Summary
Denne artikel beskriver en metode til at montere skrøbelige Zebra embryoner til forlænget tidsforskudt Konfokal mikroskopi. Denne lavpris metode er nem at udføre ved hjælp af almindelige glas bunds mikroskopi retter til billeddannelse på ethvert inverteret mikroskop. Monteringen udføres i lag af agopstået ved forskellige koncentrationer.
Abstract
Dynamikken i udviklingen kan følges op af Konfokal tidsforskudt mikroskopi af levende transgene Zebra-embryoner, der udtrykker fluorescens i bestemte væv eller celler. Et problem med billeddannelse hele embryo udvikling er, at Zebra embryoner vokse betydeligt i længden. Når den er monteret som regelmæssigt udført i 0,3-1% lavsmelte agopstået, den agopstået pålægger vækst restriktion, hvilket fører til forvridninger i den bløde embryo-krop. Men for at udføre Konfokal tidsforskudt mikroskopi skal embryonet være immobiliseret. Denne artikel beskriver en lagdelt monteringsmetode for Zebra-embryoner, der begrænser motilitet af embryonerne, samtidig med at der tillades ubegrænset vækst. Monteringen udføres i lag af agopstået ved forskellige koncentrationer. For at demonstrere anvendeligheden af denne metode, hele embryo vaskulære, neuronal og muskel udvikling blev afbildet i transgene fisk for 55 sammenhængende timer. Denne monteringsmetode kan bruges til nem, billig billeddannelse af hele Zebra-embryoner ved hjælp af inverterede mikroskoper uden behov for forme eller særligt udstyr.
Introduction
Zebra har længe været en model organisme for udviklingsmæssige biologi, og mikroskopi er den vigtigste metode til at visualisere embryonale udvikling. Fordelene ved at bruge Zebra embryoner til udviklingsstudier omfatter lille størrelse, optisk klarhed, hurtig udvikling, og høj afføring af voksne fisk. Generering af transgene Zebra linjer, der udtrykker fluorescens i visse væv eller celler, har givet mulighed for en direkte visualisering af vævs udvikling på måder, der ikke er muligt med større hvirveldyr. I kombination med tidsforskudt mikroskopi kan detaljer og dynamik i vævs udviklingen let undersøgt.
Et problem med billeddannelse Zebra udvikling er, at embryonerne vokser betydeligt i længden; embryonet udvider sin længde fire gange inden for de første 3 dage af livet1. Også, kroppen af det tidlige embryo er blødt, og let bliver forvrænget, hvis væksten er begrænset. For at udføre Konfokal mikroskopi skal embryonet dog være immobiliseret. For at holde embryoner i en fast position for konfokale time-lapse Imaging, er de regelmæssigt bedøvet og monteret i 0,3-1% lavsmelte agopstået. Det har den fordel, at det giver mulighed for en vis vækst under billeddannelse i en vis periode, samtidig med at embryoens bevægelser begrænses. Dele af embryonet kan effektivt blive afbildet som dette. Men ved anvendelse af denne metode til billeddannelse af hele embryonet i længere perioder, er forvridninger observeret på grund af begrænset vækst forårsaget af aghas. Således er andre monteringsmetoder påkrævet. Kaufmann og kollegerne har beskrevet en alternativ montering af Zebra-embryoner til mikroskopi af lysplader, såsom mikroskopi med selektiv flybelysning (spim), ved at montere embryonerne i de fluorerede ethylenpropylen (FEP)-rør, der indeholder lave koncentrationer af agrose eller methylcellulose2. Denne teknik giver en fremragende visualisering af embryogenese over tid. Schmid et al. Beskriv montering af op til seks embryoner i agopstået i FEB rør til lysplade mikroskopi3 giver visualisering af flere embryoner i en Imaging session. Forme er blevet brugt til at skabe embryon arrays til effektiv montering af større antal embryoner4. Masselkink et al. har konstrueret 3D trykte plastik forme, der kan bruges til at lave silicium kaster, at Zebra embryoner på forskellige stadier kan placeres i, hvilket muliggør montering i en konstant position til billeddannelse, herunder konfokale Imaging5. 3D-print er også blevet brugt til at lave forme til konsekvent positionering af Zebra embryoner i 96-Well format6. Nogle forme er tilpasset til visse stadier og kan ikke tillade ubegrænset vækst i lange perioder, mens andre forme er mere fleksible. For nylig udgav weijts et al. design og fabrikation af en fire-brønd skål til levende billeddannelse af Zebra embryoner7. I denne skål, halen og stammen af bedøvet fiskeembryoner er placeret manuelt under et klart silikone tag vedhæftet lige over et cover glas til at danne en lomme. Embryonet fastsættes derefter i denne position ved tilsætning af 0,4% agopstået. Denne montering giver mulighed for billeddannelse af den omkring 2 mm lange posterior del (krop og hale) af embryonet, og som op til 12 embryoner kan monteres pr brønd, metoden giver mulighed for billeddannelse af flere prøver. På samme måde har Hirsinger og Steventon for nylig præsenteret en metode, hvor lederen af fisken er monteret i agopstået, mens halen kan frit vokse, og denne metode også effektivt letter billeddannelse af stammen og hale regionen af embryonet8.
