Summary
Dit artikel beschrijft een methode voor het monteren van fragiele zebravis embryo's voor uitgebreide time-lapse confocale microscopie. Deze voordelige methode is eenvoudig uit te voeren met behulp van regelmatige glazen bodem microscopie gerechten voorbeeld vorming op elke omgekeerde Microscoop. De montage wordt uitgevoerd in lagen van agarose bij verschillende concentraties.
Abstract
De dynamiek van de ontwikkeling kan gevolgd worden door een confocale time-lapse microscopie van levende transgene zebravis embryo's die fluorescentie uitdrukken in specifieke weefsels of cellen. Een probleem bij het opstellen van een hele embryo ontwikkeling is dat zebravis embryo's aanzienlijk groeien. Bij montage zoals regelmatig gedaan bij 0,3-1% laag smelt agarose, legt de agarose groei beperking op, wat leidt tot verstoringen in het zachte embryo lichaam. Maar om confocale timelapse-microscopie uit te voeren, moet het embryo worden geïmmobiliseerd. Dit artikel beschrijft een gelaagde montagemethode voor zebravis-embryo's die de beweeglijkheid van de embryo's beperken en tegelijkertijd de onbeperkte groei mogelijk maken. De montage wordt uitgevoerd in lagen van agarose bij verschillende concentraties. Om te demonstreren de bruikbaarheid van deze methode, hele embryo vasculaire, neuronale en spierontwikkeling werd afgebeeld in transgene vis voor 55 opeenvolgende uren. Deze montagemethode kan worden gebruikt voor eenvoudige, laaggeprijsde beeldvorming van hele zebravis embryo's met omgekeerde microscopen zonder eisen van mallen of speciale apparatuur.
Introduction
De zebravis is al lang een modelorganisme voor ontwikkelingsbiologie, en microscopie is de belangrijkste methode om embryonale ontwikkeling te visualiseren. De voordelen van het gebruik van zebravis embryo's voor ontwikkelingsstudies omvatten kleine afmetingen, optische helderheid, snelle ontwikkeling en hoge vruchtbaarheid van de volwassen vis. De generatie van transgene zebravis lijnen die fluorescentie in bepaalde weefsels of cellen uitdrukken, heeft een directe visualisatie van weefsel ontwikkeling mogelijk op een manier die niet met grotere gewervelde dieren kan worden veroorzaakt. In combinatie met timelapse-microscopie kunnen Details en dynamiek van de weefsel ontwikkeling gemakkelijk worden bestudeerd.
Een probleem met de ontwikkeling van de zebravis is dat de embryo's in de lengte aanzienlijk toenemen; het embryo breidt zijn lengte vier maal uit binnen de eerste 3 dagen van leven1. Ook is het lichaam van het vroege embryo zacht en wordt het gemakkelijk vervormd als de groei beperkt is. Maar om confocale microscopie uit te voeren, moet het embryo worden geïmmobiliseerd. Om embryo's in een vaste positie te houden voor confocale timelapse-beeldvorming, worden ze regelmatig verdoiliseerd en gemonteerd in 0,3-1% laag smelt agarose. Dit heeft het voordeel dat er gedurende een bepaalde periode enige groei mogelijk is tijdens de beeldvorming, terwijl de bewegingen van het embryo worden beperkt. Delen van het embryo kunnen zo efficiënt als deze worden afgebeeld. Bij het gebruik van deze methode voor de beeldvorming van het hele embryo gedurende langere perioden worden echter verstoringen waargenomen vanwege de beperkte groei die door de agarose wordt veroorzaakt. Er zijn dus andere montage methodes nodig. Kaufmann en collega's hebben een alternatieve montage van zebravis-embryo's voor lichte blad microscopie beschreven, zoals selectieve vlak verlichtings microscopie (spim), door de embryo's te monteren in buisjes met gefluoreerde ethyleen propyleen (FEP) die lage concentraties agarose of Hydroxypropyl methylcellulose2bevatten. Deze techniek produceert in de loop van de tijd een uitmuntende visualisatie van embryogenese. Schmid et al. Beschrijf de montage van maximaal zes embryo's in agarose in VBO-buisjes voor lichte microscopie3 die verschillende embryo's visualiseren in één beeldvormings sessie. Mallen zijn gebruikt om embryo arrays te maken voor een efficiënte montage van grotere aantallen embryo's4. Masselkink et al. hebben 3D-gedrukte kunststof mallen gebouwd die kunnen worden gebruikt om silicium te maken dat zebravis-embryo's in verschillende stadia kunnen worden geplaatst, waardoor montage in een constante positie voorbeeld vorming mogelijk wordt, inclusief confocale Imaging5. 