Summary
В этой статье описывается метод установки хрупких эмбрионов зебры для длительного замедленного конфокальной микроскопии. Этот недорогой метод легко выполнять с помощью обычной стеклянной нижней микроскопии блюда для визуализации на любой перевернутый микроскоп. Монтаж выполняется слоями агарозы в разных концентрациях.
Abstract
Динамика развития может сопровождаться конфокальной замедленной микроскопией живых трансгенных эмбрионов зебры, выражающих флуоресценцию в конкретных тканях или клетках. Трудность с визуализацией всего эмбриона заключается в том, что эмбрионы зебры существенно растут в длину. При установке, как это регулярно делается в 0,3-1% низкорасплавленного агарозы, агароз налагает ограничение роста, что приводит к искажениям в мягком организме эмбриона. Тем не менее, для выполнения конфокальной замедленной микроскопии, эмбрион должен быть обездвижен. В этой статье описывается слоистый метод монтажа эмбрионов зебры, которые ограничивают подвижность эмбрионов, позволяя неограниченный рост. Монтаж выполняется слоями агарозы в разных концентрациях. Чтобы продемонстрировать удобство использования этого метода, весь эмбрион сосудистой, нейрональной и мышечной развития был изображен в трансгенных рыб в течение 55 часов подряд. Этот метод монтажа может быть использован для легкой, недорогой визуализации целых эмбрионов зебры с помощью перевернутых микроскопов без требований плесени или специального оборудования.
Introduction
Зебрафиш уже давно является образцовым организмом для биологии развития, а микроскопия является основным методом визуализации эмбрионального развития. Преимущества использования эмбрионов зебры для исследований в области развития включают небольшой размер, оптическую ясность, быстрое развитие и высокую плодовитость взрослых рыб. Поколение трансгенных линий зебры, выражающих флуоресценцию в определенных тканях или клетках, позволило напрямую визуализировать развитие тканей способами, которые невозможны с более крупными позвоночными животными. В сочетании с замедленной микроскопией можно легко изучить детали и динамику развития тканей.
Трудность с развитием изображения зебры заключается в том, что эмбрионы существенно растут в длину; эмбрион продлевает свою длину четыре раза в течение первых 3 дней жизни1. Кроме того, тело раннего эмбриона мягкое, и легко становится искаженным, если рост ограничен. Тем не менее, для выполнения конфокальной микроскопии, эмбрион должен быть обездвижен. Чтобы сохранить эмбрионы в фиксированном положении для конфокальной визуализации покадровой, они регулярно обезопасиваются и устанавливаются в 0,3-1% низкорасплавленной агарозы. Это имеет то преимущество, что позволяет для некоторого роста во время визуализации в течение определенного периода времени, ограничивая движения эмбриона. Части эмбриона можно эффективно отобразить вот так. Однако при использовании этого метода для визуализации всего эмбриона в течение длительных периодов времени наблюдаются искажения из-за ограниченного роста, вызванного агарозой. Таким образом, требуются другие методы монтажа. Кауфманн и его коллеги описали альтернативное монтаж эмбрионов зебры для микроскопии светового листа, таких как селективная микроскопия освещения самолета (SPIM), путем установки эмбрионов в флюиринированный этилен пропилен (FEP) трубки, содержащие низкие концентрации агарозы или метилцеллюлозы2. Этот метод производит превосходную визуализацию эмбриогенеза с течением времени. Шмид и др. описывают монтаж до шести эмбрионов в агарозе в трубках FEB для светолистой микроскопии3, обеспечивающей визуализацию нескольких эмбрионов за один сеанс визуализации. Формы были использованы для создания эмбрионов массивов для эффективного монтажа большего числа эмбрионов4. Masselkink и др. построили 3D печатных пластиковых форм, которые могут быть использованы для кремния слепки, что эмбрионы зебры на разных стадиях могут быть помещены в, что позволяет монтаж в постоянном положении для визуализации, в том числе confocal изображений5. 3D печать также была использована для изготовления форм для последовательного позиционирования эмбрионов зебры в 96-хорошем формате6. Некоторые формы настроены для определенных этапов и не может позволить неограниченный рост в течение длительных периодов времени, в то время как другие формы являются более гибкими. Недавно, Weijts et al. опубликовалдизайн дизайн и изготовление блюда из четырех колодцев для живой визуализации эмбрионов зебры7. В этом блюде хвост и ствол обезеченных эмбрионов рыб помещаются вручную под прозрачую силиконовую крышу, прикрепленную чуть выше крышки стекла, чтобы сформировать карман. Эмбрион затем фиксируется в этом положении путем добавления 0,4% агарозы. Это крепление позволяет для изображения около 2 мм длинной задней части (ствол и хвост) эмбриона, и, как до 12 эмбрионов могут быть установлены на скважину, метод позволяет для изображения нескольких образцов. Аналогичным образом, Хирсингер и Стивентон недавно представили метод, где голова рыбы установлена в агарозе, в то время как хвост может свободно расти, и этот метод также эффективно облегчает визуализацию ствола и хвоста области эмбриона8.