I denne artikel beskrives en lagdelt monteringsmetode for Zebra-embryoner, der begrænser embryonerne bevægelser og samtidig giver mulighed for ubegrænset vækst. Fordelene ved denne monteringsmetode er, at det er en billig, hurtig og nem metode til at montere embryoner i forskellige stadier til billeddannelse ved hjælp af et inverteret mikroskop. Monteringen tillader langtids billeder af hele kroppen (hoved, bagagerum og hale) under embryo udvikling. For at fremvise anvendeligheden af denne metode, hele embryo vaskulære, neuronal og muskel udvikling blev afbildet i transgene fisk. To embryoner pr. session, på to bølgelængder i 3D blev afbildet af time-lapse mikroskopi i 55 sammenhængende timer til at gengive film af vævs udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det dyre arbejde, der præsenteres her, blev godkendt af de institutionelle dyrepleje-og Brugsudvalg (IACUCs) på universitetet i Houston og Indiana University.
1. fiskeopdræt
Bemærk: arbejde med hvirveldyr modeller kræver en IACUC godkendt protokol. Den bør gennemføres i overensstemmelse med relevante nationale og internationale retningslinjer.
- Vedligehold voksen Zebra som beskrevet i tidligere publiceret litteratur9.
- Om eftermiddagen, Placer voksne Zebra i avls tanke. Race mænd til kvinder i et forhold på 1:2.
2. forberedelse af løsninger
- Lav en stamopløsning på 1% lavsmelte agopstået i embryonale medier (E3:5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mm mgso4, justeret til pH 7,0). Alikvot stamopløsningen til 1,5 mL rør og opbevar dem ved 4 °C.
- Lav en stamopløsning på 4% (w/v) Tricain (MS-222) i destilleret vand. Opbevares ved 4 °C i en mørk flaske.
Forsigtig: Tricain er giftigt og bør vejes og opløses i en røg hætte. - Lav en stamopløsning på 20 mM N-phenylthiourea (PTU) i destilleret vand. Opbevares ved-20 °C.
3. fremstilling af embryoner
- Efter parring, høst embryoner i E3 i en Petri skål og Inkuber dem ved 26,5 °C i ca 28 h før montering.
Bemærk: Dette bremser udviklingen af embryonerne, således at embryonerne er omtrent på 30 chakpost Stadium i begyndelsen af billeddannelse. - Bedøve embryoner i 0.016-0.020% Tricain i E3. For at hæmme pigmentering tilsættes PTU en koncentration på 200 μM.
- Dechorionerer embryonerne ved hjælp af pincet under et dissekere mikroskop. Ved hjælp af to pincet, greb og forsigtigt trække chorion fra hinanden for at frigive embryonet.
4. montering i agopstået
Bemærk: den udviklede monteringsmetode kræver to forskellige koncentrationer af lavsmelte agopstået i E3 med 0,02% Tricain og PTU efter behov. Den første agrose løsning indeholder en optimal koncentration af agopstod, hvor forvrængning og motilitet er på et minimum. Optimeringen er beskrevet i trin 5 nedenfor.
- Opvarm de agerede opløsninger for de to lag (koncentration defineret i trin 5 nedenfor og 1%) til 65 °C. Lad agrose køle ned til ca. 30 °C lige før montering, så embryonet ikke beskadiges af varmen. Til montering, brug 35 mm glasbund retter med en no. 0 Cover glasbund. Det dækglas, der er fastgjort til bunden af skålen, skaber en 10 mm lav (ca. 1,2 mm dyb) brønd, hvor fosteret skal placeres.