3D-printen is ook gebruikt om mallen te maken voor een consistente positionering van zebravis embryo's in 96-well format6. Sommige mallen zijn aangepast voor bepaalde stadia en kunnen geen onbeperkte groei voor lange perioden toestaan, terwijl andere mallen flexibeler zijn. Onlangs publiceerde Weijts et al. het ontwerp en de fabricage van een vier-waterput voor Live beeldvorming van zebravis embryo's7. In dit gerecht worden de staart en romp van verdoven vissen embryo's handmatig geplaatst onder een duidelijk silicone dak bevestigd net boven een afdekglas om een zak te vormen. Het embryo wordt vervolgens in deze positie vastgesteld door toevoeging van 0,4% agarose. Deze montage zorgt voor de beeldvorming van het ongeveer 2 mm lange posterieure deel (romp en staart) van het embryo, en aangezien tot 12 embryo's per put kunnen worden gemonteerd, maakt de methode het mogelijk om meerdere monsters te maken. Op dezelfde manier presenteerden Hirsinger en Steventon onlangs een methode waarbij het hoofd van de vis wordt gemonteerd in agarose, terwijl de staart vrij kan groeien, en deze methode vergemakkelijkt ook de beeldvorming van het stam-en staart gebied van het embryo8.
Dit artikel beschrijft een gelaagde montagemethode voor zebravis embryo's die de bewegingen van de embryo's beperken en tegelijkertijd onbeperkte groei mogelijk maken. De voordelen van deze montagemethode zijn dat het een goedkope, snelle en eenvoudige methode is om embryo's van verschillende stadia te monteren voorbeeld vorming met behulp van een omgekeerde Microscoop. De montage maakt lange-termijn beeldvorming van het hele lichaam (hoofd, romp en staart) tijdens de ontwikkeling van de embryo. Om de bruikbaarheid van deze methode te demonstreren, werd whole embryo vasculaire, neuronale en spierontwikkeling afgebeeld in transgene vis. Twee embryo's per sessie, met twee golflengten in 3D, werden door time-lapse microscopie voor 55 opeenvolgende uren afgebeeld om films van weefsel ontwikkeling te renderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het hier gepresenteerde dier werk werd goedgekeurd door de institutionele Dierenzorg-en gebruiks comités (IACUCs) van de Universiteit van Houston en de Universiteit van Indiana.
1. vishouderij
Opmerking: voor werken met gewervelde modellen is een door IACUC goedgekeurd protocol vereist. Het moet worden uitgevoerd volgens de relevante nationale en internationale richtlijnen.
- Volwassen zebravis onderhouden zoals beschreven in eerder gepubliceerde literatuur9.
- In de namiddag, plaats volwassen zebravis in kweek tanks. Fok mannetjes tot vrouwtjes met een ratio van 1:2.
2. voorbereiding van de oplossingen
- Maak een stamoplossing van 1% smelt agarose in embryonale media (E3:5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mm MgSO4, aangepast aan pH 7,0). Aliquot de stockoplossing in buizen van 1,5 mL en bewaar ze op 4 °C.
- Maak een stamoplossing van 4% (w/v) tricaïne (MS-222) in gedistilleerd water. Bewaren bij 4 °C in een donkere fles.
Let op: tricaïne is giftig en moet worden gewogen en opgelost in een rook afzuigkap. - Maak een stamoplossing van 20 mM N-fenylthioureum (PTU) in gedistilleerd water. Bewaren bij-20 °C.
3. bereiding van de embryo's
- Oogst na de paring embryo's in de E3 in een Petri schaaltje en inbroed ze gedurende ongeveer 28 uur vóór de montage op 26,5 °C.
