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Developmental Biology

पूरे ज़ेब्राफिश भ्रूण की विस्तारित समय-चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए एक स्तरित बढ़ते विधि

Published: January 14, 2020 doi: 10.3791/60321
Automatic Translation
1, 2, 2, 3,4, 1,4, 5
1Computational Biomedicine Lab, Texas Institute of Measurement Evaluation and Statistics, University of Houston, 2Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M Health Science Center, 3Department of Biology and Biochemistry, Center for Nuclear Receptors and Cell Signaling, University of Houston, 4Department of Biosciences and Nutrition, Novum, Karolinska Institutet, 5Department of Intelligent Systems Engineering, Indiana University

Summary

यह लेख विस्तारित समय-चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए नाजुक ज़ेब्राफिश भ्रूण को माउंट करने की विधि का वर्णन करता है। यह कम लागत वाली विधि किसी भी उल्टे माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग के लिए नियमित ग्लास-बॉटम माइक्रोस्कोपी व्यंजनों का उपयोग करना आसान है। बढ़ते विभिन्न सांद्रता पर अगारोज की परतों में किया जाता है।

Abstract

विकास की गतिशीलता के बाद विशिष्ट ऊतकों या कोशिकाओं में फ्लोरेसेंस व्यक्त करने वाले लाइव ट्रांसजेनिक जेब्राफिश भ्रूण की कॉन्फोकल टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी के बाद किया जा सकता है। इमेजिंग पूरे भ्रूण विकास के साथ एक कठिनाई यह है कि जेब्राफिश भ्रूण लंबाई में काफी बढ़ते हैं। जब नियमित रूप से 0.3-1% कम पिघल अगारोज में किया जाता है, तो अगारोज विकास प्रतिबंध लगाता है, जिससे नरम भ्रूण शरीर में विकृतियां होती हैं। फिर भी, कॉन्फोकल टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी करने के लिए, भ्रूण को स्थिर किया जाना चाहिए। यह लेख जेब्राफिश भ्रूण के लिए एक स्तरित बढ़ते विधि का वर्णन करता है जो अप्रतिबंधित विकास के लिए अनुमति देते समय भ्रूण की गतिशीलता को प्रतिबंधित करता है। बढ़ते विभिन्न सांद्रता पर अगारोज की परतों में किया जाता है। इस विधि की प्रयोज्यता को प्रदर्शित करने के लिए, पूरे भ्रूण संवहनी, न्यूरोनल और मांसपेशियों के विकास को लगातार 55 घंटों तक ट्रांसजेनिक मछली में चित्रित किया गया था। इस बढ़ते विधि मोल्डों या विशेष उपकरणों की आवश्यकताओं के बिना उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग कर पूरे जेब्राफिश भ्रूण की आसान, कम लागत वाली इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

जेब्राफिश लंबे समय से विकासात्मक जीव विज्ञान के लिए एक आदर्श जीव रहा है, और माइक्रोस्कोपी भ्रूणीय विकास की कल्पना करने के लिए प्रमुख तरीका है। विकासात्मक अध्ययनों के लिए ज़ेब्राफिश भ्रूण का उपयोग करने के फायदे छोटे आकार, ऑप्टिकल स्पष्टता, तेजी से विकास, और वयस्क मछली की उच्च fecundity शामिल हैं । कुछ ऊतकों या कोशिकाओं में फ्लोरेसेंस व्यक्त करने वाली ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लाइनों की पीढ़ी ने बड़े कशेरुकी जानवरों के साथ संभव नहीं तरीकों से ऊतक विकास के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति दी है। समय चूक माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में, विवरण और ऊतक विकास की गतिशीलता आसानी से अध्ययन किया जा सकता है।