Bemærk: i dette tilfælde var koncentrationen med den mindste motilitet og fordrejninger mellem 0,025 og 0,040% agopstået. - Placer forsigtigt et dechorioneret embryon med en af dets laterale sider mod bunden af skålen med en glas pipette eller en mikropipette. Hvis der anvendes en mikropipette, skæres den yderste del af spidsen for at forøge størrelsen af åbningen, så den passer til embryonet (figur 1a). Fjern forsigtigt eventuelle resterende E3 med en mikropipette.
- Tilsæt den første Agan-løsning til den lille brønd skabt af dækglasset, der er fastgjort til bunden af skålen, for at dække embryonet (lag 1) (figur 1B). Sørg for, at Agan dækker de små godt, men vil ikke overløb det.
- Dæk den lille brønd med et dækglas (22 mm x 22 mm) (figur 1C) for at skabe et snævert, fyldt rum med embryonet mellem de to cover briller.
- Anbring et lag på 1% agopstået opløsning oven på dækglasset over hele skålen (lag 2) (figur 1D). Da dette lag størkner, det holder dækslet glas på plads.
- Fyld den resterende del af skålen med E3, der indeholder 0,02% Tricain, for at holde systemet hydreret (lag 3) (figur 1E).
Bemærk: i dette setup, dækslet glas og 1% agopstået beskytte det nederste lag fra at blive fortyndet.
5. optimering af agopstået-løsning til Layer 1
- For at identificere den optimale koncentration af agopstået for Layer 1, brug en multi skala gitter søgning tilgang. Embryoer i stigende koncentrationer af agopstået spænder fra 0,01% til 1% efterfulgt af tidsforskudt billeddannelse af embryo vækst begrænsning og motilitet i synsfeltet. Identificere de koncentrationer, hvor både forvrængning og motilitet er på et minimum.
- For at optimere koncentrationen af agopstået yderligere, montere embryonerne ved hjælp af en finere række koncentrationer af agopstået (f. eks mellem 0,025 og 0,040% agopstået) afhængigt af den koncentration, der findes at være bedst i trin 5,1 (f. eks., 0,025%, 0,028%, 0,031%, etc.).
Bemærk: i vores laboratorium var den optimale agrose koncentration omkring 0,03%.
6. tidsforskudt billeddannelse
Bemærk: denne monteringsmetode virker for ethvert inverteret mikroskop med tidsforskudt funktionalitet for fluorescens og lyse feltbilleder.
- Udfør tidsforskudt billeddannelse for hele embryonet eller dele af det i op til 55 h. Til billeddannelse af flere embryoner skal du bruge en Stage adapter, der indeholder flere retter med ét embryon monteret pr. skål. Drej skålene en efter en, så embryonerne er omtrent vandret placeret som bestemt af øjet. For optimal embryo vækst og udvikling skal du bruge et mikroskop stadie med en inkubator indstillet til 28,5 °C.
- Vælg en målsætning med lav forstørrelse i mikroskop softwaren. Under øjet, finde og fint justere embryonerne horisontalt ved at rotere retterne ved hjælp af lyse felt belysning og registrere deres placeringer i softwaren. Opret et filnavn til automatisk lagring af dataene.
Bemærk: i dette eksperiment blev der anvendt en plan for 4X 0,2 NA-mål og XY -fanen i vinduet nd-anskaffelse til registrering af embryonerne placeringer. Data blev gemt i. ND2 format. Målet blev valgt ved at klikke på ikonerne på fanen ti pad . - Indstil størrelsen på pinhullets størrelse, scanningshastigheden, billedstørrelsen og zoom. Vælg derefter en højere forstørrelses målsætning til hentning af billederne.
Bemærk: i dette eksperiment blev en plan-APO 10x 0,45 NA-målsætning anvendt til billeddannelse af hele embryoner, og en super-fluor 20x 0,75 NA-målsætning blev anvendt til den højere forstørrelse af embryoets dele. Pinhole blev indstillet til 1,2 AU (19,2 μm for 10x-objektivet), scanningshastigheden blev indstillet for en pixel-opholdstid på 2,4 μs, og billedstørrelsen blev indstillet til 1024 x 1024 pixels med en scannings zoom på en, hvilket giver en pixelstørrelse på 1,24 μm for 10x-objektivet og 0,62 μm til 20x linsen. - Vælg kanalerne for den fluorescens, der skal imældes. Juster indstillingerne for billedoptagelse én kanal ad gangen. For hver fluorescens kanal justere laser strøm og detektor højspænding, så sørg for at indsamle det bedste dynamikområde muligt og samtidig undgå mætning og begrænse foto blegning.