В этой статье описывается слоистый метод монтажа эмбрионов зебры, которые ограничивают движения эмбрионов, обеспечивая при этом неограниченный рост. Преимущества этого монтажного метода в том, что это недорогой, быстрый и простой метод установки эмбрионов различных стадий для визуализации с помощью любого перевернутого микроскопа. Монтаж позволяет проводить долгосрочную визуализацию всего тела (головы, туловища и хвоста) во время развития эмбриона. Чтобы продемонстрировать удобство использования этого метода, весь эмбрион сосудистой, нейрональной и мышечной развития был изображен в трансгенных рыб. Два эмбриона за сеанс, на двух длинах волн в 3D были изображены замедленной микроскопией в течение 55 часов подряд, чтобы сделать фильмы развития тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Представленная здесь работа по уходу за животными была одобрена институциональными комитетами по уходу за животными и использованию (IACUCs) Университета Хьюстона и Университета Индианы.
1. Рыбное животноводство
ПРИМЕЧАНИЕ: Работа с моделями позвоночных требует протокола, одобренного IACUC. Она должна проводиться в соответствии с соответствующими национальными и международными руководящими принципами.
- Поддержание взрослых зебры, как описано в ранее опубликованной литературе9.
- Во второй половине дня, место взрослых зебры в разведении танков. Порода мужчин к самкам в соотношении 1:2.
2. Подготовка решений
- Сделать запас решение 1% низким расплава агарозы в эмбрионе сми (E3: 5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мм CaCl2, 0,33 мМ MgSO4, скорректированы на рН 7,0). Aliquot стокового раствора в 1,5 мл труб и хранить их при 4 градусах Цельсия.
- Сделать запас решение 4% (w/v) tricaine (MS-222) в дистиллированной воде. Храните при 4 градусах по Цельсию в темной бутылке.
ВНИМАНИЕ: Трикаин токсичен и должен быть взвешен и растворен в дымящей капюшон. - Сделать запас раствор 20 мм N-фенилтиуреа (PTU) в дистиллированной воде. Хранить при -20 градусах по Цельсию.
3. Подготовка эмбрионов
- После спаривания, урожай эмбрионов в E3 в чашке Петри и инкубировать их на 26,5 градусов по Цельсию в течение 28 ч до монтажа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это замедляет развитие эмбрионов, так что эмбрионы примерно на 30 стадии сомита в начале визуализации. - Анестезия эмбрионов в 0,016-0,020% трикаин в E3. Чтобы ингибировать пигментацию, добавьте ПТУ к концентрации 200 мкм.
- Дехорионат эмбрионы с помощью щипков под рассекающим микроскопом. Используя две щипца, сцепление и осторожно тянуть хорион друг от друга, чтобы освободить эмбриона.
4. Монтаж в агарозе
ПРИМЕЧАНИЕ: Разработанный метод монтажа требует двух различных концентраций низкорасплавленной агарозы в E3 с 0,02% трикаин и ПТУ по мере необходимости. Первый агарозный раствор содержит оптимальную концентрацию агарозы, при которой искажения и подвижность находятся на минимальном уровне. Оптимизация описана в шаге 5 ниже.
