Un sistema per tenere traccia delle dinamiche del comportamento delle preferenze sociali nei piccoli roditori

Summary

Descritto qui è un nuovo sistema sperimentale automatizzato che offre un'alternativa al test a tre camere e risolve anche diversi avvertimenti. Questo sistema fornisce più parametri comportamentali che consentono un'analisi rigorosa delle piccole dinamiche comportamentali dei roditori durante i test di preferenza sociale e di preferenza di social novella.

Abstract

Esplorare i meccanismi neurobiologici del comportamento sociale richiede test comportamentali che possono essere applicati ai modelli animali in modo imparziale e indipendente dall'osservatore. Dall'inizio del millennio, il test a tre camere è stato ampiamente utilizzato come paradigma standard per valutare la socialità (preferenza sociale) e la preferenza di novità sociale nei piccoli roditori. Tuttavia, questo test soffre di molteplici limitazioni, tra cui la sua dipendenza dalla navigazione spaziale e la negligenza delle dinamiche comportamentali. Presentato e convalidato qui è un nuovo sistema sperimentale che offre un'alternativa al test a tre camere, risolvendo anche alcuni dei suoi avvertimenti. Il sistema richiede un apparato sperimentale semplice e conveniente e un sistema di analisi open source disponibile al pubblico, che misura e analizza automaticamente più parametri comportamentali a livello individuale e di popolazione. Permette un'analisi dettagliata delle dinamiche comportamentali dei piccoli roditori durante qualsiasi test di discriminazione sociale. Dimostriamo l'efficienza del sistema nell'analisi delle dinamiche del comportamento sociale durante i test di preferenza sociale e di preferenza di social novella eseguiti da topi maschi adulti e ratti. Inoltre, convalidiamo la capacità del sistema di rivelare dinamiche modificate del comportamento sociale nei roditori a seguito di manipolazioni come il taglio baffo. Così, il sistema consente un'indagine rigorosa del comportamento sociale e delle dinamiche in piccoli modelli di roditori e supporta confronti più accurati tra ceppi, condizioni e trattamenti.

Introduction

Rivelare i meccanismi biologici alla base dei disturbi del neurosviluppo (NDD) è una delle principali sfide nel campo delle neuroscienze¹. Affrontare questa sfida richiede paradigmi comportamentali e sistemi sperimentali che caratterizzano il comportamento dei roditori in modo standard e imparziale. Uno studio influente pubblicato più di dieci anni fa da Moy e colleghi² ha presentato il test a tre camere. Da allora, questo test è stato ampiamente utilizzato per studiare il comportamento sociale nei modelli di roditori di NDD. Questo test valuta due tendenze innate dei roditori: 1) a rimanere in prossimità di uno stimolo sociale rispetto a un oggetto (società, anche definito preferenza sociale [SP]), e 2) a preferire la vicinanza di un nuovo stimolo sociale a uno familiare (preferenza di novità sociale [SNP])^3,4. Diversi studi successivi hanno suggerito metodi di analisi automatizzata del test a tre camere utilizzando metodi computerizzati^5,6.

Questo test soffre ancora di diversi avvertimenti. In primo luogo, esamina principalmente la preferenza sociale del luogo piuttosto che la motivazione del soggetto a interagire direttamente con uno stimolo sociale, anche se alcuni gruppi misurano anche il tempo di indagine olfattiva (sniffing), sia manualmente⁷ o utilizzando sistemi commerciali computerizzati^8,9,10. In secondo luogo, il test a tre camere viene utilizzato principalmente per misurare il tempo totale impiegato dal soggetto in ogni camera e trascura le dinamiche comportamentali. Infine, si basa su un solo aspetto del comportamento sociale, che è il tempo trascorso dal soggetto in ogni camera (o il tempo di sniffing, se misurato).

Qui presentiamo un nuovo e conveniente sistema sperimentale che è un'alternativa all'apparato a tre camere. Permette anche le prestazioni degli stessi test comportamentali mentre risolve gli avvertimenti di cui sopra. Il sistema comportamentale presentato misura automaticamente e direttamente il comportamento investigativo di un roditore verso due stimoli. Inoltre, analizza le dinamiche comportamentali in modo indipendente dall'osservatore. Inoltre, questo sistema misura più parametri comportamentali e li analizza sia a livello individuale che di popolazione; supporta quindi un'analisi rigorosa del comportamento sociale e delle sue dinamiche durante ogni test. Inoltre, il riposizionamento casuale delle camere negli angoli opposti dell'arena durante le varie fasi di prova neutralizza eventuali effetti della memoria spaziale o della preferenza. Questo sistema può essere utilizzato anche per altri test di discriminazione, come la discriminazione sessuale. L'apparato personalizzato è facile da produrre e il sistema di analisi è accessibile al pubblico come codice open source, consentendone così l'uso in qualsiasi laboratorio. Dimostriamo la capacità di questo sistema di misurare più parametri del comportamento sociale in ceppi di roditori con colori di pelliccia distinti durante i test di preferenza sociale e di preferenza di novità sociale. Convalidiamo anche la capacità del sistema di rivelare dinamiche modificate del comportamento sociale nei roditori che seguono manipolazioni, come il taglio dei baffi.