Bemærk: i dette eksperiment blev gfp afbildet med den grønne 488 -kanal (488 nm-laser og emission mellem 500 og 550 nm) og RFP med den 561 røde kanal (561 nm-laser og emission mellem 570 og 600 nm), og transmissions billedet blev indsamlet ved hjælp af 561 nm-laseren og den transmitteredelysdetektor (TD - kanal). - At billede hele embryonet med 10x mål, billede flere synsfelter med overlap og sy dem sammen ved hjælp af mikroskop software.
Bemærk: da embryonerne vil vokse betydeligt i størrelse under billeddannelse, skal du sørge for, at der er plads i synsfeltet forreste og posterior til embryonet. Brug fanen Scan stort billede i vinduet nd-anskaffelse , og vælg et 4 x 1-mønster med 10% overlap for at indfange fire tilstødende synsfelter. - Konfigurer indstillingerne for hentning af Z-stakke ved hjælp af mikroskop-softwaren.
Bemærk: fordi embryonet er monteret tæt på bunden af glasset skålen, dens centrum vil bevæge sig væk fra bunden, som den vokser. Brug fanen Z i vinduet nd-anskaffelse , og vælg det asymmetriske relative interval. Med denne metode bruges det aktuelle fokus plan som Reference planet , og resten af flyene er asymmetrisk fordelt over og under for at inkludere hele embryonet i Z-stak volumen, med tilstrækkelig plads til at højde for enhedens vækst. I alle eksperimenter blev intervallet sat til 11 μm og det samlede interval til omkring 45 fly. - For at bevare fokus for flere embryoner under langsigtet tidsforskudt billeddannelse, skal du bruge et automatiseret fokus. Hvis billeddannelse flere embryoner, justere de enkelte offset niveauer for hvert embryo til at fokusere på Reference planet.
Bemærk: i dette eksperiment blev der anvendt et laser baseret fokus stabiliseringssystem. - Indstil time-lapse parametre i mikroskop software og billede for en varighed på 55 h med ca. 1 h intervaller. I hver cyklus, fange to embryo datasæt sekventielt og gemme data automatisk efter hver cyklus.
- Behandle billeder ved hjælp af en on-line eller off-line version af mikroskop software. Hvis mere end ét embryon blev afbildet, oprette uafhængige filer for hvert embryo ved at opdele datasættet baseret på placeringen af Imaging. Brug maksimale intensitets projektioner eller et lignende værktøj til at konvertere 3D-tids datasæt til 2D-tidsdatasæt. Opret filmfiler ved hjælp af menuindstillingen Gem som , og vælg. AVI som filformat. Vælg indstillingen ingen komprimering med 200 MS intervaller for en afspilningshastighed på 5 billeder/s.
Bemærk: det oprindelige datasæt for to embryoner i dette eksperiment blev opdelt ved hjælp af funktionen split Locations i softwaren (fil | Import/eksport | Split multi Points). 3D-tids datasæt blev konverteret til 2D-klokkeslæts datasæt ved hjælp af funktionen maksimal intensitets projektion (billede | Nd forarbejdning | Opret maksimal intensitet projektion billede i Z).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Udvikling af monteringsmetoden
Hovedformålet med dette arbejde var at udvikle en omkostningsbesparende monterings teknik til tidsforskudt billeddannelse af Zebra-udvikling i længere tid ad gangen. Den lagdelte monteringsmetode blev udviklet for at give mulighed for fuld vækst af den skrøbelige Zebra embryo krop, mens begrænse dens bevægelser. Hvis den agrejste koncentration af lag 1 er for høj, vil embryonerne blive forvrænget og buet (figur 2). Embryoner dyrket ved 0,1% og 0,5% agopstået har forkortede haler, forvrængede finner og buede hoveder. Tværtimod, hvis aghas koncentrationen er for lav, vil embryonerne bevæge sig ud af synsfeltet under tidsforskudt mikroskopi, selv om de er bedøvet, da den voksende hale svinger ud fra embryo kroppen og får den til at bevæge sig. I vores hænder varierede den optimale agrose koncentration mellem 0,028% og 0,034% agopstod mellem forskellige partier af agopstået. Montering under 0,025% agopstået gav ikke tilstrækkelig modstand for embryonet at blive i synsfeltet.