- Нагрейте растворы агарозы для двух слоев (концентрация определена в шаге 5 ниже и 1%) до 65 градусов по Цельсию. Дайте агарозе остыть примерно до 30 градусов по Цельсию непосредственно перед монтажом, чтобы эмбрион не пострадал от жары. Для монтажа используйте 35-мм стеклянную посуду со стеклянным дном No 0. Крышка стекла прилагается к нижней части блюда создает 10 мм мелкой (около 1,2 мм глубиной) хорошо, в котором эмбрион должен быть помещен.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае концентрация с наименьшей подвижностью и искажениями составила от 0,025 до 0,040% агарозы. - Аккуратно поместите дехорионированный эмбрион с одной из боковых сторон к нижней части блюда с помощью стеклянной пипетки или микропипетты. При использовании микропайпета, вырезать внешнюю часть кончика, чтобы увеличить размер отверстия, чтобы соответствовать эмбриона(Рисунок 1A). Аккуратно удалите оставшиеся E3 с помощью микропипетта.
- Добавьте первый раствор агарозы в небольшой колодец, созданный крышкой стекла, прикрепленного к нижней части блюда, чтобы покрыть эмбрион (Слой 1) (Рисунок 1B). Убедитесь, что агароза покрывает небольшой колодец, но не будет переполнять его.
- Обложка небольшой колодец с крышкой стекла (22 мм х 22 мм) (Рисунок 1С), чтобы создать узкий агароуз заполнены пространство с эмбрионом между двумя очками крышки.
- Поместите слой 1% раствора агарозы поверх крышки стекла по всей нижней части блюда (слой 2) (Рисунок 1D). По мере того как этот слой затвердевает, он держит стекло крышки в месте.
- Заполните оставшуюся часть блюда с E3, содержащий 0,02% трикаин держать систему гидратированных (слой 3) (Рисунок 1E).
ПРИМЕЧАНИЕ: В этой установке, крышка стекла и 1% агарозы защитить нижний слой от получения разбавленной.
5. Оптимизация раствора агарозы для слоя 1
- Чтобы определить оптимальную концентрацию агарозы для слоя 1, используйте многомасштабный подход к поиску сетки. Монт эмбрионов в увеличении концентрации агарозы в диапазоне от 0,01% до 1% с последующим замедленной визуализации ограничения роста эмбриона и подвижности в поле зрения. Определите концентрации, в которых как искажение, так и подвижность находятся на минимальном уровне.
- Для оптимизации концентрации агарозы дальше, монтировать эмбрионы с использованием более тонкого диапазона концентраций агарозы (например, между 0,025 и 0,040% агарозы) в зависимости от концентрации оказались лучшими в шаге 5.1 (например, 0.025%, 0.028%, 0.031%, и т.д.).
ПРИМЕЧАНИЕ: В нашей лаборатории оптимальная концентрация агарозы составляла около 0,03%.
6. Визуализация замедленного времени
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот монтажный метод работает для любого перевернутого микроскопа с функцией замедленного действия для флуоресценции и яркой визуализации поля.
- Выполняйте замедленное изображение для всего эмбриона или его частей на срок до 55 ч. Для визуализации нескольких эмбрионов используйте адаптер сцены, который содержит несколько блюд с одним эмбрионом, установленным на блюдо. Поверните блюда один за 1, так что эмбрионы примерно горизонтально расположены, как определяется глазом. Для оптимального роста и развития эмбриона используйте сцену микроскопа с инкубатором, установленным при 28,5 градусах Цельсия.
