傾向にあります。bru1-IR筋肉(図5Aおよび補足表1)。しかし、我々は以前に、個々のエキソンのレベルでは、特定のサルコメア遺伝子アイソフォーム16のはるかに強いダウンレギュレーションがあることを示し、Bruno1の主な機能は代替スプライシングを制御することであることを示唆している(補足表1)).
解剖IFM上の全プロテオーム質量分析を用いて、タンパク質レベルに対して同様の調節を示すことができる(図5Bおよび補足表2)。検出された1,895のペプチド群のうち、524(28%)。そのうちの1d成人ではBru1M2変異IFMで誤って規制されている(補足表2)。Strn-MlckおよびMlp60Aタンパク質の両方のダウンレギュレーションも観察され、mRNA-Seqデータの転写レベルでの一致した観察と一致する。特定のタンパク質アイソフォームにマップするデータベースペプチドの数は限られているが(分析の詳細については補足的な方法を参照)、サルコメアタンパク質トロポミオシン1(Tm1)、支持(アップ/TnT)、Mhc、曲がり(bt/プロジェクティン)およびパラミオシン(Prm)についてあるアイソフォームからのペプチドのアップレギュレーションと別のアイソムのダウンレギュレーションを観察し(図5B)、RNAレベル16に関する同様の調節の以前の観察を確認する。これは、解剖されたIFMがmRNA-Seqおよびプロテオミクスアプリケーションの両方に有用であることを示しています。
オミクスデータが生物学的洞察を高め、拡張するための従来のアプローチを補完する方法のさらなる例として、我々はMhcのC終産でスプライシングに焦点を当てることを選んだ。weeP26と呼ばれる以前に特徴付けられたタンパク質トラップラインは、Mhc43,44の最終イントロンに挿入される(正確な位置については補足的な方法を参照)。weeP26は強いスプライス受け入れを含み、おそらくすべてのMhc転写物に組み込まれる(図5C)。しかしながら、IFMにおけるGFP標識タンパク質は、M線の両側の2つの「ドット」に組み込まれ、脚筋では、M線を横切って均一に組み込まれ、厚いフィラメントを弱く組み込む(図5E)。オルファノスとスパローは、発達的なMhcアイソフォームスイッチによるIFM形式でこれらの「ドット」を示した:48 h APFの前に発現したMhcアイソフォームは、開いた読み取りフレームにweeP26エクソン挿入物としてGFPラベルが付けられており、MhcはMhc48h APFの後に発現されるアイソフォームは標識が付けられず、weeP26エクソンは3'-UTR44にストップコドンの下流に含まれる。
mRNA-Seqのデータにより、C末端Mhcアイソフォーム発現をより詳細に特徴付けることができました。2つの異なるMhc終端が43、44報告されているが、私たちのmRNA-Seqデータと現在のフライベースアタテーション(FB2019_02)は、実際にMhcで3つの可能な代替スプライスイベントがあることを示唆していますC終生(Exon 34-35、34-36、または34-37)(図5C)は、RT-PCR(図5D)によって確認された。ウィーP26GFP は、エキソン 36 と 37 の間のイントロンに挿入されます。したがって、エクソン34-35およびExon 34-36アイソフォームの両方がストップコドンを含むので、GFPはエクソン34-37アイソフォームでのみ翻訳することができます(結果Exon 34-GFP-37)。さらに、すべてのMhcアイソフォームの時間的および空間的な調節の両方を見ることができました。IFMでは、48h APF(図5)で30h APFと48h APF(図5C,D,F)の間のエクソン34-37からエクソン34-35へのMhcアイソフォームスイッチを27°Cで観察しますが、これは48時間APF(図5E)で免疫蛍光によってまだ見えません。脚は既に30h APFでエキソン34-37とエクソン34-35の混合物を発現し、72h APFは3つのMhcアイソフォームすべてを発現する(図5D,F)。成人ジャンプ筋(TDT)はまた、3つのMhcアイソフォーム(図5F)をすべて発現し、これは一般的に管状体筋に当てはまることを示唆している。したがって、当社のmRNA-Seqデータは、IFMのMhcアイソフォームスイッチの時間枠を狭め、管筋におけるMhcアイソフォーム使用を特徴付けることによって、以前の所見の延長を可能にする。
次いで、サルムおよびbru1変異型IFMにおけるMhcアイソフォーム調節を検討した。いずれの場合も、weeP26の誤った規制が見られた。サルム変異IFMは、Exon 34-36イベントのゲインを含む後の段階でMhcアイソフォーム式および表現脚スプライシングパターンで発達スイッチを完了することができません(図5F)。これは、サルムの損失が管状筋肉16にIFMのほぼ完全な運命の変換をもたらすという以前の知見と一致します.Bru1-IRおよびbru1変異型IFMは、サルム-/-IFMと同様に、成人期を通じてエクソン34-37スプライス事象を保持する(図5E,F)、その結果、脚筋に似たweeP26 GFP標識パターンをもたらし、しかし、それはExon 34-36イベントを得ません。これは、Bruno1がMhc代替スプライシングにおける発達スイッチを少なくとも部分的に制御するためにIFMで必要であることを示唆しているが、追加のスプライシング係数もサルム-/-コンテキストで誤って制御されていることを示している。さらに、この例は、解剖IFMからのRT-PCRおよびmRNA-Seqデータが、発達的スプライシング機構と観察された形態的欠陥をより深く理解するうえでどのように価値があるかを示しています。