Software TrackRodent: sono stati scritti tre algoritmi in MATLAB (2014a-2019a) per tracciare il soggetto sperimentale e le sue interazioni con gli stimoli. Tutti gli algoritmi sono stati depositati in GitHub, trovato all'indirizzo . L'obiettivo principale di tutti e quattro gli algoritmi è quello di monitorare i contorni del corpo del soggetto per rilevare qualsiasi contatto diretto con le aree di stimoli.

Algoritmo basato sul corpo: questo algoritmo ha tre versioni che tengono traccia dei contorni di un mouse scuro non cablato su uno sfondo bianco (BlackMouseBodyBased), un mouse bianco su uno sfondo scuro (WhiteMouseBodyBased) o un ratto bianco su uno sfondo scuro (WhiteRatBodyBased ). L'interfaccia utente grafica (GUI) del software richiede che lo sperimentatore scelga un esperimento utilizzando mouse o ratti e quindi seleziona il codice corretto. Per ogni versione dell'algoritmo, ci sono due codici opzionali: uno che presenta il processo di tracciamento sullo schermo mentre esegue l'analisi e uno che non lo fa (quindi, viene eseguito più velocemente e viene definito "veloce"). Ad esempio, i nomi dei codici rilevanti per l'algoritmo BlackMouseBodyBased sono: "BlackMouseBodyBased23_7_14" e "BlackMouseBodyBased23_7_14_Fast". Tutti gli algoritmi che terminano con "veloce" non mostrano il rilevamento online e gli utenti devono salvare direttamente i dati nel file dei risultati (file .mat). Tutti gli algoritmi basati sul corpo richiedono l'impostazione di una singola soglia ("soglia bassa" nella GUI del software) per rilevare il corpo del soggetto.

Algoritmo basato sulla direzionalità della testa: il secondo algoritmo, disponibile solo per i topi neri, si basa sull'algoritmo basato sul corpo, oltre a determinare la direzionalità della testa. Questo algoritmo rileva le interazioni della testa del soggetto con le aree "stimoli", evitando così falsi positivi che possono derivare da contatti casuali del soggetto' con queste aree. Per questo algoritmo, vengono definite due soglie di rilevamento dei contorni del corpo del mouse: soglia alta, che include la coda più luminosa dei topi neri, e soglia bassa, che include il corpo senza coda. Successivamente, l'algoritmo adatta un ellissoide ai limiti rilevati utilizzando la soglia inferiore e definisce la posizione della testa e della coda del mouse (senza distinzione tra i due). La discriminazione finale tra la coda e la testa si basa sui confini definiti dalla soglia più alta.

Algoritmo animale cablato: il terzo algoritmo mira a ridurre al minimo gli artefatti derivanti da cavi (ad esempio, cavi elettrici o fibre ottiche) collegati all'animale, consentendo l'analisi del comportamento dell'animale mentre è collegato a un cavo. Questo algoritmo ha codici solo per topi neri e ratti bianchi. Il codice per i ratti richiede che lo sperimentatore definisca le soglie basse e alte, mentre il codice del mouse richiede solo una soglia bassa.

Protocol

Tutti i metodi descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università di Haifa.