- Выберите цель с низким увеличением в программном обеспечении микроскопа. Под глазом, найти и мелко выровнять эмбрионы горизонтально, вращая блюда с помощью яркого освещения поля и записывать их местоположение в программном обеспечении. Создайте имя файла для автоматической экономии данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте для записи местонахождения эмбрионов использовались цель плана apo 4x 0.2 NA и вкладка XY в окне приобретения ND. Данные были сохранены в формате .nd2. Цель была выбрана, нажав на его значки во вкладке Ti Pad. - Установите размер пинхола, скорость сканирования, размер изображения и масштабирование. Затем выберите более высокую цель увеличения для захвата изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте для визуализации целых эмбрионов использовалась цель плана-апо 10х 0,45 NA, а для получения изображений высших частей эмбриона использовался суперфлюор 20x 0,75 NA. Пинхол был установлен на 1,2 а.е. (19,2 мкм для объектива 10x), скорость сканирования была установлена для пиксельного времени проложек 2,4 м,а размер изображения был установлен до 1024 х 1024 пикселей с сканированием зум одного, давая пиксель размер 1,24 мкм для 10x и объектива 0,62 мкм для объектива 20x. - Выберите каналы для изображения флуоресценции. Отрегулируйте настройки захвата изображения по одному каналу. Для каждого канала флуоресценции настроить лазерную мощность и детектор высокого напряжения, убедившись, что для сбора наилучшего динамического диапазона возможно, избегая насыщения и ограничения фотоотбеления.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте, GFP был изображен с 488 зеленый канал, (488 нм лазера и выбросов между 500 и 550 нм), и RFP с 561 красный канал (561 нм лазера ивыбросов между 570 и 600 нм), и передача изображения была собрана с помощью 561 нм лазера и передаваемого детектора света (T канал). - Чтобы изобразить весь эмбрион с целью 10x, изображение нескольких полей зрения с перекрытием и сшить их вместе с помощью программного обеспечения микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как эмбрионы будут расти существенно в размерах во время изображения, убедитесь, что есть пространство в поле зрения передней и задней к эмбриону. Используйте вкладку Scan Large Image окна приобретения ND и выберите шаблон 4 x 1 с перекрытием 10% для захвата четырех смежных полей зрения. - Настроили настройки для захвата стеков с помощью программного обеспечения микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку эмбрион установлен близко к нижней части стеклянной тарелки, его центр будет отходить от дна, как он растет. Используйте вкладку в окне приобретения ND и выберите асимметричный относительный диапазон. С помощью этого метода текущая плоскость фокусировки используется в качестве референтной плоскости, а остальные плоскости асимметрично распределены выше и ниже, чтобы включить весь эмбрион в объеме стека, с достаточным пространством для учета роста образца. Во всех экспериментах интервал был установлен до 11 мкм, а общая дальность - около 45 плоскостей. - Для того, чтобы сохранить фокус нескольких эмбрионов во время долгосрочной визуализации промежуток времени, используйте автоматизированный фокус. При визуализации нескольких эмбрионов, отрегулируйте индивидуальные уровни смещения для каждого эмбриона, чтобы сосредоточиться на справочной плоскости.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте была использована лазерная система стабилизации фокусировки. - Настройка параметров замедленного действия в программном обеспечении и изображении микроскопа в течение 55 ч с интервалом около 1 ч. На каждом цикле захватываетдва два набора данных эмбрионов последовательно и автоматически сохраняете данные после каждого цикла.
- Обработка изображений с помощью он-лайн или офф-лайн версии программного обеспечения микроскопа. Если было изображено более одного эмбриона, создайте независимые файлы для каждого эмбриона путем разделения набора данных на основе расположения изображений. Используйте проекции максимальной интенсивности или аналогичный инструмент для преобразования наборов данных 3D-времени в наборы данных 2D-времени. Создавайте файлы фильмов, используя опцию «Сохранить» в качестве меню, выбрав .avi в качестве формата файла. Выберите опцию «Нет сжатия» с интервалами 200 мс для скорости воспроизведения 5 кадров/с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Исходный набор данных двух эмбрионов в этом эксперименте был разделен с помощью функции сплит амплоположения в программном обеспечении(Файл Импорт/Экспорт Сплит Multipoints). 3D-наборы данных времени были преобразованы в наборы данных 2D-времени с использованием функции проекции максимальной интенсивности (изображение Nd Обработка Создайте максимальное изображение проекции интенсивности в no).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Разработка метода монтажа
Основной целью этой работы было разработка недорогой техники монтажа для замедленного получения изображений зебры в течение длительных периодов времени. Метод многослойного монтажа был разработан для обеспечения полного роста хрупкого тела эмбриона зебры, ограничивая при этом его движения. Если концентрация агарозы слоя 1 слишком высока, эмбрионы станут искаженными и изогнутыми(рисунок 2). Эмбрионы, выращенные на 0,1% и 0,5% агарозы имеют укороченные хвосты, искаженные плавники и изогнутые головы. Напротив, если концентрация агарозы слишком низка, эмбрионы будут выходить из поля зрения во время микроскопии замедленного времени, даже если они под ней обезопасить, так как растущий хвост выкатывается из тела эмбриона и заставляет его двигаться. В наших руках оптимальная концентрация агарозы варьировалась от 0,028% до 0,034% агарозы между различными партиями агарозы. Установка ниже 0,025% агарозы не обеспечивала достаточной устойчивости для эмбриона, чтобы остаться в поле зрения.