इमेजिंग जेब्राफिश विकास के साथ एक कठिनाई यह है कि भ्रूण लंबाई में काफी बढ़ते हैं; भ्रूण जीवन के पहले 3 दिनों के भीतर चार बार अपनी लंबाई फैली हुईहै 1. इसके अलावा, प्रारंभिक भ्रूण का शरीर नरम होता है, और यदि विकास प्रतिबंधित हो जाता है तो आसानी से विकृत हो जाता है। फिर भी, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी करने के लिए, भ्रूण को स्थिर किया जाना चाहिए। भ्रूण को कॉन्फोकल टाइम-लैप्स इमेजिंग के लिए एक निश्चित स्थिति में रखने के लिए, वे नियमित रूप से एनेस्थेटाइज्ड होते हैं और 0.3-1% कम पिघलने वाले अगारोज में घुड़सवार होते हैं। यह समय की एक निश्चित अवधि के लिए इमेजिंग के दौरान कुछ विकास के लिए अनुमति देने का लाभ है, जबकि भ्रूण के आंदोलनों को प्रतिबंधित । भ्रूण के कुछ हिस्सों को कुशलतापूर्वक इस तरह से चित्रित किया जा सकता है। हालांकि, विस्तारित समय अवधि के लिए पूरे भ्रूण की इमेजिंग के लिए इस विधि का उपयोग करते समय, अगारोज के कारण प्रतिबंधित विकास के कारण विकृतियों को देखा जाता है। इस प्रकार, अन्य बढ़ते तरीकों की आवश्यकता होती है। काउफमैन और सहयोगियों ने प्रकाश पत्र माइक्रोस्कोपी के लिए जेब्राफिश भ्रूण के बढ़ते एक विकल्प का वर्णन किया है, जैसे चयनात्मक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी (एसपीआईएम), फ्लोरिनेट एथिलीन प्रोपलीन (एफईपी) ट्यूबों में भ्रूण को बढ़ते हुए अगारोज या मिथाइलसेल्यूलोज2की कम सांद्रता वाले । यह तकनीक समय के साथ भ्रूण उत्पत्ति का एक शानदार दृश्य पैदा करती है। श्मिड एट अल. प्रकाश पत्र माइक्रोस्कोपी3 के लिए फ़रवरी ट्यूबों में agarose में छह भ्रूण के बढ़ते का वर्णन एक इमेजिंग सत्र में कई भ्रूण के दृश्य प्रदान करते हैं । मोल्डों का उपयोग भ्रूण की बड़ी संख्या के कुशल बढ़ते के लिए भ्रूण सरणी बनाने के लिए किया गया है। मैस्एल्कंक एट अल ने 3 डी मुद्रित प्लास्टिक मोल्डों का निर्माण किया है जिनका उपयोग सिलिकॉन कास्ट बनाने के लिए किया जा सकता है कि विभिन्न चरणों में जेब्राफिश भ्रूण को रखा जा सकता है, जिससे इमेजिंग के लिए निरंतर स्थिति में बढ़ते हुए, जिसमें कॉन्फोकल इमेजिंग5शामिल हैं। 96-वेल प्रारूप6में जेब्राफिश भ्रूण की लगातार स्थिति के लिए मोल्ड बनाने के लिए 3डी प्रिंटिंग का भी उपयोग किया गया है। कुछ मोल्डों को कुछ चरणों के लिए अनुकूलित किया जाता है और लंबे समय तक अप्रतिबंधित विकास की अनुमति नहीं दे सकते हैं, जबकि अन्य मोल्ड अधिक लचीले होते हैं। हाल ही में, Weijts एट अल जेब्राफिश भ्रूण7के लाइव इमेजिंग के लिए एक चार अच्छी तरह से पकवान के डिजाइन और निर्माण प्रकाशित किया । इस डिश में, एनेस्थेटाइज्ड मछली भ्रूण की पूंछ और ट्रंक को जेब बनाने के लिए एक कवर ग्लास के ठीक ऊपर संलग्न एक स्पष्ट सिलिकॉन छत के नीचे मैन्युअल रूप से रखा जाता है। इसके बाद भ्रूण को 04% अगारोज के अलावा इस स्थिति में तय किया जाता है। यह बढ़ते भ्रूण के बारे में 2 मिमी लंबे पीछे भाग (ट्रंक और पूंछ) की इमेजिंग के लिए अनुमति देता है, और के रूप में 12 भ्रूण के लिए अच्छी तरह से प्रति घुड़सवार किया जा सकता है, विधि कई नमूनों की इमेजिंग के लिए अनुमति देता है । इसी तरह, हिरसिंगर और स्टीवर्टन ने हाल ही में एक विधि प्रस्तुत की जहां मछली के सिर को अगारोज में रखा जाता है, जबकि पूंछ स्वतंत्र रूप से बढ़ सकती है, और यह विधि भ्रूण8के ट्रंक और पूंछ क्षेत्र की इमेजिंग को भी कुशलतापूर्वक सुविधा प्रदान करती है।

यह लेख जेब्राफिश भ्रूण के लिए एक स्तरित बढ़ते विधि का वर्णन करता है जो अप्रतिबंधित विकास की अनुमति देते हुए भ्रूण के आंदोलनों को प्रतिबंधित करता है। इस बढ़ते विधि के फायदे यह हैं कि किसी भी उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इमेजिंग के लिए विभिन्न चरणों के भ्रूण को माउंट करने के लिए यह एक कम लागत, तेज और आसान तरीका है। बढ़ते भ्रूण विकास के दौरान पूरे शरीर (सिर, ट्रंक और पूंछ) की दीर्घकालिक इमेजिंग की अनुमति देता है । इस विधि की प्रयोज्यता को प्रदर्शित करने के लिए, ट्रांसजेनिक मछली में पूरे भ्रूण संवहनी, न्यूरोनल और मांसपेशियों के विकास को चित्रित किया गया था। सत्र प्रति दो भ्रूण, 3 डी में दो तरंगदैर्ध्य पर लगातार ५५ घंटे के लिए समय चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित करने के लिए ऊतक विकास की फिल्में प्रदान की गई ।

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Protocol

यहां प्रस्तुत पशु कार्य को ह्यूस्टन विश्वविद्यालय और इंडियाना विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों (IACUCs) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. मत्स्य पालन

नोट: कशेरुकी मॉडल के साथ काम करने के लिए आईएसीयूसी अनुमोदित प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। यह प्रासंगिक राष्ट्रीय और अंतरराष्ट्रीय दिशा-निर्देशों के अनुसार आयोजित किया जाना चाहिए ।

  1. वयस्क ज़ेब्राफ़िश को बनाए रखें जैसा कि पहले प्रकाशित साहित्य9में वर्णित है।
  2. दोपहर में, प्रजनन टैंक में वयस्क ज़ेब्राफिश रखें। 1:2 के अनुपात में महिलाओं के लिए नस्ल पुरुषों।

2. समाधान की तैयारी

  1. भ्रूण मीडिया में 1% कम पिघला अगारोज का स्टॉक समाधान करें (E3: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 m M CaCl2,0.33 mM MgSO4,पीएच 7.0 को समायोजित) । अलीस्टॉक समाधान को 1.5 मिलीएल ट्यूबमें उद्धृत करें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. आसुत पानी में 4% (w/v) ट्रिकेन (एमएस-222) का स्टॉक सॉल्यूशन बनाएं। एक अंधेरे बोतल में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    सावधानी: Tricaine विषाक्त है और तौला और एक धुएं हुड में भंग किया जाना चाहिए ।
  3. आसुत पानी में 20 एमएम एन-फिनाइलथिओरेया (पीटीयू) का स्टॉक सॉल्यूशन बनाएं। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. भ्रूण की तैयारी