Forlænget tidsforskudt billeddannelse af vaskulær, neuronal og muskel udvikling
Efter optimering af monteringsmetoden beskrevet ovenfor blev tidsforskudt Konfokal mikroskopi billeder erobret over en span på 55 h. Vi afbildet levende transgene Zebra udtrykker gfp eller RFP i forskellige væv. En fordel ved at bruge transgene fisk med endogene fluorescens for timelapse Imaging er, at fluorescens molekyler, såsom GFP og RFP, produceres kontinuerligt i levende embryo, og dermed er det ikke let foto blegemiddel. For det første blev embryoner fra et kors af TG (kdr1: EGFP) mitfab692/B69210 og ubi-zebrabow11 imaged. I disse embryoner udtrykkes RFP i alle embryonale celler, hvilket giver mulighed for visualisering af den generelle embryon struktur. GFP udtrykkes i endotelcellerne i Vaskulaturen. Dobbelt transgene embryoner blev afbildet i 55 timer fra ca 30 chakpost stadium til at visualisere vaskulær udvikling i hovedet og kroppen (figur 3 og supplerende film S1) ved hjælp af en 10x mål med 0,45 na. To embryoner/session blev afbildet med z-stakke og tidsforskudt i en løkke, således at efter billeddannelse det første embryo på to forskellige bølgelængder, den anden blev efterfølgende afbildet og derefter den første igen. Figur 3 viser den intersegmental fartøj (ISV) spiring, udvikling af subintestinale fartøjer og hoved Vaskulaturen, og caudal vene plexus kondensation sammen med trunk forlængelse. Billeddannelse af hele embryonet med Vaskulaturen viser, at ISV spiring starter mellem somitter og vokser dorsalt op til det punkt i neurale røret, hvor ISV'er tager en anden vej og spirer i en retning over til den næste forreste chakpost grænse.
Dernæst blev embryoner af et kors af TG (MNX: gfp) mitfab692/b629 og ubi-zebrabow afbildet i 55 timer ca. fra 30 chakpost-stadiet for at visualisere motorneuron-udvikling (figur 4 og supplerende film S2). TG (MNX: GFP) var først blevet krydset til mitfab692/B692 (både fra Zebrafish International Resource Center ved University of Oregon eller) for at producere TG(MNX: gfp) mitfab692/b629. Motorneuron axoner spire fra det ventrale neurale rør over somitterne mod den ventrale side af embryonet. I modsætning til de intersegmentale fartøjer, der spire mellem somitterne, sprøjtes axonerne over midten over den Chevron-formede somites. Spiring starter mod den forreste ende af neurale røret, i en lige vinkel fra neurale røret, og spredes posterior. Ved somite/Yolk-grænsefladen skifter spiring retning til forreste og bageste spiring. Bemærk innervationen af det udviklende hjerte ved de forreste neuritter.
Også embryoner af et kors af TG (KDR: ENL. memRFP) mitfab692/b692 (kryds af TG (KDR: ENL. memrfp og Mitfab692/B692) og TG (MNX: gfp) mitfab692/b692 blev imaged. I de tidligere embryoner var den røde vaskulære fluorescens ikke synlig før 36 timer efter befrugtning (HPF), og derfor startede vi billeddannelse på et senere tidspunkt ved 2 DPF. Vi afbildet en del af stammen, dorsalt til æggeblomme SAC udvidelse, ved hjælp af højere forstørrelse (20x mål). Denne film viser, at embryonerne lå stadig nok til god billeddannelse kvalitet ved højere forstørrelse. Den fælles udvikling af den dorsale spiring af motorneuron axoner i forhold til placeringen af intersegmental fartøjer blev fulgt (figur 5 og supplerende film S3). I disse film, de finere detaljer af ventrale Axon spiring er synlige, samt dorsale Axon spiring fra neurale rør til et punkt, hvor neuronal axoner og intersegmental skibe Co-migrere. Den caudale vene plexus kondensation er også tydeligt vist. Bemærk, at som en neurite spire mangler mod den bageste ende af halen (i position af 12th neurite fra højre side), den nærmeste posterior neuron strækker sig mod den forreste del af embryonet til at dække området mellem neurites 11 og 13.