Расширенная замедленной визуализация развития сосудов, нейронов и мышц
После оптимизации метода монтажа, описанного выше, замедленного действия конфокальных микроскопических изображений были захвачены в течение 55 ч. Мы изобрали живых трансгенных зебр, выражающих GFP или RFP в различных тканях. Преимущество использования трансгенной рыбы с эндогенной флуоресценцией для визуализации времени заключается в том, что молекулы флуоресценции, такие как GFP и RFP, непрерывно вырабатываются в живом эмбрионе, и, таким образом, это не легко фото отбеливатель. Во-первых, были изображены эмбрионы креста Tg (kdr1: EGFP)mitfab692/b69210 и Ubi-zebrabow11. В этих эмбрионах RFP выражается во всех клетках эмбриона, что позволяет визуализировать общую структуру эмбриона. GFP выражается в эндотелиальных клетках сосуды. Двойные трансгенные эмбрионы были изображены в течение 55 часов из примерно 30 сомитовой стадии, чтобы визуализировать развитие сосудов в голове и теле(Рисунок 3 и Дополнительный фильм S1) с помощью 10x цели с 0,45 NA. Два эмбриона/сессии были изображены с z-стеками и замедленной просрочкой в петле, так что после визуализации первого эмбриона на двух разных длинах волн, второй был впоследствии изображен, а затем первый снова. На рисунке 3 показаны прорастание межсегментного сосуда (ISV), развитие субинтепробальных сосудов и головных сосудов, а также конденсации сплетения сплетения скупой каудальной вены вместе с расширением ствола. Изображение всего эмбриона с помощью сосуды показывает, что прорастание ISV начинается между сомитами и растет dorsally до точки нервной трубки, где ISVs принимает другой путь и прорастает в направлении к следующей передней границы сомита.
Далее, эмбрионы креста Tg (mnx:GFP)mitfab692/b629 и Ubi-zebrabow были изображены в течение 55 часов примерно с 30 сомитовой стадии, чтобы визуализировать моторообразное развитие(Рисунок 4 и Дополнительный фильм S2). Tg (mnx:GFP) был впервые перешел к mitfab692/b692 (оба из Международного ресурсного центра Зебрафиш в Университете штата Орегон, ИЛИ) для производства Tg(mnx:GFP)mitfab692/b629. Motorneuron аксоны прорастают из брюшной нервной трубки над сомитами к брюшной стороне эмбриона. В отличие от межсегментных сосудов, которые прорастают между сомитами, аксоны прорастают посередине над шевронами. Прорастание начинается к передней части нервной трубки, под прямым углом от нервной трубки, и распространяется задним. По интерфейсу somite/желтка, прорастание меняет направление к передней и задней прорастания. Обратите внимание на иннервацию развивающегося сердца передними невритами.
Кроме того, были изображены эмбрионы креста Tg (kdr:enl.memRFP)mitfab692/b692 (крест Tg(kdr:enl.memRFP и mitfab692/b692)и Tg (mnx:GFP)mitfab692/b692. В бывших эмбрионах, красная сосудистая флуоресценция не была видна до 36 часов после оплодотворения (hpf), и поэтому мы начали визуализации на более поздний момент времени на 2 dpf. Мы изобразили часть ствола, дорсически к расширению желток-мешка, используя более высокое увеличение (20x цель). Этот фильм показывает, что эмбрионы лежали еще достаточно для хорошего качества изображения при более высоком увеличении. Последовало совместное развитие сочной прорастания моторных аксонов по отношению к положению межсегментных сосудов(рисунок 5 и дополнительный фильм S3). В этих фильмах видны более мелкие детали прорастания брюшной аксон, а также точечный аксон, прорастающий из нервной трубки до точки, где нейронные аксоны и межсегментные сосуды комигрируют. Конденсация сплетения сплетения caudal вен также ясно показана. Обратите внимание, что, как нейритросток отсутствует к задней части хвоста (в положении12-й нейрит с правой стороны), ближайший задний нейрон простирается к передней части эмбриона, чтобы покрыть область между невритами 11 и 13.