  1. संभोग के बाद, पेट्री डिश में E3 में फसल भ्रूण और बढ़ते से पहले लगभग 28 घंटे के लिए उन्हें 26.5 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: यह भ्रूण के विकास को धीमा कर देता है ताकि भ्रूण इमेजिंग की शुरुआत में लगभग 30 सोमाइट चरण में हों।
  2. E3 में 0.016-0.020% ट्रिकेन में एनेस्थेटाइज़ भ्रूण। पिगमेंटेशन को बाधित करने के लिए, पीटीयू को 200 माइक्रोन की एकाग्रता में जोड़ें।
  3. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत संदंश का उपयोग कर भ्रूण dechorionate । दो संदंश का उपयोग करना, पकड़ और धीरे से भ्रूण को छोड़ने के लिए चोरिता को अलग खींचें।

4. अगारोज में बढ़ते

नोट: विकसित बढ़ते विधि के लिए ई 3 में कम पिघलने वाली आगारो की दो अलग-अलग सांद्रता की आवश्यकता होती है, जिसमें 0.02% ट्रिकेन और पीटीयू की आवश्यकता होती है। पहले अगारोज समाधान में अगारोज की इष्टतम एकाग्रता होती है जिस पर विरूपण और गतिशीलता कम से कम होती है। अनुकूलन नीचे चरण 5 में वर्णित है।

  1. दो परतों के लिए अगारोज समाधान गर्म करें (एकाग्रता नीचे 5 कदम और 1%) 65 डिग्री सेल्सियस तक। बढ़ते से ठीक पहले अगारोज को लगभग 30 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें ताकि गर्मी से भ्रूण को नुकसान न हो। बढ़ते के लिए, एक नंबर 0 कवर ग्लास नीचे के साथ 35 मिमी ग्लास नीचे व्यंजन का उपयोग करें। डिश के नीचे से जुड़ा कवर ग्लास 10 मिमी उथले (लगभग 1.2 मिमी गहरा) अच्छी तरह से बनाता है, जिसमें भ्रूण रखा जाना है।
    नोट: इस मामले में, कम से कम गतिशीलता और विकृतियों के साथ एकाग्रता 0.025 से 0.040% अगारोज के बीच थी।
  2. धीरे-धीरे एक ग्लास पिपेट या माइक्रोपाइपेट का उपयोग करके पकवान के नीचे की ओर अपने पार्श्व पक्षों में से एक के साथ एक डिकोरिओनेट भ्रूण रखें। यदि माइक्रोपिपेट का उपयोग कर ते हैं, तो भ्रूण को फिट करने के लिए खोलने के आकार को बढ़ाने के लिए टिप के बाहरी हिस्से को काट दें(चित्रा 1ए)। ध्यान से एक माइक्रोपाइपेट के साथ किसी भी शेष E3 को हटा दें।
  3. भ्रूण (परत 1)(चित्रा 1बी)को कवर करने के लिए पकवान के नीचे से जुड़े कवर ग्लास द्वारा बनाई गई छोटी अच्छी तरह से पहले अगारोज समाधान जोड़ें। सुनिश्चित करें कि अगारोज छोटे कुएं को कवर करता है लेकिन इसे ओवरफ्लो नहीं करेगा।
  4. दो कवर चश्मे के बीच भ्रूण के साथ एक संकीर्ण अगागुलाब भरा स्थान बनाने के लिए एक कवर ग्लास (22 मिमी x 22 मिमी)(चित्रा 1सी)के साथ छोटे कुएं को कवर करें।
  5. डिश (लेयर 2)(चित्रा 1डी)के नीचे कवर ग्लास के शीर्ष पर 1% अगारोज समाधान की एक परत रखें। जैसे ही यह परत जम जाती है, यह कवर ग्लास को जगह में रखती है।
  6. सिस्टम हाइड्रेटेड (लेयर 3)(चित्रा 1ई)रखने के लिए 0.02% ट्राइकेन युक्त E3 के साथ पकवान के शेष हिस्से को भरें।
    नोट: इस सेटअप में, कवर ग्लास और 1% अगारोज नीचे की परत को पतला होने से बचाते हैं।

5. परत 1 के लिए अगारोज समाधान का अनुकूलन

  1. लेयर 1 के लिए अगारोज की इष्टतम एकाग्रता की पहचान करने के लिए, मल्टीस्केल ग्रिड खोज दृष्टिकोण का उपयोग करें। 0.01% से लेकर 1% तक अगारोज की सांद्रता बढ़ाने में माउंट भ्रूण भ्रूण विकास प्रतिबंध और देखने के क्षेत्र में गतिशीलता के समय चूक इमेजिंग के बाद। सांद्रता की पहचान करें जहां विरूपण और गतिशीलता दोनों कम से कम हैं।
  2. आगे अगारोज की एकाग्रता को अनुकूलित करने के लिए, 0.025 और 0.040% अगारोज के बीच 0.025 और 0.040% अगारोज) की सांद्रता की एक महीन श्रृंखला का उपयोग करके भ्रूण को माउंट करें, जो चरण 5.1 (जैसे, 0.025%, 0.028%, 0.031%, आदि) में सबसे अच्छा पाया गया एकाग्रता के आधार पर।
    नोट: हमारी प्रयोगशाला में, इष्टतम अगारोज एकाग्रता 0.03% के आसपास थी।

6. समय-चूक इमेजिंग

नोट: यह बढ़ती विधि फ्लोरेसेंस और उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग के लिए समय-चूक कार्यक्षमता के साथ किसी भी उल्टे माइक्रोस्कोप के लिए काम करती है।