1. Configurazione sperimentale

1. Arena
   1. Costruire l'arena sperimentale per i topi (Figura 1A,D) posizionando una scatola di plexiglass bianca o nera (a seconda del colore dell'animale) in plexiglass (37 cm x 22 cm x 35 cm) al centro di una camera acustica (60 cm x 65 cm x 80 cm, realizzata in legno spesso 2 cm rivestito all'interno con schiuma spessa 2 cm). Per la luce, rimuovere una striscia (2 cm di larghezza, 10 cm sotto il soffitto della camera) della schiuma intorno alla camera acustica (oltre alla porta), e collegare una striscia LED con lampadine rosse o bianche. Assicurati che la luce sia il più uniforme possibile intorno all'arena per evitare riflessi.
   2. Costruire l'arena per i ratti in modo simile a quello descritto sopra per i topi, con dimensioni diverse che si adattano in modo appropriato alle dimensioni dei ratti Sprague-Dawley (SD) (Figura 1G). Posizionare una scatola in plexiglass nera (50 cm x 50 cm x 40 cm) al centro di una camera acustica (90 cm x 60 cm x 85 cm, realizzata in legno spesso 2 cm rivestito all'interno con schiuma spessa 2 cm).
2. Camere
   1. Per i topi, creare due camere triangolari nere o bianche (a seconda del colore della pelliccia) triangolari (12 cm isosceli, altezza 35 cm, con i pavimenti chiusi) da plexiglass spessi 6 mm. Individuarli in due angoli opposti selezionati casualmente dell'arena (Figura 1B,E). Attaccare una rete metallica (18 mm x 6 cm; 1 cm x 1 cm di fori) nella parte inferiore di ogni camera utilizzando colla epossidica per consentire interazioni dirette con lo stimolo attraverso la mesh (Figura 1C,F). Contrassegnare ogni camera in un modo che consente la discriminazione da parte degli altri in un video senza dare indizi ai soggetti (vedi Figura 1B,E per esempi).
      NOT: Ogni camera alla fine conterrà uno stimolo sociale (mouse) o un oggetto (giocattolo di plastica, 5 cm x 5 cm x 5 cm, con una forma e un colore distinti; Figura 1C,I insets). Lasciare evaporare l'odore della colla epossidica per almeno una settimana prima dell'uso.
   2. Per i ratti, creare due camere triangolari nere (20,5 cm isosceli, 40 cm di altezza, in plexiglass spessa 6 mm, con i pavimenti chiusi) e posizionarli in due angoli opposti casualmente selezionati dell'arena (Figura 1H), ciascuno con una rete metallica (25x cm 7 cm; 2,5 cm x 1 cm) fori che coprono la sua parte inferiore (Figura 1I).
3. Posizionare una fotocamera monocromatica di alta qualità, dotata di un obiettivo grandangolare, nella parte superiore della camera acustica e collegarla a un computer per consentire una visione e la registrazione chiare del comportamento del soggetto utilizzando un software commerciale (vedere Tabella dei materiali per suggerimenti).

2. Paradigma Comportamentale

NOT: I passaggi 2.1-2.7 descrivono il paradigma comportamentale per i topi. Vedere la sezione 2.8 per istruzioni specifiche relative ai ratti.

1. Assicurarsi che le gabbie di tutti gli animali (soggetti: topi maschi di 2-4 mesi; stimoli: topi giovani di 21-30 giorni) rimangano nella stanza sperimentale per almeno 1 h prima di iniziare l'esperimento comportamentale.
2. Dopo il periodo di acclimatazione, inserire due camere vuote nell'arena in modo casuale in due angoli opposti. Posizionare il soggetto al centro dell'arena per 15 min di assuefazione. Durante questo periodo, mettere i due stimoli sociali, ciascuno in una camera diversa situata fuori dall'arena per l'assuefazione. Posizionare un oggetto (un giocattolo di plastica, 5 cm x 5 cm x 5 cm, con una forma e un colore distinti) in un'altra camera.
3. Per eseguire il test delle preferenze sociali (SP), avviare la registrazione video e mantenere la registrazione fino alla fine del test.
4. Rimuovere le due camere vuote e inserire immediatamente l'oggetto e uno degli stimoli sociali, ciascuno in una camera distinta. Individuare queste camere in modo casuale negli angoli opposti dell'arena che erano vuote durante l'assuefazione. Lasciare che il soggetto interagisca con gli stimoli per i 5 min del test SP. Alla fine del test, interrompere la registrazione.
5. Dopo il test SP, rimuovere le camere contenenti stimoli dall'arena e lasciare il soggetto nell'arena vuota per 15 min. Pulire le camere dall'esterno con salviette di etanolo del 10%.
6. Per eseguire il test di preferenza di novità sociale (SNP), avviare la registrazione video e inserire due camere nell'arena: una contenente lo stesso stimolo sociale utilizzato per il test SP (stimolo familiare), e l'altro contenente il nuovo stimolo sociale. Posizionare queste camere in modo casuale in due angoli opposti dell'arena, assicurandosi che questi luoghi non siano stati utilizzati per il test SP. Lasciare che il soggetto interagisca con gli stimoli per i 5 min del test SNP.
7. Alla fine del test SNP, interrompere la registrazione video, rimuovere il soggetto e le camere dall'arena e riporre il soggetto nella sua gabbia di casa. Lasciare gli stimoli nelle camere per l'esperimento successivo (con un altro soggetto) o riportarli alle loro gabbie di casa. Pulire l'arena e le camere con acqua corrente seguite dal 10% di etanolo e lasciarle asciugare.
8. Paradigma comportamentale per i ratti
   1. Per i ratti, ripetere il paradigma comportamentale descritto nei passaggi 2.1-2.7, con due modifiche: 1) gestire i soggetti ratti e abituare gli stimoli sociali alle camere per 2 giorni (10 min ogni giorno) prima dell'esperimento; e 2) estendere il test SP per 15 min per dare ai ratti un periodo più lungo di esposizione agli stimoli sociali. Successivamente, limitare l'analisi del test SP ai 5 min iniziali.
      NOT: Sono necessarie almeno un'arena e cinque camere per eseguire una sola sessione.