NB: dit vertraagt de ontwikkeling van de embryo's, zodat de embryo's aan het begin van de beeldvorming ongeveer 30 Somiet worden. - Anesthetiseer embryo's in 0.016-0.020% tricaïne in E3. Om pigmentatie te remmen, voeg PTU toe aan een concentratie van 200 μM.
- Dechorionate de embryo's met behulp van een tang onder een ontleed Microscoop. Gebruik twee Tang, grip en trek het chorion voorzichtig uit elkaar om het embryo vrij te geven.
4. montage in agarose
Opmerking: de ontwikkelde montagemethode vereist twee verschillende concentraties van laag smelt agarose in E3 met 0,02% tricaïne en PTU indien nodig. De eerste agarose oplossing bevat een optimale concentratie van agarose waarbij de vervorming en beweeglijkheid minimaal zijn. De optimalisatie wordt beschreven in stap 5 hieronder.
- Verwarm de agarose-oplossingen voor de twee lagen (concentratie gedefinieerd in stap 5 hieronder en 1%) tot 65 °C. Laat de agarose afkoelen tot ongeveer 30 °C vlak voor de montage, zodat het embryo niet door de hitte wordt aangetast. Voor montage, gebruik 35 mm glasbodem gerechten met een No. 0 cover glasbodem. Het afdekglas dat op de bodem van de schotel is bevestigd, creëert een oppervlak van 10 mm (ca. 1,2 mm diep), waarin het embryo moet worden geplaatst.
Opmerking: in dit geval was de concentratie met de minste beweeglijkheid en vervormingen tussen 0,025 en 0,040% agarose. - Plaats met een glazen pipet of micro pipet voorzichtig een gedechorioneerd embryo met een van de laterale zijden naar de bodem van de schaal. Als u een micropipet gebruikt, snijd dan het buitenste deel van de punt om de opening naar het embryo te verhogen (Figuur 1a). Verwijder de resterende E3 voorzichtig met een micro pipet.
- Voeg de eerste agarose-oplossing toe aan de kleine put die is gemaakt door het afdekglas dat aan de onderkant van de schaal is bevestigd om het embryo te bedekken (laag 1) (Figuur 1B). Zorg ervoor dat de agarose de kleine put bedekt, maar niet overloopt.
- Bedek de kleine put met een afdekglas (22 mm x 22 mm) (Figuur 1C) om een smalle, met het embryo tussen de twee afdek glazen gevulde ruimte te creëren.
- Plaats een laag van 1% agarose-oplossing bovenop het afdekglas over de bodem van de schaal (laag 2) (Figuur 1D). Omdat deze laag stolt, houdt het afdekglas op zijn plaats.
- Vul het resterende gedeelte van de schaal met E3 met 0,02% tricaïne om het systeem gehydrateerd te houden (Layer 3) (Figuur 1E).
Opmerking: in deze opstelling beschermen de afdekglas en 1% agarose de onderlaag tegen verwaterd raken.
5. optimalisatie van de agarose-oplossing voor Layer 1
- Voor het identificeren van de optimale concentratie van agarose voor Layer 1, gebruikt u een Multiscale grid zoeken benadering. Mount embryo's in toenemende concentraties van agarose variërend van 0,01% tot 1% gevolgd door timelapse-beeldvorming van embryonale groei beperking en beweeglijkheid in het gezichtsveld. Identificeer de concentraties waar zowel de vervorming als de beweeglijkheid minimaal zijn.
- Om de concentratie van agarose verder te optimaliseren, Monteer de embryo's met behulp van een fijnere reeks concentraties van agarose (bv. tussen 0,025 en 0,040% agarose) afhankelijk van de concentratie die het beste is gevonden in stap 5,1 (bijv. 0,025%, 0,028%, 0,031%, enz.).
NB: in ons laboratorium was de optimale agarose concentratie rond de 0,03%.
6. timelapse-beeldvorming
Opmerking: deze montagemethode werkt voor elke omgekeerde Microscoop met timelapse-functionaliteit voor fluorescentie en heldere veld beeldvorming.