  1. पूरे भ्रूण या इसके कुछ हिस्सों के लिए 55 घंटे तक समय-चूक इमेजिंग करें। कई भ्रूणों की इमेजिंग के लिए, एक चरण एडाप्टर का उपयोग करें जो प्रति डिश पर चढ़कर एक भ्रूण के साथ कई व्यंजन रखती है। व्यंजनों को एक-एक करके घुमाएं ताकि भ्रूण लगभग क्षैतिज रूप से आंखों द्वारा निर्धारित के रूप में तैनात हों। इष्टतम भ्रूण विकास और विकास के लिए, 28.5 डिग्री सेल्सियस पर सेट इनक्यूबेटर के साथ माइक्रोस्कोप चरण का उपयोग करें।
  2. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में कम आवर्धन उद्देश्य का चयन करें। आंख के टुकड़े के नीचे, उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी का उपयोग कर व्यंजन घूर्णन और सॉफ्टवेयर में अपने स्थानों को रिकॉर्ड करके क्षैतिज भ्रूण का पता लगाने और पतले संरेखित करें। डेटा की स्वचालित बचत के लिए एक फाइलनाम बनाएं।
    नोट: इस प्रयोग में, एक योजना एपीओ 4x 0.2 एनए उद्देश्य और ND अधिग्रहण खिड़की के भीतर XY टैब भ्रूण के स्थानों को रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया गया । डेटा .nd2 प्रारूप में सहेजे गए थे। टीआई पैड टैब में इसके आइकॉन पर क्लिक कर उद्देश्य का चयन किया गया।
  3. पिनहोल का आकार सेट करें, गति स्कैन करें, छवि का आकार और ज़ूम करें। इसके बाद, छवियों को कैप्चर करने के लिए एक उच्च आवर्धन उद्देश्य का चयन करें।
    नोट: इस प्रयोग में, एक योजना-एपीओ 10x 0.45 एनए उद्देश्य पूरे भ्रूण की इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था, और एक सुपर फ्लोर 20x 0.75 एनए उद्देश्य भ्रूण के कुछ हिस्सों के उच्च आवर्धन इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था । पिनहोल को 1.2 AU (10x लेंस के लिए 19.2 माइक्रोन) के लिए सेट किया गया था, स्कैन स्पीड 2.4 माइक्रोन के पिक्सल रहने के समय के लिए सेट की गई थी और इमेज साइज को 10x लेंस के लिए 1.24 माइक्रोन का पिक्सल साइज देते हुए 1024 x 1024 पिक्सल तक सेट किया गया था और 10x लेंस के लिए 1.24 माइक्रोन का पिक्सल साइज दिया गया था और 10x लेंस के लिए 1.24 माइक्रोन का पिक्सल साइज दिया गया था और इसका साइज 10x लेंस के लिए 1.24 माइक्रोन का पिक्सल साइज दिया गया था और इसका साइज 10x लेंस के लिए 1.24 माइक्रोन का पिक्सल साइज दिया गया था और इसका साइज 10x लेंस के लिए 1.24 माइक्रोन का पिक्सल दिया गया था और इसका साइज 10x लेंस के लिए 1.24 माइक्रोन का पिक्सल दिया गया था और इसका साइज 10x लेंस के लिए 1.24 माइक्रोन का पिक्सल दिया गया था और इसका साइज 10x लेंस के लिए 1.24 माइक्रोन का पिक्सल साइज दिया गया था और इसका साइज 10x लेंस के लिए 20x लेंस के लिए 0.62 माइक्रोन।
  4. इमेजड करने के लिए फ्लोरेसेंस के लिए चैनलों का चयन करें। एक समय में इमेज कैप्चर सेटिंग को एक चैनल समायोजित करें. प्रत्येक फ्लोरेसेंस चैनल लेजर पावर और डिटेक्टर हाई वोल्टेज को समायोजित करने के लिए, संतृप्ति से बचने और फोटोब्लीचिंग को सीमित करते हुए सबसे अच्छा गतिशील रेंज संभव इकट्ठा करना सुनिश्चित करता है।
    नोट: इस प्रयोग में, GFP 488 हरे चैनल के साथ छवि थी, (488 एनएम लेजर और 500 और 550 एनएम के बीच उत्सर्जन), और 561 लाल चैनल (561 एनएम लेजर और 570 और 600 एनएमके बीच उत्सर्जन) के साथ आरएफपी, और ट्रांसमिशन छवि 561 एनएम लेजर और संचारित प्रकाश डिटेक्टर(टीडी चैनल)का उपयोग कर एकत्र किया गया था।
  5. 10x उद्देश्य के साथ पूरे भ्रूण की छवि के लिए, ओवरलैप के साथ देखने के कई क्षेत्रों की छवि और माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के साथ उन्हें सिलाई।
    नोट: के रूप में भ्रूण इमेजिंग के दौरान आकार में काफी वृद्धि होगी, सुनिश्चित करें कि वहां देखने के पूर्वकाल और भ्रूण के पीछे के क्षेत्र में जगह है । एनडी अधिग्रहण खिड़की के स्कैन लार्ज इमेज टैब का उपयोग करें और देखने के चार आसन्न क्षेत्रों पर कब्जा करने के लिए 10% ओवरलैप के साथ 4 x 1 पैटर्न का चयन करें।
  6. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग करजेड-स्टैक कैप्चर करने के लिए सेटिंग्स को कॉन्फ़िगर करें।
    नोट: क्योंकि भ्रूण कांच पकवान के नीचे के करीब मुहिम शुरू की है, इसके केंद्र नीचे से दूर ले जाएगा के रूप में यह बढ़ता है । एनडी अधिग्रहण खिड़की के जेड टैब का उपयोग करें और विषम सापेक्ष रेंजका चयन करें । इस विधि के साथ, वर्तमान फोकस विमान संदर्भ विमान के रूप में प्रयोग किया जाता है और विमानों के बाकी विषम ऊपर और नीचे वितरित करने के लिए जेड ढेर मात्रा के भीतर पूरे भ्रूण को शामिल कर रहे हैं, पर्याप्त जगह के साथ नमूना विकास के लिए खाते में । सभी प्रयोगों में, अंतराल 11 μm और कुल रेंज के बारे में ४५ विमानों के लिए निर्धारित किया गया था ।
  7. दीर्घकालिक समय-चूक इमेजिंग के दौरान कई भ्रूणों का ध्यान बनाए रखने के लिए, स्वचालित फोकस का उपयोग करें। यदि कई भ्रूण इमेजिंग, प्रत्येकभ्रूण के लिए व्यक्तिगत ऑफसेट स्तर समायोजित करने के लिए संदर्भ विमान पर ध्यान केंद्रित ।
    नोट: इस प्रयोग में, एक लेजर आधारित फोकस स्थिरीकरण प्रणाली का उपयोग किया गया था।
  8. लगभग 1 घंटे के अंतराल पर 55 घंटे की अवधि के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर और छवि में समय-चूक पैरामीटर स्थापित करें। प्रत्येक चक्र में, दो भ्रूण डेटासेट क्रमिक रूप से कैप्चर करें और प्रत्येक चक्र के बाद स्वचालित रूप से डेटा बचाएं।
  9. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के ऑन-लाइन या ऑफ लाइन संस्करण का उपयोग करके छवियों को संसाधित करें। यदि एक से अधिक भ्रूण को इमेजकिया गया था, तो इमेजिंग के स्थान के आधार पर डेटासेट को विभाजित करके प्रत्येक भ्रूण के लिए स्वतंत्र फाइलें बनाएं। 3डी समय डेटा सेट को 2डी टाइम डेटा सेट में बदलने के लिए अधिकतम तीव्रता अनुमानों या इसी तरह के टूल का उपयोग करें। सेव को मेनू विकल्प के रूप में उपयोग करके मूवी फ़ाइलें बनाएं, फ़ाइल प्रारूप के रूप में .avi का चयन करें। 5 फ्रेम/एस की प्लेबैक गति के लिए 200 एमएस अंतराल के साथ नो कंप्रेशन विकल्प का चयन करें।
    नोट: इस प्रयोग में दो भ्रूण ों का मूल डेटासेट सॉफ्टवेयर (फ़ाइल) में स्प्लिट लोकेशन फंक्शन का उपयोग करके विभाजित किया गया था। आयात/निर्यात । स्प्लिट मल्टीपॉइंट्स)। अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण समारोह(छवि) का उपयोग करके 3डी समय डेटासेट को 2डी समय डेटा सेट में परिवर्तित कर दिया गया था। एनडी प्रोसेसिंग। जेड में अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवि बनाएं)।