Наконец, крест HGn39b12,13 и Уби-зебрабоу был изображен. HGn39b является zTRAP линия с GFP вставки в активатор теплового шока белка ATPase homolog 1 (AHA1) ген(http://kawakami.lab.nig.ac.jp/)и он выражает GFP в мышцах сомитов(Рисунок 6 и дополнительный фильм S4). По мере увеличения числа сомитов сомиты также расширяются по длине и ширине. Этот фильм также красиво показывает развитие сердца в красной флуоресценции от линии рыбы Уби-зебрабоу.
Рисунок 1 : Описание метода монтажа. (A) Добавьте эмбрион зебры к маленькому колодцу, созданному стеклянным дном в 35-миллиметровой тарелке. (B) Добавить слой агарозы 1 в небольшой колодец, чтобы покрыть эмбрион. (C) Тщательно поместите крышку стекла над небольшой колодец. (D) Добавить слой агарозы 2 на все дно 35 мм блюдо. (E) Добавить E3 к блюду. (F) Схематический рисунок поперечного сечения монтажа создана. (G) Микроскоп изображение (5x цель) эмбриона зебры в окончательном монтаже. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Ограничение роста эмбрионов и задержка развития в различных концентрациях агарозы. Эмбрионы были установлены в различных концентрациях агарозы и их размер и развитие изображения на 48 л.с. Изображения, снятые микроскопом, оснащенный цифровой цветной камерой микроскопа (2,5-x объектив) и сопутствующим программным обеспечением для микроскопов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Визуализация развития сосуды. Крест Tg (kdr1: EGFP)mitfab692/b692 и Ubi-zebrabow изображены от около 30 сомитовой стадии для 55 h на конфокальном микроскопе. Васкулатура в зеленом цвете и все другие клетки в красном цвете. Шкала бар 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Визуализация развития нейронов и прорастания неврита. Крест Tg (mnx:GFP)mitfab692/b629 и Ubi-zebrabow изображены от около 30 сомитовой стадии для 55 h на конфокальном микроскопе. Моторнейроны в зеленом цвете, все остальные клетки в красном. Шкала бар 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Визуализация совместного развития нейронов и сосуд. Крест Tg (kdr:enl.memRFP)mitfab692/b692 и Tg (mnx:GFP)mitfab692/b692 сизображением в течение 55 часов от около 2 dpf на конфокальном микроскопе. Васкулатура в красном, моторнейроны в зеленом. Шкала бар 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Визуализация экспрессии мышц GFP в сомитах. Крест HGn39b и Ubi-zebrabow были изображены на конфокальном микроскопе для 55 ч от около 30 сомитовой стадии. Мышцы в зеленом, все остальные клетки в красном. Шкала бар 500 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительный фильм S1: Фильм эмбриона крест Tg (kdr1:EGFP)mitfab692/b692 и Ubi-zebrabow изображен примерно с 30 сомитовой стадии в течение 55 ч на конфопальный микроскоп с помощью 10x цели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный фильм S2: Фильм эмбриона крест Tg (mnx:GFP)mitfab692/b629 и Ubi-zebrabow изображен примерно с 30 сомитовой стадии в течение 55 ч на конфопальный микроскоп с помощью 10x цели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный фильм S3: Фильм эмбриона крестT (kdr:enl.memRFP)mitfab692/b692 и Tg (mnx:GFP)mitfab692/b692 изображен примерно с 2 dpf на 55 ч на конфокальный микроскоп с помощью 20x цели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный фильм S4: Фильм эмбриона крест HGn39b и Ubi-zebrabow изображен примерно с 30 сомит сцены для 55 ч на конфокальный микроскоп с использованием 10x цели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь описан монтажный метод для длительного замедленного конфокальной микроскопии целых эмбрионов зебры. Наиболее важным шагом для монтажного метода является определение оптимальной концентрации агарозы, которая позволит неограниченному росту эмбрионов зебры, и в то же время держать эмбрионы в совершенно фиксированном положении для конфокальной визуализации. Поскольку оптимальная концентрация агарозы очень узкая, это значение очень чувствительно к ошибкам в измерении веса агарозы и объема Е3 при подготовке раствора. Оптимальная концентрация может также зависеть от температуры и стадии эмбриона. Таким образом, оптимальная концентрация должна быть пересмотрена для каждой новой партии раствора агарозы путем повторения тестов различных концентраций.