- Voer timelapse-beeldvorming uit voor het hele embryo of delen daarvan tot 55 uur. Voorbeeld vorming van verschillende embryo's, gebruik een stage adaptor die verschillende gerechten bevat met één embryo gemonteerd per gerecht. Draai de gerechten één voor één zodat de embryo's ongeveer horizontaal gepositioneerd zijn, zoals bepaald door het oog. Voor optimale embryonale groei en ontwikkeling gebruikt u een Microscoop fase met een incubator die is ingesteld op 28,5 °C.
- Selecteer een lage vergrotings doelstelling in de Microscoop-software. Onder het oog stuk, lokaliseren en fijn uitlijnen van de embryo's horizontaal door het roteren van de gerechten met behulp van heldere veldverlichting en noteer hun locaties in de software. Maak een bestandsnaam voor het automatisch opslaan van de gegevens.
Opmerking: in dit experiment werden een plan APO λ 4x 0,2 NA Objective en de XY tab in het ND acquisitie venster gebruikt om de locaties van de embryo's te registreren. Gegevens zijn opgeslagen in. ND2-indeling. Het doel werd geselecteerd door op de pictogrammen op het tabblad Ti pad te klikken. - Stel de grootte van het pinhole, de scansnelheid, de afbeeldingsgrootte en de zoom in. Selecteer vervolgens een hogere vergrotings doelstelling voor het vastleggen van de afbeeldingen.
Opmerking: in dit experiment werd een plan-APO 10x 0,45 NA doelstelling gebruikt voor de beeldvorming van hele embryo's, en een super-fluor 20x 0,75 NA doelstelling werd gebruikt voor de grotere vergroting beeldvorming van delen van het embryo. De pinhole werd ingesteld op 1,2 AU (19,2 μm voor de 10x-lens), de scansnelheid werd ingesteld voor een pixel dwelltijd van 2,4 μs en de beeldgrootte was ingesteld op 1024 x 1024 pixels met een scan zoom van één, waardoor een pixelgrootte van 1,24 μm voor de 10x-lens en 0,62 μm voor de 20x lens. - Selecteer de kanalen waarop de fluorescentie moet worden afgebeeld. Pas de instellingen voorbeeld opname één kanaal tegelijk aan. Stel voor elk fluorescentie kanaal de laser stroom en de detector hoogspanning in, zorg ervoor dat u het beste dynamische bereik verzamelt terwijl u de verzadiging vermijdt en de fotobleaching beperkt.
Opmerking: in dit experiment werd GFP afgebeeld met het 488 groene kanaal, (488 nm laser en emissie tussen 500 en 550 nm), en RFP met het 561 rode kanaal (561 nm laser en emissie tussen 570 en 600 nm), en het transmissie beeld werd verzameld met behulp van de 561 nm laser en de uitgezonden licht detector (TD kanaal). - Om het hele embryo met de 10x-doelstelling te kunnen afbeelen, moet u verschillende kijk velden met elkaar overlappen en ze samen met de Microscoop-software in elkaar steken.
Opmerking: als de embryo's tijdens de beeldvorming substantieel zullen toenemen, zorg er dan voor dat er ruimte is in het gezichtsveld voorste en posterieure van het embryo. Gebruik het tabblad Scan grote afbeelding van het ND-verwervings venster en selecteer een patroon van 4 x 1 met 10% overlapping om vier aangrenzende weergavevelden vast te leggen. - Configureer de instellingen voor het vastleggen van de Z-stacks met behulp van de Microscoop software.
Opmerking: omdat het embryo dicht bij de bodem van de glazen schaal is gemonteerd, zal het midden van de bodem verdwijnen naarmate het groeit. Gebruik het tabblad Z van het venster van de ND-acquisitie en selecteer het asymmetrische relatieve bereik. Met deze methode wordt het huidige scherpstel vlak gebruikt als het referentievlak en de rest van de vlakken zijn asymmetrisch verdeeld boven en onder om het hele embryo binnen het Z-stack volume op te nemen, met voldoende ruimte om de groei van het preparaat te beoordelen. In alle experimenten werd het interval ingesteld op 11 μm en het totale bereik tot ongeveer 45-vlakken. - Gebruik een automatische focus om de focus van meerdere embryo's tijdens langdurige timelapse-beeldvorming te behouden. Als er verschillende embryo's worden gebeeld, past u de afzonderlijke offset niveaus voor elk embryo aan om zich op het referentievlakte concentreren.