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Representative Results

बढ़ते विधि का विकास
इस काम का मुख्य उद्देश्य समय की विस्तारित अवधि के लिए जेब्राफिश विकास की समय-चूक इमेजिंग के लिए कम लागत वाली बढ़ती तकनीक विकसित करना था। स्तरित बढ़ते विधि नाजुक ज़ेब्राफिश भ्रूण शरीर के पूर्ण विकास के लिए अनुमति देने के लिए विकसित किया गया था, जबकि इसके आंदोलनों को प्रतिबंधित । यदि परत 1 की अगारोज एकाग्रता बहुत अधिक है, तो भ्रूण विकृत और घुमावदार हो जाएंगे(चित्रा 2)। 0.1% और 0.5% अगारोज पर उगाए गए भ्रूण ों ने पूंछ, विकृत पंख और घुमावदार सिर को छोटा कर दिया है। इसके विपरीत, यदि अगारोज एकाग्रता बहुत कम है, तो भ्रूण समय-चूक माइक्रोस्कोपी के दौरान देखने के क्षेत्र से बाहर चले जाएंगे, भले ही वे एनेस्थेटाइज्ड हों, क्योंकि बढ़ती पूंछ भ्रूण शरीर से बाहर झूलती है और इसे स्थानांतरित करने का कारण बनती है। हमारे हाथों में, इष्टतम अगारोज एकाग्रता 0.028% और 0.034% अगारोज के विभिन्न बैचों के बीच अलग-अलग थी। ०.०२५% से नीचे बढ़ते अगारोज ने भ्रूण को देखने के क्षेत्र में रहने के लिए पर्याप्त प्रतिरोध प्रदान नहीं किया ।

संवहनी, न्यूरोनल और मांसपेशियों के विकास की विस्तारित समय-चूक इमेजिंग
ऊपर वर्णित बढ़ते विधि को अनुकूलित करने के बाद, समय चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों को 55 घंटे की अवधि में कैप्चर किया गया था। हमने विभिन्न ऊतकों में जीएफपी या आरएफपी व्यक्त करते हुए लाइव ट्रांसजेनिक जेब्राफिश की छवि दी। समय चूक इमेजिंग के लिए एंडोजेनस फ्लोरेसेंस के साथ ट्रांसजेनिक मछली का उपयोग करने का एक लाभ यह है कि जीएफपी और आरएफपी जैसे फ्लोरेसेंस अणु जीवित भ्रूण में लगातार उत्पादित होते हैं, और इस प्रकार, यह आसानी से फोटो ब्लीच नहीं करता है। सबसे पहले, टीजी (KDR1: EGFP) मित्फाb692/b69210 और यूबी-जेब्राबो11 के एक क्रॉस के भ्रूण इमेज्ड थे । इन भ्रूणों में, आरएफपी भ्रूण की सभी कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, जो सामान्य भ्रूण संरचना के दृश्य के लिए अनुमति देता है। जीएफपी को वैकुलचर की एंडोथेलियल कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। डबल ट्रांसजेनिक भ्रूण लगभग 30 सोमाइट चरण से 55 घंटे के लिए चित्रित करने के लिए सिर और शरीर में संवहनी विकास कल्पना(चित्रा 3 और पूरक फिल्म S1)0.45 NA के साथ एक 10x उद्देश्य का उपयोग कर किया गया। दो भ्रूण/सत्र जेड-स्टैक और एक पाश में समय चूक के साथ छवि थे ताकि दो अलग तरंगदैर्ध्य में पहले भ्रूण इमेजिंग के बाद, दूसरे एक बाद में छवि और फिर पहले एक फिर से । चित्रा 3 इंटरसेगमेंटल पोत (आईएसवी) अंकुरण, उपासीन जहाजों और सिर वकुलचर के विकास, और ट्रंक विस्तार के साथ एक साथ कौडल नस प्लेक्सस संघनन दिखाता है। वास्कुलचर के साथ पूरे भ्रूण की इमेजिंग से पता चलता है कि ISV अंकुरण सोमाइट्स के बीच में शुरू होता है और तंत्रिका ट्यूब के बिंदु तक पृष्ठीय रूप से बढ़ता है, जहां आईएसवी अगले पूर्वकाल सोमाइट सीमा पर एक दिशा में एक अलग रास्ता और अंकुरित होता है।