Endelig blev et kors på HGn39b12,13 og ubi-zebrabow imaged. HGn39b er en ztrap-linje med gfp-skæret i Aktivatoren af Heat Shock protein ATPase ligner 1 (AHA1)-genet (http://kawakami.Lab.NIG.ac.jp/), og det udtrykker gfp i somites muskler (figur 6 og supplerende film S4). Som chakpost tal stigning, somitterne også forlænge i længde og bredde. Denne film også pænt viser hjerte udvikling i rød fluorescens fra ubi-zebrabow fisk linje.
Figur 1: Beskrivelse af monteringsmetode. (A) Tilsæt Zebra embryonet til den lille brønd skabt af glasbunden i 35 mm skålen. B) Tilsæt agopstået lag 1 til det lille brønd for at dække embryonet. (C) Anbring forsigtigt et dækglas over den lille brønd. (D) Tilsæt agopstået lag 2 på hele bunden af 35 mm skålen. (E) Tilføj E3 til skålen. F) skematisk tegning af et tværsnit af monteringssættet. G) mikroskopet billede (5x mål) af zebrafiskembryonet i den endelige montage. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: begrænsning af embryo vækst og udviklingsmæssige forsinkelser i forskellige koncentrationer af agopstået. Embryonerne blev monteret i forskellige agopstod koncentrationer og deres størrelse og udvikling afbildet på 48 HPF. Billeder fanget af et mikroskop udstyret med et digitalt mikroskop farvekamera (2.5 x mål) og den medfølgende mikroskop software. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: visualisering af udviklingen af vasculature. Kors af TG (kdr1: egfp) mitfab692/b692 og ubi-zebrabow afbildet fra omkring 30 chakpost fase for 55 h på et Konfokal mikroskop. Vasculature i grøn og alle andre celler i rødt. Skala bjælke 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: visualisering af udviklingen af neuroner og neurite spiring. Kryds af TG (MNX: gfp) mitfab692/b629 og ubi-zebrabow afbildet fra omkring 30 chakpost fase for 55 h på et Konfokal mikroskop. Motor neuroner i grøn, alle andre celler i rødt. Skala bjælke 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: visualisering af co-udvikling af neuroner og vasculature. Kryds af TG (KDR: ENL. memrfp) mitfab692/b692 og TG (MNX: gfp) mitfab692/b692 afbildet i 55 timer fra ca. 2 DPF på et Konfokal mikroskop. Vasculature i rødt, motor neuroner i grøn. Skala bjælke 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: visualisering af MUSKELGFP-udtryk i somites. Cross of HGn39b og ubi-zebrabow blev afbildet på en confokal mikroskop for 55 h fra omkring 30 chakpost fase. Muskel i grøn, alle andre celler i rødt. Scale bar 500 μm Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende film S1: film af et embryo af et kors af TG (kdr1: egfp) mitfab692/b692 og ubi-zebrabow afbildet fra omkring 30 chakpost fase for 55 h på en confokal mikroskop ved hjælp af en 10x mål. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende film S2: film af et embryon af et kors af TG (MNX: gfp) mitfab692/b629 og ubi-zebrabow afbildet fra omkring 30 chakpost fase for 55 h på en confokal mikroskop ved hjælp af en 10x mål. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende film S3: film af et embryon af et kors af TG (KDR: ENL. memrfp) mitfab692/b692 og TG (MNX: gfp) mitfab692/b692 afbildet fra ca. 2 DPF for 55 h på en confokal mikroskop ved hjælp af en 20x mål. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende film S4: film af et embryo af et kors af HGn39b og ubi-zebrabow afbildet fra omkring 30 chakpost fase for 55 h på en confokal mikroskop ved hjælp af en 10x mål. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrives en monteringsmetode til udvidet tidsforskudt Konfokal mikroskopi af hele Zebra-embryoner. Det mest kritiske skridt for monteringsmetoden er at identificere den optimale koncentration af agopstod, der vil give mulighed for ubegrænset Zebra embryo vækst, og samtidig holde embryonerne i en helt fast position for confokale Imaging. Fordi den optimale koncentration af agat er meget smal, denne værdi er meget følsom over for fejl i målingen af vægten af agopstået og mængden af E3 under forberedelsen af opløsningen. Den optimale koncentration kan også afhænge af temperaturen og stadiet af embryonet. Den optimale koncentration skal således omdefineres for hver ny batch af agopstået løsning ved gentagelse af tests af forskellige koncentrationer.