Opmerking: in dit experiment werd een op laser gebaseerd focus stabilisatiesysteem gebruikt. - Stel de time-lapse-parameters in de Microscoop-software en de afbeelding in voor een duur van 55 uur met intervallen van ongeveer 1 uur. Leg bij elke cyclus twee embryo gegevenssets opeenvolgend vast en sla gegevens automatisch op na elke cyclus.
- Verwerk afbeeldingen met behulp van een on-line of off-line versie van de Microscoop-software. Als er meer dan één embryo is afgebeeld, maakt u voor elk embryo onafhankelijke bestanden door de gegevensset te splitsen op basis van de locatie van Imaging. Gebruik projecties met maximale intensiteit of een soortgelijk hulpmiddel om 3D-tijdgegevens sets om te zetten in 2D-tijdgegevens sets. Maak filmbestanden met de menuoptie Opslaan als en selecteer. AVI als bestandsindeling. Selecteer de optie geen compressie met 200 MS-intervallen voor een afspeelsnelheid van 5 frames/s.
Opmerking: de oorspronkelijke gegevensset van twee embryo's in dit experiment is gesplitst met behulp van de functie locaties splitsen in de software (bestand | Import/export | Meerdere punten splitsen). 3D-tijd sets zijn geconverteerd naar 2D-tijdgegevens sets met behulp van de projectie functie maximale intensiteit (afbeelding | ND-verwerking | Creëer een projectie afbeelding met maximale intensiteit in Z).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ontwikkeling van de montagemethode
Het belangrijkste doel van dit werk was het ontwikkelen van een goedkope montagetechniek voor de timelapse-beeldvorming van zebravis ontwikkeling voor langere tijd. De gelaagde montagemethode is ontwikkeld om het fragiele zebravis-embryo lichaam volledig te laten groeien en tegelijkertijd zijn bewegingen te beperken. Als de agarose-concentratie van laag 1 te hoog is, worden de embryo's vervormd en gebogen (Figuur 2). Embryo's geteeld op 0,1% en 0,5% agarose hebben verkorte staarten, vervormde vinnen en gebogen koppen. Integendeel, als de agarose-concentratie te laag is, zullen de embryo's uit het gezichtsveld gaan tijdens de timelapse-microscopie, ook al zijn ze verdoukt, omdat de groeiende staart uit het embryo lichaam zwaait en het zich beweegt. In onze handen varieerde de optimale agarose concentratie tussen 0,028% en 0,034% agarose tussen verschillende partijen agarose. Montage onder 0,025% agarose gaf niet genoeg weerstand voor het embryo om in het gezichtsveld te blijven.
Uitgebreide timelapse-beeldvorming van vasculaire, neuronale en spierontwikkeling
Na het optimaliseren van de hierboven beschreven montagemethode, werden timelapse confocale microscopie beelden vastgelegd over een spanwijdte van 55 h. We hebben Live transgene zebravis afgebeeld die GFP of RFP in verschillende weefsels uitdrukt. Een voordeel van het gebruik van transgene vis met endogene fluorescentie voor timelapse-beeldvorming is dat de fluorescentie moleculen, zoals GFP en RFP, voortdurend in het levende embryo worden geproduceerd, en dus niet gemakkelijk bleekwater te foto. Ten eerste werden embryo's van een kruising van TG (kdr1: EGFP) mitfab692/B69210 en Ubi-zebrabow11 afgebeeld. In deze embryo's wordt RFP uitgedrukt in alle cellen van het embryo, waardoor visualisatie van de algemene embryo structuur mogelijk is. GFP wordt uitgedrukt in de endotheliale cellen van de vasculatuur. Dubbele transgene embryo's werden gedurende 55 uur afgebeeld vanaf ongeveer 30 Somiet stadium om vasculaire ontwikkeling in het hoofd en lichaam te visualiseren (Figuur 3 en aanvullende film S1) met een 10x doelstelling met 0,45 na. Twee embryo's/sessies werden afgebeeld met z-stacks en time-lapse in een lus, zodat na het afbeelden van het eerste embryo bij twee verschillende golflengten de tweede opnieuw werd afgebeeld en vervolgens de eerste. Figuur 3 toont het intersegmental vat (ISV) spruiten, ontwikkeling van subintestinale vaten en hoofd vasculatuur, en caudal ader plexus condensatie samen met romp verlenging. Beeldvorming van het hele embryo met de vasculatuur toont aan dat ISV-ontspruiten tussen somieten begint en dorsaal groeit tot het punt van de neurale buis, waar de isv's een ander pad inslaan en spruiten in een richting naar de volgende anterieure pereoniet grens.