3. Utilizzo della GUI TrackRodent per l'analisi comportamentale

NOT: Vedere il pannello superiore di Figura 2A per la GUI TrackRodent.

1. Aprire MATLAB (testato con 2014a-2019a) e scegliere la cartella TrackRodent.
2. Aggiungere tutte le sottocartelle al percorso di lavoro facendo clic con il pulsante destro del mouse su ogni cartella e selezionando Aggiungi al percorso . Cartelle e sottocartelle selezionate.
3. Digitare TrackRodent nella finestra di comando e premere INVIO.
4. Carica un singolo file o più file video (formato AVI o MP4) selezionando Carica file di sessione (AVI).
5. Un controllo filmato, che consente l'ispezione del video clip fotogramma per fotogramma, verrà immediatamente aperto per il primo file dell'elenco (Figura 2A). Utilizzatelo per esaminare il video clip e definire il primo e l'ultimo fotogramma del segmento da analizzare. Registrare i numeri di questi fotogrammi, che saranno necessari in seguito. Al termine, chiudere la finestra.
6. Per controllare altri file video, aprire la finestra di ispezione video in qualsiasi momento premendo Controlla filmato e selezionando un file video specifico.
7. Selezionare le specie testate (topo o ratto; il topo è l'impostazione predefinita).
8. Escludere tutte le aree che possono interrompere il tracciamento, in base ai colori del soggetto e dell'arena (nero o bianco).
   1. Per escludere una determinata area, premere Escludi areae dopo che il cursore assume la forma a croce, contrassegnare tutti gli angoli dell'area per l'esclusione. Al termine, fare clic con il pulsante destro del mouse, quindi fare doppio clic con il pulsante sinistro del mouse e scegliere il centro dell'area contrassegnata. L'area esclusa diventerà una tonalità di rosso sullo schermo. Ripetere questa procedura per escludere tutte le aree necessarie.
9. Per rimuovere un'area dall'esclusione, premere Rimuovi area esclusa, quindi (utilizzando il cursore incrociato) fare clic sull'area da rimuovere dall'esclusione.
10. Per definire ogni camera come un'area di stimolo, per il rilevamento automatico della sua indagine da parte del soggetto, scegliere la forma dell'area di stimolo come poligono o ellittica selezionando la casella appropriata, quindi premendo Stimolo X (dove "X" rappresenta 1, 2 o 3). Contrassegnare le aree di stimolo in modo simile alle aree escluse, che diventeranno di colore giallo. Per modificare la posizione di un'area specifica, premere nuovamente Stimulus X e contrassegnare la nuova posizione dell'area (aggiorna automaticamente la posizione).
    NOT: Scegliere il diverso numero di stimoli in modo coerente per tutti i file (ad esempio oggetto come stimolo 1 per tutti i file di test SP).
11. Per monitorare la presenza del soggetto in uno specifico vano virtuale all'interno dell'arena, scegliere la forma dell'area di "compartimento" (poligono o ellittica), quindi premere Compartment X (dove "X" rappresenta 1, 2, 3, 4 o 5). Contrassegnare le aree di "compartimento" in modo simile alle aree escluse o stimoli, che diventeranno di colore blu. Per modificare la posizione di un'area "compartimentale" specifica, premere nuovamente Compartment X e contrassegnare la nuova posizione dell'area (aggiorna automaticamente la posizione).
12. Scegliere l'algoritmo desiderato (BlackMouseBodyBased è stato utilizzato per il video) dall'elenco (vedere gli algoritmi disponibili nella Figura 2B).
13. Scrivere i numeri dei fotogrammi iniziale e finale per l'analisi nelle caselle di modifica corrispondenti della GUI.
14. Scegliere una soglia per il rilevamento del corpo del soggetto.
    NOT: La maggior parte degli algoritmi utilizza solo la soglia "Basso", mentre gli algoritmi basati sulla direzionalità della testa utilizzano anche la soglia "Alta". Per la soglia "Bassa", scegliere un livello che includa il corpo del topo/ratto senza la coda (per quanto possibile), mentre la soglia "Alta" deve includere anche la coda. Nel caso di utilizzo di algoritmi basati sulla direzionalità della testa, il software determinerà la posizione della testa come opposta alla posizione della coda.
    NOT: Il software in seguito ignora i piccoli oggetti rilevati utilizzando la soglia scelta.
15. Per valutare il rilevamento automatico dei bordi del soggetto per una determinata soglia, inserire un valore nel campo soglia pertinente e premere INVIO sulla tastiera.
16. Quando si scelgono più file, passare al file successivo (utilizzando il pulsante Avanti nella parte superiore) e selezionare le definizioni appropriate per ogni file. Al termine, verificare i parametri e le posizioni delle aree per tutti i file spostandoli tra di essi, utilizzando i pulsanti Precedente e Successivo nella parte superiore della GUI.
    NOT: Le definizioni di tutte le aree e i parametri sono specifiche di un determinato file.
17. Per avviare l'analisi comportamentale di tutti i file selezionati, passare al primo file e premere Avvia.
18. Al termine dell'analisi, un file dei risultati (file .mat) viene salvato per ogni filmato nella stessa directory dei file di filmato.
    NOT: Se viene utilizzata la versione lenta (non veloce) dell'algoritmo, salverà anche una versione del filmato con una croce bianca del centro di massa corporea, che cambia colore ogni fotogramma che viene rilevato come investigatore, a meno che il pulsante Salva filmato analizzato della GUI non sia deselezionato. Questa versione del filmato (salvata nella stessa directory, con lo stesso nome del filmato originale, con il suffisso 'filmato analizzato') può essere utilizzata offline per valutare la qualità del rilevamento automatico eseguito dal sistema.