Et andet kritisk skridt er i monteringsmetoden er tilføjelsen af det andet lag af agopstået. Det andet lag holder dækslet glas på plads. Det skal tilsættes omhyggeligt til skålen lidt ad gangen, så det ikke forårsager dækslet glas til at flytte. Det andet lag fungerer også som en gennemtrængelig barriere for E3. Uden E3 vil embryonerne tørre ud under billeddannelse. Uden det andet lag af agopstået, vil dækglasset og embryonet begynde at flyde.
En begrænsning af den foreslåede monteringsmetode er, at mens det fungerer godt for inverterede mikroskoper, det virker ikke for opretstående mikroskoper. Der blev gjort flere forsøg på at udføre tidsforskudt billeddannelse ved hjælp af et oprejst mikroskop ved at fylde glasbunden med E3, forsegle det med parafilm og dreje det på hovedet. Men ofte resulterede dette i, at monteringen kollapsede halvvejs gennem billeddannelse. Dette kan have været forårsaget af øget varme i prøven efter den lange udsættelse for laserlys, som forårsager solidificeret agopstået lag til at smelte.
Ved udgangen af time-lapse mikroskopi embryonerne begyndte at vise perikardiødem. Varierende mellem forskellige eksperimenter, ødem blev observeret mellem 35 og 50 timer af Imaging. Hvorvidt dette var forårsaget af embryo immobilisering, eller en effekt af anæstetika, er i øjeblikket ikke kendt. Tricain er kendt for at undertrykke sammentrækning af skelet-og hjerte muskler. Derfor, Tricain påvirker hjertefrekvensen i voksne fisk14 og embryoner15. Andre undersøgelser har også rapporteret, at tricain behandling forårsager perikardiødem i Zebra embryoner2,16. I denne artikel, en koncentration af Tricain (0.016-0.020%) blev brugt, der er almindeligt anvendt i Zebra forskning; stadig, den perikardiske ødem opstod ved udgangen af vores Imaging periode. Perikardiødem udgjorde en hoved begrænsning for at muliggøre billeddannelse af embryonerne i endnu længere perioder. Potentielle måder at reducere denne kardiotoksicitet kombinerer to forskellige anæstetika, såsom Tricain med eugenol, eller ved hjælp af α-bungarotoxin mRNA injektion for anæstetika16; gavnlige virkninger af kombinatoriske eller alternative anæstetiseringsforbindelser skal undersøges yderligere for forlænget tidsforskudt billeddannelse af Zebra udvikling.
Afslutningsvis er den beskrevne monteringsmetode hurtig, nem, omkostningseffektiv og virker på ethvert inverteret mikroskop. Almindelige glasbund retter og lav smeltende agopstået kan anvendes, og ingen særlige forme, udstyr eller instrumentering er påkrævet. Den lagdelte monteringsmetode giver mulighed for embryo vækst, samtidig med at embryonerne holdes i en fast position. Ved hjælp af forlænget tidsforskudt billeddannelse af hele organismen kan der opnås ny viden om vævs udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Albert pan og Arndt Sieakmann for gaver af transgene fisk. Vi takker Koichi kawakami på National Institute of Genetics, det nationale bioresource projekt fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi i Japan for gaven af den transgene Zebra HGn39b. Vi takker også Fatima Merchant og Kathleen Gajewski for assistance i forbindelse med confokal mikroskopi og Tracey Theriault for fotografier.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institute of Environmental Health Sciences af National Institutes of Health (tilskudsnummer P30ES023512 og kontraktnummer HHSN273201500010C). SU blev støttet af et stipendium fra Keck Computational Cancer Biology program (Gulf Coast konsortier CPRIT Grant RP140113) og af Hugh Roy og Lillie begavelse fund. J-Å G blev støttet af Robert A. Welch Foundation (E-0004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22x22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
References
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nature Communications. 4, 2207 (2013).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing. BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).
- Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish. Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).
- Hirsinger, E., Steventon, B. A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development. Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).
- McCollum, C. W., et al. Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish. Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).
- Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
- Nagayoshi, S., et al. Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like. Development. 135 (1), 159-169 (2008).
- Huang, W. C., et al. Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish. Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).
- Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).