図1:子犬のIFM開発とステージング(A)24h APF、32h APF、48 h APF、72 h APF、および1d成人におけるIFM開発の概略図は、〜32h APFでの飛行筋肉(緑)の圧縮および後続の繊維成長を示す胸部を満たす。腱は濃い灰色です。(B)オープンブック解剖(24時間、32h、48h)19または胸部方面切片(72時間、1日)から固定IFMの共焦点画像をアクチン(ローダミンファロイジン、マゼンタ)およびGFP(緑色)用に染色した。(C, D)生きている子犬におけるGFP蛍光の画像は、後部(C)または横(D)平面における解剖フライラインの無傷のIFM形態を示す。アスタリスクは IFM の位置をマークします。(E)解剖の準備をするために、フライストックは3~4日前に反転するか、十字架をセットする必要があります。(F)プレプパエは白色(黄色の矢印)で選択され、濡れたペイントブラシ(F',F')を使用して分離されます。(G)Prepupaeは、後部に位置する半透明のボール(黄色のアスタリスク)として現れる精巣の存在に基づいて、女性と男性を分離するために性交されるべきである。(H)プパエは60mmの皿で濡れたフィルターペーパーの上で熟成される。スケールバー = 100 μm (B)、1 cm (C、D、E、H)、1 mm (F、F'',G)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:48 h APFより前のIFMの解剖。(A)転写ピペットを付けた黒い解剖皿に1x PBSバッファーを追加する。(B)ペイントブラシを使用した段階的な子犬の移動。(C)GFPを可視化する蛍光解剖顕微鏡の下で、#5鉗子(灰色で輪郭を描く)を用いて解剖皿の底に子犬を優しく押し込む。円の中の「X」は、画像への動きを示します。(D,E)子犬を前もってつかみ(D)、次いで胸郭のすぐ後ろの子犬を突き刺す(E)。円のダッシュは、動きを示しません。(F, G)前鉗子(矢印)で引っ張って、子犬の場合(F)を取り除き、次いで腹部(G)を取り除く。(H)いくつかのpupaに対するC-Gの繰り返し。黄色の点線は、寄与する子犬を示す番号が付けられています。(I, J)鉗子(I)を使用して周囲の組織(J)からIFMを分離する。円の中のドットは、ページ外の動きを示します。(K, L)脂肪およびジャンプ(TDT)筋肉(K)を含む汚染物質の除去は、きれいなIFMサンプル(L)を生成する。TDTはGFP発現が低く、IFMファイバ(K')とは形状が異なります。(M,N,O)切り取られたピペット先端(M)を使用して解剖されたIFM(N)を収集し、マイクロ遠心管(O)への転送を行う。スケールバー = 1 cm (A,B,M,O)、1 mm (C-G)、500 μm (H-L,N)この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:48h APF後のIFMの解剖(A)ダブルスティックテープに子犬の位置合わせ。(B)前を開き(B)、ケースを後部(B')に切断し、pupa(B')を持ち上げて、子犬の場合から子犬を取り除く。図 2 と同じ円記号を表します。(C)パペエをバッファーに移す。(D)はさみ(黄色の二重矢印)で切断し、胸部から分離することによって腹部を除去する(D')。(E, F)クリーンバッファー(E)を添加し、次いで胸郭を半分縦方向に切断する(F,F')。(G,H)解剖は、GFP(H)を視覚化するために白色光(G)または蛍光の下で行うことができます。一方の側(G')、次にもう一方の側(G')のIFMの切断。鉗子(灰色で輪郭を描く)(G''')で胸郭を持ち上げる。(I,J,K)バッファー内のIFMの収集(I)および汚染された腹神経コード(VNC)、腸、およびジャンプ筋(TDT)(J)の除去は、クリーンなIFMサンプル(K)を生成する。TDTはGFP発現が低く、IFMファイバ(J',K')とは異なる形状をしています。(L,M)鉗子を使用してIFM(L)をマイクロ遠心管(M)に移す。スケールバー = 1 cm (A,E,M)、1 mm (B-D'、F-L)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:IFM保存およびRNA分離の詳細。(A)IFMは2000 x gで5分間遠心分離によってペレット化される。(B)蛍光下のIFMペレット(矢印)及びペレット(B')。(C)ピペットチップを使用したすべてのバッファを削除します。(D)RNA抽出の場合、分離バッファー内のペレットの再懸濁。このステップは、凍結解剖IFMにスキップすることができます。(E)液体窒素中またはドライアイスで試料を凍結し、-80°Cで保存する。スケールバー = 10 cm (A)、1 mm (B,B')、1 cm (C、D、E)。(F)16h APF、24h APF、30 h APF、48 h APF、72 h APF、90 h APF、および 1 d 成人で得られたフライ当たりの解剖IFMからの総RNA(ng)。誤差バー= SD.(G)異なる抽出方法を用いて50 1d大人ハエから解剖したIFMから分離された総RNA。誤差バー = SD.