4. Utilizzo della GUI TrackRodent per la presentazione dei risultati

NOT: Vedere il pannello inferiore di Figura 2A per la presentazione dei risultati.

1. Per esaminare i risultati di ogni file filmato, premere Carica file dei risultati e scegliere i file .mat generati dall'analisi comportamentale.
2. Spostarsi tra i pulsanti di attivazione/disattivazione per esaminare su schermo una delle seguenti analisi: Traccia della posizione del mouse(Figura 2A); Occupazione dei compartimenti lungo la sessione (se sono stati definiti i "compartimenti", non mostrati); Esplorazione degli stimoli lungo la sessione (Figura 2C); Tempo totale in compartimenti (se sono stati definiti "compartimenti", non indicato); e Tempo totale di esplorazione degli stimoli (Figura 2D).
   NOT: Le aree "stimulus" sono aree in cui il software valuta l'interazione con il soggetto, mentre le aree "Compartment" sono aree in cui il software tiene traccia della presenza del soggetto. L'interruzione dell'analisi mediante il pulsante Interrompi analisi salverà automaticamente i risultati generati fino all'ultimo frame analizzato. Per la maggior parte dei computer, dovrebbe essere possibile caricare e analizzare fino a 20 film contemporaneamente (a seconda delle prestazioni del computer).

5. Utilizzo della GUI TrackRodentPopulationSummary per l'analisi della popolazione (Figura 2E)

1. Aprire MATLAB (testato con 2014a-2019a) e scegliere la cartella TrackRodent.
2. Digitare TrackRodentPopulationSummary nella finestra di comando e premere INVIO.
3. Caricare più file dei risultati TrackRodent (formato .mat) premendo Scegli file dei risultati.
4. Immettere i numeri di Ultimo fotogramma per l'analisi, Nome test, Nome stimulo 1e Nome stimolante 2.
5. Scegliere le analisi desiderate dall'elenco delle analisi facoltative selezionando tutte le caselle appropriate.
6. Scegliere Esporta i risultati in un foglio di lavoro selezionando la casella appropriata per estrarre tutti i risultati delle analisi selezionate come un singolo file di foglio di calcolo.
7. Premere Start e attendere il completamento dell'analisi.
   NOT: Questo conclude l'analisi. Il software può essere utilizzato per analizzare i risultati di tutti i file di film come desiderato, dato che sono stati tutti analizzati in modo comportamentale utilizzando il software TrackRodent. L'analisi eseguita dal software presuppone la registrazione video ad una frequenza fotogrammi di 30 Hz. Nel caso in cui sia stata utilizzata una frequenza fotogrammi diversa, moltiplicare il tempo per 30 e dividere per la frequenza fotogrammi utilizzata per la registrazione per convertirlo nel valore corretto.

Representative Results

Utilizzo del sistema per il test di preferenza sociale nei topi C57BL/6J
La figura 1 mostra tre versioni dell'impostazione sperimentale. La prima versione (Figura 1A-C) è progettata per topi con colori di pelliccia scura, come i topi C57BL/6J. Il secondo (Figura 1D-F) è previsto per i topi con colori brillanti della pelliccia, come i topi BALB/c o ICR (CD-1). Il terzo è più grande (Figura 1G-I) e progettato per i ratti con colori di pelliccia brillante, come i ratti SD. I primi soggetti esaminati erano maschi ingenui adulti (8-12 settimane), topi C57BL/6J di sesso alloggiati in gruppo (da due a cinque animali per gabbia). Gli stimoli sociali erano giovani (21-30 giorni), alloggiati in gruppo (da due a sei animali per gabbia), topi maschi C57BL/6J. Gli stimoli degli oggetti erano giocattoli di plastica inodore con colori distinti (insene in Figura 1C, I). I file video degli esperimenti sono stati analizzati utilizzando il software TrackRodent (algoritmo basato sul corpo, vedere l'immagine dello schermo esemplificato e la GUI nella Figura 2A), che ha monitorato automaticamente e continuamente la posizione del soggetto in base a 1) centro del corpo e 2) il contatto dei contorni del corpo con le camere contenenti gli stimoli.