Vervolgens werden embryo's van een kruising van TG (mnx: GFP) mitfab692/b629 en Ubi-zebrabow gedurende 55 uur ongeveer vanaf de 30 pereoniet fase afgebeeld om de ontwikkeling van motor neuron te visualiseren (Figuur 4 en aanvullende film S2). TG (mnx: GFP) was eerst gekruist naar mitfab692/B692 (zowel van Zebrafish International Resource Center aan de Universiteit van Oregon, of) om TG(mnx: GFP) mitfab692/b629te produceren. De motorneuron axonen spruiten uit de ventrale zenuw buis over de somieten naar de ventrale zijde van het embryo. In tegenstelling tot de intersegmentale vaten die tussen de somieten uitspruiten, ontkiemen de axonen over het midden over de met Chevron gevormde somites. Het spruiten begint naar het voorste uiteinde van de neurale buis, in een rechte hoek van de neurale buis, en verspreidt posterior. Door de somite/dooier-interface verandert het spruiten van richting naar voorste en posterieure kiemen. Let op de innervatie van het ontwikkelende hart door de anterieure neurites.
Ook embryo's van een kruising van TG (kdr: enl. memRFP) mitfab692/b692 (kruising van TG (kdr: enl. memrfp en Mitfab692/B692) en TG (mnx: GFP) mitfab692/b692 werden gefotografeerd. In de voormalige embryo's was de rode vasculaire fluorescentie niet zichtbaar tot 36 uur na de bevruchting (HPF), en daarom startten we de beeldvorming op een later tijdstip op 2 DPF. We hebben een deel van de romp afgebeeld, schrapen naar de dooier SAC-extensie, met behulp van een hogere vergroting (20x-doelstelling). Deze film laat zien dat de embryo's nog steeds genoeg lagen voor een goede beeldkwaliteit bij een hogere vergroting. De co-ontwikkeling van de rugontspruiten van motorneuron axonen in relatie tot de positie van de intersegmentale vaten werd opgevolgd (Figuur 5 en aanvullende film S3). In deze films zijn de fijnere details van ventrale axon-kiemen zichtbaar, evenals dorsale axon die uit de neurale buis spruiten tot een punt waar neuronale axonen en intersegmentale schepen samen migreren. De condensatie van de caudale ader plexus wordt ook duidelijk weergegeven. Merk op dat als een neuriet Sprout ontbreekt in de richting van het achterste uiteinde van de staart (in de positie van de 12e neuriet van de rechterkant), de dichtstbijzijnde posterieure neuron strekt zich uit naar het voorste deel van het embryo om het gebied tussen neurites 11 en 13 te bedekken.
Tot slot werd een kruising van HGn39b12,13 en Ubi-zebrabow afgebeeld. HGn39b is een ztrap-lijn met het GFP-inzetstuk in de activator van warmteshock proteïne ATPase homo 1 (AHA1) gen (http://Kawakami.lab.nig.ac.jp/) en het drukt GFP uit in de spieren van de somieten (Figuur 6 en aanvullende film S4). Naarmate somietgetallen toenemen, strekken de somieten zich ook uit in lengte en breedte. Deze film toont ook de hart ontwikkeling in rode fluorescentie van de vislijn Ubi-zebrabow .