(H)異なる抽出方法後のRNA整合性をアッセイする代表的なトレース。リボソームバンドは、2000ヌクレオチド(nt)のすぐ下に実行され、マーカーバンドは25 nt.補足図1で利用可能な追加のトレース.(I)新たに単離したRNAサンプル(上)の代表的な痕跡、ドライアイス上のサンプル凍結解凍25x(第2プロット)、ベンチ上に4時間放置したサンプル(第3プロット)、およびRNase A(ボトムプロット)で処理したサンプル。ブルー1およびrp49に標識されたキットからRNase A.(J)RT-PCRゲルを添加した際のRNAの完全な分解に注意してください。rp49に対して正規化されたbru1バンドの相対強度を以下にプロットする。誤差記号 = SEM (対になっていないt-test、p = 0.0119)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:代替スプライシングにおけるBruno1関数を調査するためのIFM解剖の適用(A)72 h APFで解剖したIFMからのmRNA-Seqデータ(遺伝子単位)の火山プロット。bru1-IRと野生型IFM(padj < 0.05、abs(ログ2FC)>1.5)の間で有意に有意に調節される遺伝子は青色で示され、有意でない遺伝子は灰色で示される。サルコメアタンパク質は赤色で強調表示され、選択された遺伝子には標識が付いています。(B)全プロテオーム質量分析の火山プロットは、1 d成人IFMから得られた結果である。bruM2変異体と野生型(FDR<0.05)の間で有意に異なるタンパク質は、灰色の青色の有意でないタンパク質で示されています。肉腫タンパク質は赤で強調表示されます。(A)の遺伝子に対応するペプチドは、赤色で標識される。同じタンパク質の異なるアイソフォームにマッピングするペプチドのセットは、同じ色で標識される。(C) weeP26遺伝子トラップの明確な転写形位形および挿入位置を示すMhcのC終端のスキーム(挿入点の補足方法を参照)。RT-PCR プライマーは、トランスクリプトの上に黒い線で示されます。mRNA-Seqからの1キロベース当たりの読み取り数(RPKM)は、ワイルドタイプから30h APF(オレンジ)および72 h APF(赤色)、bru1-IR(青)およびサルム-/--(シアン)から72 h APFで、72 h APFで全脚(緑)から解剖されたIFMに対して示されています。.(D)30 h APF 以降のタイムポイントの間の IFM のアイソフォーム スイッチを示すMhcに対するプライマーを持つ RT-PCR。Exon 34-35スプライスイベントは、ブルーM3変異型IFMまたは成人脚でのみ弱く観察されます。(E)ワイルドタイプIFMサルコメアにおけるweeP26 GFP局在化の共焦点画像は、90h APF脚筋と比較して48h APFおよび90 h APFである。スケールバー = 1 μm.(F)標識されたジェノタイプおよびタイムポイントのmRNA-Seqデータからのスプライス接合定量。ジャンクション読み取りは、特定のスプライスイベント(エクソン34~35グレー、紫34~36、緑色の34~37)の比率として、エクソン34スプライスドナーを共有する合計数イベントに対して提示されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:(A,B,C)RNAは、同じ週に同じ研究者によって解剖された同じ遺伝子型のサンプルから得られた。すべてのサンプルを解剖した後、RNAを単離し、同じ日に測定した。(A) 1d大人フライ当たりIFM解剖から得られた総RNAのナノグラム(ng)。誤差バー = SEM. (B) 30 h APF、48 h APF、72 h APF および 1 d 成人でフライあたりの解剖 IFM から得られた総 RNA。(C)異なる抽出方法を用いて50 1d大人ハエから解剖したIFMから分離した総RNA。(D)解剖された脚、ジャンプ筋(TDT)およびIFMからのフライ当たりの総RNA濃度。より大きなIFMからより多くのRNAが得られます。誤差範囲 = SD.(E)30 h APF、72 h APF および 1 d 成人の RNAi または変異サンプルと比較して、コントロールから解剖された IFM のフライあたりの総 RNA 濃度。変異体の場合、w1118はワイルドタイプコントロールとして使用されました。変異体データは、bru1-IR、サルム-/-および別のRNA結合タンパク質変異体からコンパイルされます。これらの操作では、筋肉の萎縮と損失のために1d成人でRNA収量が減少するので、より多くのハエを解剖して、オミクスアプローチに十分な量を得る必要があります。エラーバー = SD.(F)図4Gおよび補足図1Cに示すRNA単離法のRNA整合性を示す追加のトレース。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足方法:テキスト全体で使用される方法および試薬の詳細な説明、特に、図1A-D、図4F-K、図5、補足表1、および、 補足表 2.これらのデータは解剖プロトコルを動機付け、RNA単離、mRNA-Seq、RT-PCR、およびプロテオミクスに対する有用性を実証する。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
| 図 5 および本文内の関連段落に関連する | |