इसके बाद, टीजी (mnx: GFP) मिफाb692/b629 और Ubi-Zebrabow के एक क्रॉस के भ्रूण लगभग 30 सोमाइट चरण से ५५ घंटे के लिए इमेजमें थे मोटरन्यूरॉन विकास की कल्पना(चित्र4 और अनुपूरक फिल्म S2)। टीजी (mnx: GFP) पहले मिफाb692/b692 (दोनों ओरेगन विश्वविद्यालय में जेब्राफिश इंटरनेशनल रिसोर्स सेंटर से, या) को पार कर गया था टीजी(mnx:GFP) मित्फाb692/b629का उत्पादन करने के लिए । मोटरन्यूरॉन एक्सोन भ्रूण के वेंट्रल साइड की ओर सोमाइट्स पर वेंट्रल न्यूरल ट्यूब से अंकुरित होते हैं। सोमाइट्स के बीच में अंकुरित होने वाले अंतरखंडीय जहाजों के विपरीत, अक्षों को धरण-गठित सोममाइट्स पर बीच में अंकुरित किया जाता है। अंकुरण तंत्रिका ट्यूब के पूर्वकाल के अंत की ओर शुरू होता है, तंत्रिका ट्यूब से सीधे कोण में, और पीछे फैलता है। सोमाइट/जर्दी इंटरफेस द्वारा, अंकुरण पूर्वकाल और पीछे अंकुरण के लिए दिशा बदलता है । पूर्वकाल न्यूट्रिशंस द्वारा विकासशील हृदय के अंतरीयन पर ध्यान दें।

इसके अलावा, टीजी के एक क्रॉस के भ्रूण (kdr:enl.memRFP) मिफाb692/b692 (टीजी के क्रॉस (kdr:enl.memRFP और mitfab692/b692)और टीजी (mnx:GFP) mitfab692/b692 इमेज्ड थे । पूर्व भ्रूण में, लाल संवहनी फ्लोरेसेंस निषेचन (एचपीएफ) के बाद 36 घंटे तक दिखाई नहीं दे ता था, और इसलिए हमने बाद में 2 डीपीएफ पर इमेजिंग शुरू की। हमने ट्रंक के एक हिस्से को उच्च आवर्धन (20x उद्देश्य) का उपयोग करके जर्दी थैली विस्तार के लिए पृष्ठीय रूप से चित्रित किया। इस फिल्म से पता चलता है कि भ्रूण अभी भी उच्च आवर्धन पर अच्छी इमेजिंग गुणवत्ता के लिए पर्याप्त रखना । अंतरखंडीय जहाजों की स्थिति के संबंध में मोटरन्यूरॉन अक्षों के पृष्ठीय अंकुरण के सह-विकास का पालन किया गया(चित्रा 5 और अनुपूरक मूवी S3)। इन फिल्मों में, वेंट्रल एक्सॉन अंकुरण के महीन विवरण दिखाई दे रहे हैं, साथ ही तंत्रिका ट्यूब से एक बिंदु तक पृष्ठीय अक्षुण्ण अंकुरित होते हैं जहां न्यूरोनल एक्सोन और इंटरसेगमेंटल जहाजसह-प्रवास करते हैं। कौडल नस प्लेक्सस संघनन भी स्पष्ट रूप से दिखाया गया है। ध्यान दें कि एक न्यूराइट अंकुर के रूप में पूंछ के पीछे के अंत की ओर याद आ रही है (दाईं ओर से 12th न्यूराइट की स्थिति में), निकटतम पीछे न्यूरॉन भ्रूण के पूर्वकाल भाग की ओर फैली हुई है न्यूराइट्स 11 और 13 के बीच क्षेत्र को कवर करने के लिए ।

अंत में, HGn39b12,13 और यूबी-जेब्राबो का एक क्रॉस इमेज्ड था। एचजीएन39बी हीट शॉक प्रोटीन ATPase होमोलॉग 1 (AHA1) जीन(http://kawakami.lab.nig.ac.jp/)के एक्टिवेटर में जीएफपी डालने के साथ एक zTRAP लाइन है और यह सोमाइट्स(चित्रा 6 और पूरक मूवी S4)की मांसपेशियों में जीएफपी को व्यक्त करता है। जैसे-जैसे सोमाइट संख्या बढ़ती है, सोमाइट्स लंबाई और चौड़ाई में भी विस्तारकरते हैं। इस फिल्म को भी अच्छी तरह से उबी-जेब्राबो मछली लाइन से लाल फ्लोरेसेंस में दिल के विकास से पता चलता है ।