Figuur 1: beschrijving van de montagemethode. A) Voeg het embryo van de zebravis toe aan de kleine put die door de glazen bodem in de schaal van 35 mm wordt gecreëerd. B) Voeg agarose-laag 1 toe aan de kleine put om het embryo te bedekken. (C) plaats een afdekglas voorzichtig over de kleine put. (D) Voeg agarose Layer 2 toe aan de hele bodem van de 35 mm schaal. (E) Voeg E3 toe aan het gerecht. F) Schematische tekening van een dwarsdoorsnede van de montage opstelling. G) Microscoop beeld (5x objectief) van het embryo van de zebravis in de uiteindelijke montage. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: embryonale groei beperking en ontwikkelingsachterstand in verschillende concentraties van agarose. Embryo's werden in verschillende agarose concentraties gemonteerd en hun grootte en ontwikkeling werden op 48 HPF afgebeeld. Beelden die zijn vastgelegd met een microscoop met een digitale Microscoop-kleurencamera (2.5 x Objective) en de bijbehorende Microscoop software. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: visualisatie van de ontwikkeling van de vasculatuur. Kruis van TG (kdr1: EGFP) mitfab692/b692 en Ubi-zebrabow afbeelding gemaakt van ongeveer 30 pereoniet stage voor 55 h op een confocale Microscoop. Vasculatuur in het groen en alle andere cellen in het rood. Schaalbalk 500 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: visualisatie van de ontwikkeling van neuronen en neuriet spruiten. Kruis van TG (mnx: GFP) mitfab692/b629 en Ubi-zebrabow afbeelding gemaakt van ongeveer 30 pereoniet stage voor 55 h op een confocale Microscoop. Motorneuronen in het groen, alle andere cellen in het rood. Schaalbalk 500 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: visualisatie van de co-ontwikkeling van neuronen en vasculatuur. Kruis van TG (kdr: enl. memrfp) mitfab692/b692 en TG (mnx: GFP) mitfab692/b692 afbeelding gemaakt voor 55 uur vanaf ongeveer 2 DPF op een confocale Microscoop. Vasculatuur in het rood, motorneuronen in het groen. Schaalbalk 500 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: visualisatie van spier GFP expressie in somites. Kruising van HGn39b en Ubi-zebrabow werden afgebeeld op een confocale Microscoop voor 55 h van ongeveer 30 pereoniet stage. Spier in het groen, alle andere cellen in het rood. Schaalbalk 500 μm Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende film S1: film van een embryo van een kruis van TG (KDR1: EGFP) mitfab692/B692 en Ubi-zebrabow afgebeeld vanaf ongeveer 30 Somiet podium voor 55 h op een confocale Microscoop met een 10x doelstelling. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende film S2: film van een embryo van een kruising van TG (mnx: GFP) mitfab692/b629 en Ubi-zebrabow afgebeeld vanaf ongeveer 30 pereoniet stage voor 55 h op een confocale Microscoop met behulp van een 10x doelstelling. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende film S3: film van een embryo van een kruis van TG (kdr: enl. memRFP) mitfab692/b692 en TG (mnx: GFP) mitfab692/b692 afgebeeld vanaf ongeveer 2 DPF voor 55 h op een confocale Microscoop met een 20x-doelstelling. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende film S4: film van een embryo van een kruis van HGn39b en Ubi-zebrabow afgebeeld vanaf ongeveer 30 Somiet podium voor 55 h op een confocale Microscoop met een 10x doelstelling. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier wordt een montagemethode beschreven voor de uitgebreide time-lapse confocale microscopie van hele zebravis embryo's. De meest kritieke stap voor de montagemethode is het bepalen van de optimale concentratie van agarose die de embryo groei met onbeperkte zebravis mogelijk maakt en tegelijkertijd de embryo's in een volledig vaste positie voor confocale beeldvorming houdt. Omdat de optimale concentratie van agarose zeer smal is, is deze waarde zeer gevoelig voor de fouten in de meting van het gewicht van de agarose en het volume van de E3 tijdens de bereiding van de oplossing. De optimale concentratie kan ook afhangen van de temperatuur en het stadium van het embryo. De optimale concentratie zal dus opnieuw moeten worden gedefinieerd voor elke nieuwe partij agarose-oplossing door herhaling van tests van verschillende concentraties.