Другим важным шагом в методе монтажа является добавление второго слоя агарозы. Второй слой удерживает крышку стекла на месте. Его нужно добавлять осторожно в блюдо немного за один раз, чтобы она не вызывала перемещения крышки стекла. Второй слой также служит проницаемым барьером для E3. Без E3 эмбрионы высохнут во время визуализации. Без второго слоя агарозы, крышка стекла и эмбриона начнет плавать.
Ограничение предлагаемого метода монтажа заключается в том, что, хотя он хорошо работает для перевернутых микроскопов, он не работает для вертикально микроскопов. Было предпринято несколько попыток выполнения замедленной визуализации с помощью вертикального микроскопа, заполнив стеклянное нижнее блюдо E3, запечатав ее парафильмом и перевернув с ног на голову. Однако, часто это приводило к в что монтируя обрушился halfway через изображение. Это могло быть вызвано повышенным теплом в образце после длительного воздействия лазерного света, что приводит к таянию затвердевшего слоя агарозы.
К концу замедленной микроскопии эмбрионы начали проявлять перикардиальный отек. Варьируямежду различными экспериментами, отек наблюдался между 35 и 50 часами изображения. Было ли это вызвано иммобилизацией эмбриона, или эффект оменазии, в настоящее время не известно. Трикан, как известно, подавляют сокращение скелетных и сердечных мышц. Следовательно, tricaine влияет на частоту сердечных приступов у взрослых рыб14 и эмбрионов15. Другие исследования также сообщили, что лечение трикаина вызывает перикардиальный отек в эмбрионах зебры2,16. В этой статье концентрация трикаина (0,016-0,020%) был использован, который обычно используется в исследованиях зебры; тем не менее, перикардиальный отек произошел к концу нашего периода визуализации. Перикардиальный отек представляет собой основное ограничение для обеспечения визуализации эмбрионов в течение еще более длительных периодов времени. Потенциальные способы уменьшить эту сердечную токсичность сочетают в себе две различные анестетики, такие как трикаин с евгенилом, или с помощью инъекции з-бунгаротоксин мРНК для анестезии16; благотворное воздействие комбинаторных или альтернативных анестезирующих соединений необходимо дополнительно изучить для длительного замедленного изображения развития зебры.
В заключение, описанный метод монтажа является быстрым, простым, рентабельным и работает на любом перевернутом микроскопе. Регулярные стеклянные блюда донного и низкоплавленного агарозы могут быть использованы, и никаких специальных форм, оборудования или приборов не требуется. Слоистый метод монтажа позволяет расти эмбриона и в то же время держать эмбрионы в фиксированном положении. С помощью расширенной замедленной визуализации всего организма можно получить новые знания о развитии тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Альберта Пана и Арндта Сиакмана за дары трансгенной рыбы. Мы благодарим Коити Каваками в Национальном институте генетики, Национальный проект биоресурсов от Министерства образования, культуры, спорта, науки и техники Японии за подарок трансгенных зебры HGn39b. Мы также благодарим Фатиму Мерчант и Кэтлин Гаевски за помощь в конфокальной микроскопии и Трейси Териао за фотографии.
Эта работа была поддержана грантами Национального института экологических наук здоровья Национальных институтов здравоохранения (грант номер P30ES023512 и номер контракта HHSN273201501500010C). SU была поддержана стипендией от программы биологии рака Кека вычислительной (Консорциум побережья Мексиканского залива CPRIT грант RP140113) и Хью Роя и Фонда Лили. J-A G была поддержана Фондом Роберта А. Уэлча (E-0004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22x22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
References
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nature Communications. 4, 2207 (2013).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing. BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).
- Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish. Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).
- Hirsinger, E., Steventon, B. A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development. Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).
- McCollum, C. W., et al. Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish. Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).
- Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
- Nagayoshi, S., et al. Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like. Development. 135 (1), 159-169 (2008).
- Huang, W. C., et al. Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish. Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).
- Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).