L'analisi ha comportato le seguenti procedure. Dopo aver caricato un file di filmato e aver definito graficamente le aree da escludere dall'analisi, lo sperimentatore ha definito graficamente due aree, ognuna delle quali comprende una camera distinta, come 'stimoli' (Figura 2A, aree giallastre). Gli utenti possono anche definire fino a cinque aree come "compartimenti" virtuali. Quindi, gli utenti scelgono l'algoritmo "BlackMouseBodyBased23_7_14_Fast" dall'elenco dei possibili algoritmi (Figura 2B). Dopo aver premuto il pulsante Avvia analisi, il software ha tracciato la posizione dell'animale fotogramma per fotogramma e ha raffigurato la traccia della posizione del mouse nell'arena (Figura 2A, linea blu). Durante questa analisi, il software ha anche monitorato i contatti tra le aree 'stimoli' e il contorno del corpo del soggetto (Figura 2C). Tali eventi di contatto sono stati definiti come investigatori e serviti per calcolare il tempo di indagine per ogni stimolo e il tempo durante il quale non è stato visualizzato alcun comportamento di indagine (Figura 2D). Come si evince dalla Figura 2C,D che mostra il film analizzato, è stato osservato un tempo di indagine più elevato per 'stimolo 2', che era lo stimolo sociale, rispetto all'oggetto, che in questo caso è stato definito come 'stimolo 1'.

Analisi della popolazione del test di preferenza sociale nei topi C57BL/6J
Dopo aver permesso al software TrackRodent di analizzare tutti i file video del gruppo sperimentale, è stata eseguita un'analisi della popolazione per questo gruppo utilizzando la GUI "TrackRodentPopulationSummary" (Figura 2E), scegliendo tutte le possibili analisi di questo software. I risultati distinti di queste analisi per il test SP eseguito con 58 topi adulti C57BL/6J sono visualizzati nella Figura 3, esattamente come sono apparsi sullo schermo del computer, con tutte le barre di errore che raffigurano SEM. Analisi statistiche di questi risultati sono state precedentemente pubblicate¹¹.

Il tempo medio totale di indagine della popolazione di soggetti verso ciascuno dei due stimoli (stimolo sociale giovanile dello stesso sesso e un oggetto) è visualizzato nella Figura 3A, che illustra una chiara preferenza del soggetto verso lo stimolo sociale. Sebbene l'algoritmo sia semplice, è stata osservata un'eccellente correlazione (r² - 0,91, p < 10^-6, correlazione di Pearson) tra il tempo di indagine misurato manualmente da un osservatore addestrato e il valore calcolato dal software. La dinamica di questa preferenza può essere vista nella Figura 3B, in cui il tempo medio di indagine per ogni stimolo è tracciato nel tempo in bidoni 20 s. Come mostrato, la preferenza sociale è mantenuta dai soggetti per tutta la sessione, anche se sembrava leggermente più forte nelle prime fasi.

Figura 3C illustra il tempo di indagine per ogni stimolo, classificato in base alla durata dell'incontro in brevi (6 s), medio (>6 s, s) e lungo (>19 s) bouts, insieme al tempo totale di indagine. La distribuzione del tempo di indagine per ogni stimolo in base alla durata dell'incontro in 1 s bins è visualizzato nella figura 3D. Come mostrato nella Figura 3C,D, non c'era differenza tra gli stimoli negli accacci brevi, mentre gli accacci intermedi e lunghi mostravano chiare preferenze sociali. Questi risultati suggeriscono che nei topi C57BL/6J, brevi fustici riflettono la curiosità, mentre lunghi ebè riflettono un'interazione tra il soggetto e gli stimoli. La durata relativa dell'indagine (RDI, [oggetto-sociale]/[social-object]) per ogni categoria (brevi, medie e lunghe eccezioni), nonché per il tempo totale di indagine, sono mostrati nella Figura 3E. Come mostrato, il più alto valore di RDI si ottiene con i lunghi sbav, suggerendo che essi riflettono meglio le preferenze sociali dei soggetti.

Per analizzare la dinamica dell'incontro di indagine durante il test, le distribuzioni nel tempo per ogni categoria sono state tracciate separatamente. Le distribuzioni nel tempo degli ebuccedi di indagine brevi (Figura 3F) e medi(Figura 3G) suggeriscono una riduzione graduale di tali bout nel tempo. Al contrario, un'analisi simile degli out lunghi (Figura 3H) mostra un aumento graduale nel corso del test. Questa tendenza si riflette anche nella distribuzione della durata dell'incontro medio (Figura 3I), mostrando un aumento graduale nel tempo. Così, sembra che i soggetti abbiano mostrato curiosità soprattutto durante le prime fasi del test, mentre in seguito hanno mostrato più interazioni con gli stimoli. Va notato che durante l'ultimo minuto, c'è un pregiudizio intrinseco dell'analisi verso brevi periodi di incontro, perché i lunghi periodi di incontro sono stati terminati artificialmente alla fine della sessione. Pertanto, quando si considera il corso temporale degli sbis, l'ultimo minuto dovrebbe essere ignorato.