Figure 1
चित्रा 1: बढ़ते विधि का विवरण। (A)35 मिमी डिश में ग्लास बॉटम द्वारा बनाई गई छोटी अच्छी तरह से ज़ेब्राफिश भ्रूण जोड़ें। (ख)भ्रूण को ढकने के लिए छोटे कुएं में अगारोज लेयर 1 जोड़ें । (ग)सावधानी से छोटे कुएं के ऊपर एक कवर ग्लास रखें। (D)35 मिमी डिश के पूरे तल पर अगारोज लेयर 2 जोड़ें। (ई)पकवान में E3 जोड़ें। (एफ)बढ़ते सेट अप के एक क्रॉस सेक्शन की योजनाबद्ध ड्राइंग । (जी)अंतिम असेंबल में जेब्राफिश भ्रूण की माइक्रोस्कोप छवि (5x उद्देश्य) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: भ्रूण विकास प्रतिबंध और अगारोज की विभिन्न सांद्रता में विकास ात्मक देरी। भ्रूण विभिन्न अगारोज सांद्रता और उनके आकार और विकास में घुड़सवार थे ४८ hpf पर छवि । डिजिटल माइक्रोस्कोप कलर कैमरा (2.5x उद्देश्य) और साथ माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर से लैस माइक्रोस्कोप द्वारा कैप्चर की गई छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: वैकुलचर के विकास का दृश्य। टीजी (kdr1: EGFP) मिफाb692/b692 और यूबी-जेब्राबो के क्रॉस एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर ५५ घंटे के लिए लगभग 30 सोमाइट चरण से छवि । हरे रंग और अन्य सभी कोशिकाओं में लाल रंग में वास्कुल्चर। स्केल बार 500 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: न्यूरॉन्स और न्यूराइट अंकुरण के विकास का दृश्य। टीजी के क्रॉस (mnx:GFP) मिफाb692/b629 और यूबी-जेब्राबो ने एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर ५५ घंटे के लिए लगभग 30 सोमाइट चरण से छवि । हरे रंग में मोटरन्यूरॉन्स, लाल रंग में अन्य सभी कोशिकाएं। स्केल बार 500 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: न्यूरॉन्स और वैक्यूलेचर के सह-विकास का दृश्य। टीजी के क्रॉस (kdr:enl.memRFP) मिफाb692/b692 और Tg (mnx:GFP) मिफाb692/b692 इमेजड के बारे में 2 dpf से ५५ घंटे के लिए एक confocal माइक्रोस्कोप पर । हरे रंग में लाल, मोटरन्यूरॉन्स में वास्कुलचर। स्केल बार 500 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: सोमाइट्स में मांसपेशियों की जीएफपी अभिव्यक्ति का दृश्य। HGn39b और Ubi-ज़ेब्राबो के क्रॉस के बारे में 30 सोमाइट चरण से ५५ घंटे के लिए एक confocal माइक्रोस्कोप पर छवि थे । हरे रंग में मांसपेशी, लाल रंग में अन्य सभी कोशिकाओं। स्केल बार 500 माइक्रोन कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Supplementary Movie S1
अनुपूरक फिल्म S1: टीजी के एक क्रॉस के एक भ्रूण की फिल्म (kdr1:EGFP) मिफाb692/b692 और Ubi-Zebrabow एक confocal माइक्रोस्कोप पर ५५ घंटे के लिए एक 10x उद्देश्य का उपयोग कर के बारे में 30 सोम्माइट मंच से छवि । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Supplementary Movie S2
अनुपूरक फिल्म S2: टीजी के एक क्रॉस के एक भ्रूण की फिल्म (mnx:GFP) मिफाb692/b629 और Ubi-Zebrabow एक confocal माइक्रोस्कोप पर ५५ घंटे के लिए एक 10x उद्देश्य का उपयोग कर के बारे में 30 सोमाइट मंच से छवि । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Supplementary Movie S3
अनुपूरक फिल्म S3: टीजी के एक क्रॉस के एक भ्रूण की फिल्म (kdr:enl.memRFP) मिफाb692/b692 और टीजी (mnx:GFP) मिफाb692/b692 एक confocal माइक्रोस्कोप पर ५५ एच के लिए एक 2 dpf से एक 20x उद्देश्य का उपयोग कर छवि । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Supplementary Movie S4
अनुपूरक मूवी S4: HGn39b और Ubi-Zebrabow के एक क्रॉस के एक भ्रूण की फिल्म एक confocal माइक्रोस्कोप पर ५५ घंटे के लिए एक 10x उद्देश्य का उपयोग कर के बारे में 30 सोमाइट मंच से छवि । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

पूरे जेब्राफिश भ्रूण की विस्तारित समय-चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए एक बढ़ते विधि का वर्णन यहां किया गया है। बढ़ते विधि के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम अगारोज की इष्टतम एकाग्रता की पहचान करना है जो अप्रतिबंधित जेब्राफिश भ्रूण विकास के लिए अनुमति देगा, और साथ ही भ्रूण को कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए पूरी तरह से तय स्थिति में रखें। क्योंकि अगारोज की इष्टतम एकाग्रता बहुत संकीर्ण है, यह मूल्य समाधान की तैयारी के दौरान अगारोज के वजन और ई 3 की मात्रा के माप में त्रुटियों के प्रति बहुत संवेदनशील है। इष्टतम एकाग्रता भ्रूण के तापमान और चरण पर भी निर्भर हो सकती है। इस प्रकार, इष्टतम एकाग्रता को विभिन्न सांद्रता के परीक्षणों की पुनरावृत्ति के माध्यम से अगारोज समाधान के प्रत्येक नए बैच के लिए फिर से परिभाषित करने की आवश्यकता होगी।

एक और महत्वपूर्ण कदम बढ़ते विधि में है अगारोज की दूसरी परत के अलावा है। दूसरी परत जगह में कवर ग्लास रखती है । इसे एक समय में थोड़ा सा पकवान में ध्यान से जोड़ा जाना चाहिए ताकि यह कवर ग्लास को स्थानांतरित न करे। दूसरी परत भी E3 के लिए एक permeable बाधा के रूप में कार्य करता है । E3 के बिना, भ्रूण इमेजिंग के दौरान बाहर सूख जाएगा । अगारोज की दूसरी परत के बिना, कवर ग्लास और भ्रूण तैरना शुरू कर देंगे।