| タブ名 | データの概要 |
| サルコメアタンパク質 | Spletter et al. Elife 2018のサルコメア遺伝子の一覧。ここでは、現在のFBgnと遺伝子名を一覧表示します。 |
| SP遺伝子ユニット_DESeq2_72h | Spletter et al. EMBO Rep 2015 のデータを使用して、72 h APF の mRNA-Seq データのサルコメア遺伝子を具体的に調べた。これは、コントロール(Mef2-Gal4、UAS-GFM-Gmaがw1118に交差した)とMef2-Gal4、UAS-GFM-Gma x Bruno1-IRとの間の遺伝子単位レベルの微動発現を検出するDESeq2分析から来ています。黄色で強調表示された行は、表示される遺伝子の上下に示すように(log2FC=abs(1.5)のしきい値の上/下)です。これらのデータは、図 5A の赤いドット オーバーレイです。各サルコメア遺伝子について、識別子情報、DESeq2からのlog2FC、P値および調整されたP値、ならびにDESeq2正規化発現数を提供する。 |
| SP エクソン_DEXSeq_72h | Spletter et al. EMBO Rep 2015 のデータを使用して、72 h APF の mRNA-Seq データにおけるサルコメア遺伝子エキソンの使用を具体的に調べた。これは、コントロール(Mef2-Gal4、UAS-GFM-Gmaがw1118に交差)とMef2-Gal4、UAS-GFM-Gma x Bruno1-IRとの間の差動エキソン使用を検出するDEXSeq分析から来ています。黄色で強調表示された行は、表示されるレキドキの上下に表示されます (log2FC=abs(1.5)のしきい値の上/下)。我々は、エキソンおよび遺伝子識別子情報、DEXSeqからのlog2FC、P値および調整されたP値、ならびに関連する転写物のリストを提供する。 |
| 多くの遺伝子は、多くの場合、高いlog2FC値と低いP値/調整P値を有するDEXSeq分析で1つ以上のエキソンの調節を示し、遺伝子の限られたリストは72 h APFで変化を示すのでご注意ください。これは代替スプライシングの調節にブルーノの損失の強い効果をサポートしています。 | |
補足表1:bru1-IR対野生型IFMにおける差別的発現遺伝子(DESeq2を介して)およびエキソン(DEXSeq経由)を同定するサルコメアタンパク質に関する72h APF mRNA-Seqデータの表。
| 図 5B および本文の関連段落に関連する | |
| タブ名 | データの概要 |
| ペルセウス出力 | これは、図5Bの生成に用いられる質量分析データを示す処理されたデータスプレッドシートである。IFMサンプルは、1 d大人コントロール(w1118)および変異体(bruno1-M2)ハエから得られた。重要な列は、各サンプルの4つの反復、t検定統計と有意性、ペプチドイドおよび対応する遺伝子名およびFlybaseの名前のそれぞれに対する変換強度値です。シグニチュードはペルセウス州の標準設定 (FDR<.05) を使用して計算されました。検出されたタンパク質/ペプチドは1859個あり、そのうち524個(28%)が検出されました。サンプル間で有意に異なります。 |
| ダウン規制 | これらは、bruno1-M2変異型IFMでダウンレギュレートされたペルセウス出力からのすべての252タンパク質/ペプチドです。Flybase ID と遺伝子名が古いため、現在の Flybase 遺伝子 ID と遺伝子名を追加で提供します。 |
| アップラギュレート | これらは、bruno1-M2変異型IFMでアップレギュレートされたペルセウス出力からのすべての272タンパク質/ペプチドです。Flybase ID と遺伝子名が古いため、現在の Flybase 遺伝子 ID と遺伝子名を追加で提供します。 |
| 図5Bで赤色で強調表示されているサルコメアタンパク質は、上記のリストに存在します。サルコメアの一部と考えられる遺伝子のリストは、補足表1のタブの1つで利用可能である。 | |
補足表2:bru M2変異体対ブルM2変異体における分発性タンパク質およびタンパク質アイソフォームを同定する1d成人からのプロテオーム質量分析データ全体の表。ワイルドタイプ IFM。
Discussion
このプロトコルでは、タンパク質、DNA、RNAまたは他の高分子の下流分離のために、早期および後期の子犬からショウジョウバエIFMを解剖する基本的な技術を提示する。プロトコルは大人のハエからIFMを解剖するために容易に合わせることができる。mRNA-Seq、プロテオミクスおよびRT-PCRアプリケーションの解剖プロトコルの有用性を実証します。オミクス技術の継続的な改善により、出発材料が少なく、入力濃度が低いサンプルの分析が可能になり、これらの解剖は多くの追加用途に有益になる可能性が高い。IFMはヒトミオパシー4、24および筋肉型特異的発達9、12の確立されたモデルであり、我々は、例えば、IFMを豊富に含むメタボロミクス、クロマチンの立体構造の調査を想像する3Cまたは4Cを介して、筋脂質形成のCLiP相互作用またはリンプロテオミクスを介してネットワーク評価をスプライシングする。