Abbiamo anche analizzato gli intervalli tra i successivi sbav di indagine verso lo stesso stimolo (cioè il tempo impiegato dal soggetto per tornare allo stesso stimolo dopo la fine di ogni incontro di indagine). Questo parametro riflette l'impulso del soggetto a tornare allo stesso stimolo e indagare. In questo caso, gli intervalli sono stati classificati anche in brevi ('5 s), media (>5 s,'20 s) e lunghi (>20 s) acconto, che vengono visualizzati insieme a intervalli di tempo totali per ogni stimolo in Figura 3J. L'istogramma degli intervalli in 1 s bins in visualizzato in Figura 3K. Come mostrato nella Figura 3J,K, gli intervalli tra le indagini sullo stimolo sociale erano molto più brevi di quelli tra le indagini sull'oggetto. Di conseguenza, i valori RDI degli intervalli nell'intervallo lungo hanno prodotto il valore assoluto più alto (Figura 3L); pertanto, possono essere utilizzati come variabile investigativa indipendente dal tempo che valuta la preferenza sociale. Le distribuzioni nel tempo degli intervalli tracciati separatamente per ciascuna categoria(Figura 3M-O) suggeriscono una riduzione graduale degli intervalli brevi e medi e una variazione opposta degli intervalli lunghi tra gli sconsi delle indagini, che molto probabilmente riflettono l'allungamento generale degli sconvolgimenti delle indagini. Simile alla distribuzione degli errori di indagine, l'ultimo minuto degli intervalli è orientato verso valori brevi e deve essere ignorato.

Abbiamo anche analizzato le transizioni osservate nei soggetti da uno stimolo all'altro. Questo grafico viene visualizzato nella Figura 3P, in cui ogni momento in cui il soggetto ha iniziato a esaminare un nuovo stimolo è contrassegnato da un punto blu, ogni riga rappresenta un soggetto distinto e la linea rossa rappresenta la velocità di transizione media. Come risulta, il tasso di transizione è stato più alto (1,5 dollari di transizioni/min) durante i primi 2 min del test ed è stato gradualmente ridotto a meno del 50% del picco. La stessa tendenza è evidente dalla distribuzione del tasso di transizione media nel tempo (Figura 3Q).

Infine, durante il corso del test vengono mostrate le mappe di calore degli ostacoli di indagine verso lo stimolo sociale (Figura3R) e l'oggetto (Figura 3S) durante il corso del test per ogni soggetto, con i colori che contrassegnano la durata dell'incontro ( Figura 3S). Complessivamente, i risultati suggeriscono che nei topi C57Bl/6J, il test SP è grosso modo diviso in una fase esplorativa precoce (caratterizzata da un alto tasso di transizione e brevi cariche di indagine) e una fase di interazione tardiva (caratterizzata da basso tasso di transizione e lunghi sbecco di indagine).

Analisi della popolazione del test di preferenza della novità sociale nei ratti SD
La figura 4 mostra la stessa analisi di cui sopra per il test SNP eseguito da 59 ratti SD. Tipicamente, la preferenza di romanzo vs. stimoli sociali familiari è più debole della preferenza verso un nuovo stimolo sociale vs. un oggetto, esposto dai topi nel test SP (Figura 3). Tuttavia, la preferenza di novità sociale si riflette chiaramente in tutti i parametri. In particolare, come concluso in precedenza dal test SP nei topi, i lunghi sbucc di indagine e gli intervalli lunghi sono i parametri che mostrano più chiaramente le differenze tra gli stimoli, come si riflette dai loro più alti valori di RDI assoluti (Figura 4E,L; va notato che i valori RDI per il test SNP sono definiti come [romanzo familiare]/[romanzo familiare]).

La perdita di baffi compromette le preferenze sociali sia nei topi C57BL/6J che nei ratti SD
Per valutare gli effetti della manipolazione somatosensoriale sulla dinamica del comportamento sociale, è stata eseguita l'analisi del test SP completato da 29 topi C57BL/6J e 33 ratti SD dopo la guarnizione del baffo (condotto 3-7 giorni prima del test). Poi, questi risultati sono stati confrontati per controllare gli animali. Come mostrato nella Figura 5A-F, i topi con triturazione baffo non preferivano lo stimolo sociale rispetto all'oggetto, come riflesso dalla mancanza di differenza nel tempo di indagine tra i due stimoli (confrontare Figura 5A a Figura 5D) e la perdita di lunghe indagini contro gli stimoli sociali (confrontare figura 5B a Figura 5E). È interessante notare che i topi tagliati a baffi hanno anche mostrato un aumento dei tassi di transizione rispetto ai topi di controllo (confrontare Figura 5C con Figura 5F).