Een andere kritieke stap in de montagemethode is de toevoeging van de tweede laag agarose. De tweede laag houdt het afdekglas op zijn plaats. Het moet voorzichtig worden toegevoegd aan het gerecht een beetje op een moment, zodat het niet het afdekglas te verplaatsen. De tweede laag fungeert ook als een permeabele barrière voor E3. Zonder E3 zullen de embryo's tijdens de beeldvorming uitdrogen. Zonder de tweede laag van agarose zal het afdekglas en het embryo beginnen te zweven.
Een beperking van de voorgestelde montagemethode is dat, hoewel het goed werkt voor omgekeerde microscopen, het niet werkt voor staande microscopen. Er werden verschillende pogingen gedaan om timelapse-beeldvorming uit te voeren met behulp van een rechtopstaande Microscoop, door het glasbodem gerecht met E3 te vullen, het te afdichten met Parafilm en het ondersteboven te draaien. Dit resulteerde er echter vaak in dat de montage halverwege de beeldvorming instortte. Dit kan zijn veroorzaakt door verhoogde warmte in het monster na de lange blootstelling aan laserlicht, waardoor de gestijde agarose laag smelt.
Tegen het einde van de time-lapse microscopie begonnen de embryo's pericardiale oedeem te vertonen. Variërend tussen verschillende experimenten, oedeem werd waargenomen tussen 35 en 50 uren van beeldvorming. Of dit werd veroorzaakt door de immobilisatie van embryo's, of een effect van anesthetica, is momenteel niet bekend. Het is bekend dat tricaïne de contractie van skelet-en hart spieren onderdrukt. Daarom beïnvloedt tricaïne de hartslag bij volwassen vissen14 en embryo's15. Andere studies hebben ook gemeld dat tricaïne behandeling veroorzaakt pericardiale oedeem in zebravis embryo's2,16. In dit artikel, een concentratie van tricaïne (0.016-0.020%) werd gebruikt dat vaak wordt gebruikt in zebravis onderzoek; toch gebeurde het pericardiale oedeem aan het einde van onze beeldvormings periode. Het pericardiale oedeem vormde een belangrijke beperking voor het mogelijk maken van beeldvorming van de embryo's voor nog langere tijd. Mogelijke manieren om deze cardiale toxiciteit te verminderen zijn het combineren van twee verschillende anesthetica, zoals tricaïne met eugenol, of met behulp van α-bungarotoxine mRNA injectie voor anesthetica16; de gunstige effecten van combinatorische of alternatieve anesthetiserende verbindingen moeten verder worden onderzocht voor uitgebreide timelapse-beeldvorming van zebravis ontwikkeling.
Kortom, de beschreven montagemethode is snel, gemakkelijk, kosteneffectief en werkt op elke omgekeerde Microscoop. Er kunnen regelmatig glazen bodem gerechten en lage smelt agarose worden gebruikt, en er zijn geen speciale mallen, apparatuur of instrumentatie nodig. De gelaagde montagemethode maakt embryo groei mogelijk en houdt tegelijkertijd de embryo's in een vaste positie. Door het gebruik van uitgebreide timelapse-beeldvorming van het hele organisme kan nieuwe kennis van weefsel ontwikkeling worden verkregen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken Albert pan en Arndt Sieakmann voor de geschenken van transgene vis. We danken Koichi Kawakami aan het National Institute of Genetics, het nationale Bioresource project van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie van Japan voor de gave van de transgene zebravis HGn39b. We bedanken ook Fatima Merchant en Kathleen Gajewski voor hulp bij confocale microscopie en Tracey Theriault voor foto's.
Dit werk werd gesteund door subsidies van het National Institute of Environmental Health Sciences van de National Institutes of Health (subsidie nummer P30ES023512 en contractnummer HHSN273201500010C). SU werd gesteund door een Fellowship van het Keck Computational Cancer biologie Program (Gulf Coast consortia CPRIT Grant RP140113) en Hugh Roy en Lillie Endowment Fund. J-Å G werd gesteund door de Robert A. Welch Foundation (E-0004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22x22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
References
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nature Communications. 4, 2207 (2013).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing. BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).
- Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish. Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).
- Hirsinger, E., Steventon, B. A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development. Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).
- McCollum, C. W., et al. Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish. Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).
- Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
- Nagayoshi, S., et al. Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like. Development. 135 (1), 159-169 (2008).
- Huang, W. C., et al. Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish. Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).
- Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).