これらの解剖は、純粋なIFMサンプルの代わりにIFM用に濃縮されたサンプルを生成することを考慮することが重要です。これは、運動ニューロンの内性、腱の付着および筋線維の気管の侵入のために避けられない。バイオインフォマティクス解析は、IFM濃縮遺伝子またはタンパク質を同定するために使用できますが、それらが実際にIFM特異的であることを実証するためにさらなる実験が必要です。サンプル純度は、ストライプ45(腱)、Act79B4、44(管状筋)、Act88F 15(IFM)、またはsyb46(神経特異的)などの公公表組織特異的マーカーを用いてアッセイすることができる。このようなマーカーを使用してIFM特異的コンテンツにデータセットを正規化することは可能かもしれませんが、IFM特異的遺伝子やチューブリンなど、正規化に使用される遺伝子の発現の時間的変化は、そのようなアプローチに偏りが生じる可能性があることにユーザーは注意が必要です。
遺伝的にコードされた組織特異的標識法、例えばECタグ付け47、48またはPABP標識49、50は、近年開発され、真に得るのに役立つかもしれない組織特異的なRNAサンプル。しかし、ECタグ付けはハエ47の一定の供給を必要とするため、子犬の段階では適用されません。PABP標識トランスクリプトームの感度および完全性には、51の制限がある場合がある。個々の筋線維を分離するFACSアプローチは、IFMの大きなサイズと同期性によって複雑です。INTACT52,53スタイルアプローチは、IFMから特定の細胞内区画を分離するために適用され、IFM核またはミトコンドリアの純粋な集団を分離するのに有用であることが証明される可能性がある。手動解剖はほとんどの下流の適用のための無傷のIFMティッシュを得るために現在の標準である。
サンプルの品質は、解剖プロセスのいくつかの重要なステップに依存します。解剖は技術的に要求され、解剖速度およびサンプルの純度は経験と共に増加する。洗剤を使用せずに冷蔵バッファーで短時間(20~30分)の解剖を行い、すぐに凍結すると、マウス腱分離54に関して以前に観察されているように、サンプルの完全性を維持するのに役立ちます。IFMは、ペレットからすべてのバッファを除去した後に正常にドライフリーズすることができますが、特にRNA単離のために、分離バッファー内のサンプルを凍結すると、より良い結果が得られる傾向があります。RNAまたはタンパク質の単離の前に最大20個の別々の解剖からIFMが組み合わされ、下流分析のために初期の時点または変異体16、32からでも十分な材料をスケールアップおよび収集することができます。
RNAアプリケーションの場合、最も重要なステップは、RNA自体の単離である可能性があります。グアニジニウムチオシアネート-フェノールクロロホルム単離(上記の方法1)は、試験されたほとんどの市販キットを上回り、前述のように、かなり安価な55である。市販キットとのRNA分離収率で観察された変動性は、以前の観測値56,57と一致している。我々はさらにすべてのRNAを回復するのに役立つイソプロパノール沈殿の間にグリコーゲンを追加します。RNA収率を超えて、解剖および単離プロセス中にサンプルが断片化または分解されていないことを確認するために、RNA整合性を検証することが重要です。また、RNaseフリーで作業することも不可欠です。最後に、RTキットの選択は、逆転転写プロセスの感度に影響を与えることができます。詳細に説明する必要はあまりありませんが、これらのポイントはすべて IFM サンプルの品質とダウンストリーム アプリケーションから取得したデータに影響します。
いくつかの重要な変更により、プロトコルは既存の IFM 解剖プロトコルとは別に設定されます。IFM免疫蛍光のための詳細な解剖プロトコルは19が存在するが、このプロトコルは、IFM組織のより迅速な単離を可能にするpupal解剖に対する異なるアプローチを提示する。これにより、プロテオームまたはトランスクリプトームの変化を防ぐために、解剖時間が限られた大量のIFM組織(比較的話す)の収集が可能になります。他のプロトコルは、個々の筋膜39におけるGFP染色を可視化するための成人IFMの解剖を記述する39、または幼虫体壁筋58の染色のために、しかし、それらは、プパール段階での解剖またはRNAまたはタンパク質の単離に対処しない。このアプローチはまた、より純粋なIFMサンプルを生成する可能性があるが、より労働集約的であり、より少ない材料を生成するクライオセクション38からのpupal IFMの微小解剖のための既存のプロトコルとは異なります。他の急速成人IFM解剖プロトコル38、39と比較して、IFMは、ストレス誘導および他の主要な発現変化を制限するために洗剤なしでPBSバッファー内で単離される。
このプロトコルの主な進歩は、ライブ、蛍光レポーターを含めることであり、初期の子犬の段階でIFMを隔離することができます。私たちは標準的にMef2-GAL459を使用してUAS-CD8::GFPまたはUAS-GFP::Gma60.これにより、IFMの差分ラベリング(飛行筋肉は他の水力筋とは異なるラベル付け)とGAL4-UASベースの操作(例えば救助やRNAi実験)の性能が可能になります。また、Mef2-GAL4と浴槽-GAL80tsを組み合わせてRNAi関連の早期致死性を回避したり、UAS-Dcr2を使用してRNAi効率を40に向上させることも可能です。