प्रस्तावित बढ़ते विधि की एक सीमा यह है कि जबकि यह उल्टे माइक्रोस्कोप के लिए अच्छी तरह से काम करता है, यह ईमानदार माइक्रोस्कोप के लिए काम नहीं करता है । E3 के साथ ग्लास बॉटम डिश भरकर, पैराफिल्म के साथ सील करके, और इसे उल्टा करके, एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग करके समय-चूक इमेजिंग करने के लिए कई प्रयास किए गए थे। हालांकि, अक्सर इसके परिणामस्वरूप यह हुआ कि बढ़ते इमेजिंग के माध्यम से आधे रास्ते ढह गए। यह लेजर प्रकाश के लंबे जोखिम के बाद नमूने में बढ़ी हुई गर्मी के कारण हो सकता है, जो जम अगारोज परत पिघलने का कारण बनता है ।

समय चूक माइक्रोस्कोपी के अंत तक भ्रूण पेरिकार्डियल एडीमा दिखाना शुरू कर दिया। विभिन्न प्रयोगों के बीच अलग-अलग, इमेजिंग के 35 से 50 घंटे के बीच एडीमा मनाया गया। क्या यह भ्रूण स्थिरीकरण, या संवेदनाओं का प्रभाव के कारण हुआ था, वर्तमान में ज्ञात नहीं है । ट्राइकेन कंकाल और हृदय की मांसपेशियों के संकुचन को दबाने के लिए जाना जाता है। नतीजतन, Tricaine वयस्क मछली14 और भ्रूण15में दिल की दर को प्रभावित करता है । अन्य अध्ययनों में यह भी बताया गया है कि ट्राइकेन उपचार के कारण जेब्राफिश भ्रूण2,16में पेरिकार्डियल एडिमा होता है । इस लेख में, ट्रिकेन (0.016-0.020%) इस्तेमाल किया गया था कि आमतौर पर जेब्राफिश अनुसंधान में प्रयोग किया जाता है; फिर भी, पेरिकार्डियल एडिमा हमारे इमेजिंग अवधि के अंत तक हुआ। पेरिकार्डियल एडीमा ने भ्रूण की इमेजिंग को लंबे समय तक सक्षम करने के लिए एक मुख्य प्रतिबंध का गठन किया। इस हृदय विषाक्तता को कम करने के संभावित तरीके दो अलग-अलग एनेस्थेटिक्स का संयोजन कर रहे हैं, जैसे कि यूजेनॉल के साथ ट्राइकेन, या एनेस्थेटिक्स16के लिए α-bungarotoxin mRNA इंजेक्शन का उपयोग कर रहे हैं; संयुक्त या वैकल्पिक एनेस्थेटाइजिंग यौगिकों के लाभकारी प्रभावों की आगे जेब्राफिश विकास की विस्तारित समय-चूक इमेजिंग के लिए जांच किए जाने की आवश्यकता है।

अंत में, वर्णित बढ़ती विधि तेज, आसान, लागत प्रभावी है और किसी भी उल्टे माइक्रोस्कोप पर काम करता है। नियमित रूप से ग्लास बॉटम व्यंजन और कम पिघलने वाले अगारोज का उपयोग किया जा सकता है, और कोई विशेष मोल्ड, उपकरण या इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता नहीं है। स्तरित बढ़ते विधि भ्रूण के विकास के लिए अनुमति देता है, जबकि एक ही समय में एक निश्चित स्थिति में भ्रूण रखते हुए । पूरे जीव के विस्तारित समय-चूक इमेजिंग का उपयोग करके ऊतक विकास का नया ज्ञान प्राप्त किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम ट्रांसजेनिक मछली के उपहार के लिए अल्बर्ट पैन और Arndt Sieakmann शुक्रिया अदा करते हैं । हम ट्रांसजेनिक जेब्राफिश एचजीएन39बीके उपहार के लिए जापान के शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय से राष्ट्रीय जैव संसाधन परियोजना, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जेनेटिक्स में कोइची कावाकामी को धन्यवाद देते हैं । हम फातिमा मर्चेंट और कैथलीन गैजेस्की को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी पर सहायता के लिए और तस्वीरों के लिए ट्रेसी थेरियाल्ट का भी शुक्रिया अदा करते हैं ।

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (अनुदान संख्या P30ES023512 और अनुबंध संख्या HHSN273201500010C) के पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । एसयू को केक कम्प्यूटेशनल कैंसर बायोलॉजी प्रोग्राम (गल्फ कोस्ट कंसोर्टिया सीपीआरआईटी ग्रांट RP140113) और ह्यूग रॉय और लिली एंडोमेंट फंड द्वारा एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था। जे-Å जी रॉबर्ट ए वेल्च फाउंडेशन (ई-0004) द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Low melting agarose Sigma-Aldrich, MO A9414 Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom MatTek Corporation, MA P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222) Sigma-Aldrich, MO E10521 Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich, MO P7629 Store dissolved solution at -20 °C
Micro cover glass 22x22 mm VWR 48366 067
Leica DMi8 fluorescence microscope Leica NA
LAS X software Leica NA Microscope software
DMC4500 digital microscope camera Leica NA
Nikon A1S confocal microscope Nikon Instruments Inc. NA
Nikon NIS AR Version 4.40 Nikon Instruments Inc. NA Microscope software

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References

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पूरे ज़ेब्राफिश भ्रूण की विस्तारित समय-चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए एक स्तरित बढ़ते विधि
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Upadhyay, S., Vergara, L., Shah, P., … More

Upadhyay, S., Vergara, L., Shah, P., Gustafsson, J. Å., Kakadiaris, I., Bondesson, M. A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (155), e60321, doi:10.3791/60321 (2020).

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