Mef2-GAL4 の代わりに使用できる筋肉型特異性、時間発現パターン、およびドライバ強度19,61で異なる GAL4 ドライバーまたは GFP ラインが追加で利用可能です。たとえば、Act88F-GAL4 は最初に 24 h APF の周りに表現されるため、以前のタイムポイントでは使用できません。しかし、それはIFMに強くラベルを付け、RNAi関連の早期致死を避けるのに役立つかもしれません。彼-GFPまたはAct88F-GFPラベルIFMは、再び時間的な制限を伴うが、それらはマーカー式のGAL4依存性を避け、目的の変異背景と組み合わせて有用であり得る。その他の可能なマーカー行のリストは19.また、トランスジーンとGAL4/UASシステムを使用すると遺伝子発現アーティファクトを引き起こす可能性があるため、例えば、ドライバラインが野生型の背景株に交差するなど、適切なコントロールを使用することが重要です。すべてのサンプルで同じです。
付属のビデオでは、この詳細なプロトコルは、pupal IFM解剖をよりアクセスしやすくし、筋肉の発達を研究するためのオミクスアプローチの使用を促進することを目的としています。解剖IFMを通じてアクセス可能な生化学およびオミクスアッセイとショウジョウバエの遺伝学と細胞生物学の力を結合することは、筋形成と筋肉機能の機械的理解を進める可能性を秘めています。転写物とプロテオーム調節のシステムレベルの観察を代謝および機能的な出力に結びつける将来の研究は、筋肉型特異的な発達と筋肉障害の病因をより深く理解することを提供する。
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
アンドレアス・ラドゥルナーとフランク・シュノーラーの寛大な支援に感謝します。我々は、優れた技術支援と質量分析データを生成するためのアカンクシャロイのためのサンドラ・エッサーに感謝します。我々は、ハエを提供するためのブルーミントンとウィーンのストックセンターを認めます。我々は、LMUバイオメディカルセンター(マーティンスリード、DE)の両方で質量分析サンプルの分析のための共焦点イメージングとゼントララボフュルプロテナリティックの助けをコアファシリティバイオイメージングに感謝します。私たちの研究は、ドイツのフォルシュン・ゲミンシャフト(MLS、SP 1662/3-1)、ルートヴィヒ・マクシミリアン大学ミュンヘン(MLS)の統合タンパク質科学ミュンヘンセンター(CIPSM)、フレデリッヒ・バウアー・スティフトゥン(MLS)、インターナショナル・マックスによって支えられた。プランク研究学校(EN)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x High Fidelity (HF) buffer | Thermo Fisher | F518L | |
| 60 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Z643084-600EA | Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented |
| Black dissecting dish (glass) | Augusta Laborbedarf | 42021010 | Lymphbecken, black glass, 4 cm x 4 cm |
| Black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder | Sigma-Aldrich | C9157 | Also available from most pharmacies |
| Black silicon dissecting dishes: Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes). |
| Blue pestle | Sigma-Aldrich | Z359947-100EA | Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder |
| Cell phone camera, Samsung Galaxy S9 | Samsung | SM-G960F/DS | used for photos not taken under a microscope |
| Chloroform | PanReac AppliChem | A3691,0500 | |
| Confocal microscope, Leica SP8X upright confocal | Leica | www.leica-microsystems.com | |
| Confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal | Zeiss | www.zeiss.com | |
| Double stick tape | Scotch/3M | 3M ID 70005108587 | Double-sided tape, available at most office supply handlers |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 mm x 0.02 mm tip |
| EtOH (100%, RNase free) | Sigma-Aldrich | 32205-M | |
| fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera | Leica | www.leica-microsystems.com | |
| Fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0 | Leica | www.leica-microsystems.com | |
| Fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC | Leica | www.leica-microsystems.com | |
| Fly: Bru1[M2] | Fly stock; This paper | ||
| Fly: Bru1[M3] | Fly stock; This paper | ||
| Fly: Mef2-GAL4 | Bloomington Stock Center | BDSC:27390 | Fly stock |
| Fly: salm[1] | Bloomington Stock Center | 3274 | Fly stock |
| Fly: salm[FRT] | Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018 | ||
| Fly: UAS-Bru1IR | Vienna Drosophila Research Center | GD41568 | Fly stock, RNAi hairpin |
| Fly: UAS-GFP::Gma | Bloomington Stock Center | BDSC:31776 | Fly stock |
| Fly: UAS-mCD8a::GFP | Bloomington Stock Center | BDSC:5130 | Fly stock |
| Fly: w[1118] | Bloomington Stock Center | 3605 | Fly stock |
| Fly: weeP26 | Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003 | ||
| GFP detection reagent, GFP-Booster | ChromoTek | gba488-100 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | |
| Image processing software, Photoshop CS6 | Adobe | www.adobe.com | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516-25ML | 2-propanol |
| Method 1 (RNA isolation): TRIzol | Life Technologies | 15596018 | Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution |
| Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit | Invitrogen | AM1907 | TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA |
| Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit | Zymo Research | R2070S | RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer. |
| Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues. |
| Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System | Promega | Z6110 | We applied the protocol for ‘Purification of RNA from Fibrous Tissues’. |
| Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England Biolabs | T2010G | We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 μL of RNA Protection Reagent. |
| Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher | AM12400 | RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 12342108 | Standard slides, uncharged, 1 mm |
| Microtome blades | PFM Medical | 207500003 | C35 feather 80 mm |
| Monarch DNase I | New England Biolabs | T2004-21 | |
| Monarch DNase I Reaction Buffer | New England Biolabs | T2005-21 | |
| Normal goat serum | Thermo Fisher | 16210072 | |
| OneTaq Polymerase | New England Biolabs | M0480X | |
| Paintbrush | Marabu | 1910000000 | Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS buffer (1x) | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4 |
| PFA PureTip Pipette Tips | Elemental Scientific | ES-7000-0101 | Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice |
| Phusion High Fidelity Polymerase | Thermo Fisher | F-530XL | |
| Pipette tips | Sigma-Aldrich | P5161 | Universal 200 mL pipette tips |
| Preomics iST 8x Kit | Preomics | P.O.00001 | peptide preparation kit for mass spectrometry |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher | 725500 | mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center |
| Qubit RNA Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen, Molecular Probes | 10063052 | |
| RNA concentration Approach 1 & RNA integrity traces, Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| RNA concentration Approach 2, Nanodrop | Thermo Fisher | ND-2000 | |
| RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | |
| RNA Pico Chips | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| RNase A | Promega | A7937 | |
| RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase. |
| RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit | Invitrogen | 18080-044 | reverse transcription kit |
| RT Kit #2: LunaScript | New England Biolabs | E3010S | reverse transcription kit |
| RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205410 | reverse transcription kit |
| Slide mounting buffer, Vectashield | Vector Laboratories | H-1200 | containing DAPI |
| Statistical software: GraphPad Prism | GraphPad Prism | www.graphpad.com | |
| Statistical software: Microscoft Excel | Microsoft | Purchased as part of the bundle: Office Home & Student 2019 | |
| Table-top centrifuge | Eppendorf | 5405000760 | Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent |
| Tissue/ Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956 | Standard tissue wipes |
| Transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z350796 | Plastic pipette |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | 3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm |
| Whatman paper | Sigma-Aldrich | 1004-070 | Filter paper circles, Grade 4, 70 mm |
References
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