Complessivamente, questi dati suggeriscono che i topi tagliati a baffo hanno notevolmente ridotto la durata delle loro interazioni con lo stimolo sociale. A differenza dei topi, i ratti tagliati a baffo non hanno perso le loro preferenze sociali (Figura 5G-L). Tuttavia, hanno cambiato significativamente il loro comportamento durante il primo minuto del test, quando hanno avuto meno lunghi sbav di indagine (confrontare Figura 5H a Figura 5K) e molte altre transizioni (confrontare Figura 5I a Figura 5L). Così, il taglio dei baffi ha modificato significativamente il comportamento di entrambi i ratti e topi nel test SP, ma in modo molto diverso tra le due specie. Questi risultati suggeriscono un ruolo distinto per la stimolazione somatosensoriale dipendente dal baffo nelle interazioni sociali di ratti e topi.

Figura 1: configurazione sperimentale. (A) Una rappresentazione schematica dell'arena sperimentale progettata per topi con pelliccia nera. (B) Una foto dell'arena dall'alto, con luce rossa fioca, che mostra un topo soggetto C57BL/6J nell'arena. (C) Immagine che mostra l'area in rete di una camera bianca, attraverso la quale il soggetto interagisce con uno stimolo (insetto: l'immagine di uno stimolo di oggetto utilizzato per i topi). (D-F) Come mostrato nei pannelli A-C, un'arena sperimentale e camere progettate per topi con pelliccia luminosa. (G-I) Come mostrato nei pannelli A-C, un'arena sperimentale e camere progettate per ratti con pelliccia luminosa (incassata in [I]: immagine di uno stimolo oggetto utilizzato per i ratti). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: software TrackRodent. (A) Schermata di un computer che esegue il software TrackRodent. Sinistra: l'immagine video all'inizio del filmato analizzato (primo fotogramma scelto dallo sperimentatore), che mostra le aree di stimoli etichettati e il percorso di movimento tracciato del soggetto C57BL/6J. A destra: la GUI del software. (B) L'elenco dei codici opzionali del software da utilizzare con la GUI. Ognuno di questi codici si adatta a una condizione sperimentale distinta. (C) L'analisi dell'esperimento specifico mostrato nel pannello A, quando l'opzione di esplorazione Degli stimoli lungo la sessione è stata selezionata nella sezione di presentazione Risultati della GUI. Questo grafico mostra (ad ogni fotogramma) se il soggetto era in contatto con 'stimolo 1' o 'stimolo 2'. Nel caso presentato, una chiara preferenza verso lo "stimolo 2" è evidente dal numero e dalla durata più elevati degli scontri di indagine rilevati nei confronti di questo stimolo. (D) L'analisi dell'esperimento mostrata nei pannelli A e C, quando l'opzione del tempo totale di esplorazione degli stimoli è stata selezionata nella sezione Presentazione dei risultati della GUI. Anche in questo caso, una chiara preferenza verso lo "stimolo 2" è evidente dal più alto livello di tempo di indagine verso questo stimolo. (E) La GUI del software TrackRodentPopulationSummary che consente l'analisi e la tracciatura dei risultati di una popolazione di animali, ciascuno dei quali viene analizzato utilizzando il software TrackRodent (vedere la figura 3 per i risultati di tale analisi). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Analisi del comportamento investigativo dei mouse C57BL/6J durante il test SP utilizzando il software TrackRodent. Questa figura mostra i vari grafici di tutte le analisi facoltative del software TrackRodentPopulationSummary (Figura 2E) impiegato per una popolazione di 58 topi adulti C57BL/6J che eseguono il test SP. I vari grafici vengono visualizzati in un ordine e in modo simili come sono apparsi sullo schermo del computer (vedere la sezione dei risultati rappresentativi per una spiegazione dettagliata di ogni grafico). (A) Tempo totale di indagine sugli stimoli, (B) Indagine sugli stimoli lungo il tempo, (C) Brevi vs lunghi bout - tempo totale, (D) 1s bin istogramma di bouts, (E) Brevi vs lunghi bouts - RDI, (F) <6 s bouts lungo il tempo, (G) 6s bouts lungo il tempo, (H) >19 s bouts lungo il tempo, (I) Durata media dell'incontro lungo il tempo, (J) Brevi vs intervalli lunghi - tempo totale, (K) s bin histogram of intervals, (L) Short vs long intervalli - RDI, (M) <5 s intervalli lungo il tempo, (N) intervalli di 5-20 s lungo il tempo, (O) >20 s intervalli lungo il tempo, (P) Transizioni tra stimoli - grafico raster, (Q) Transizione tra stimoli lungo i tempi, (R) Mappa termica della durata dell'interruzione con sociale, (S) Heat-map of bout duration with object. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi del comportamento investigativo dei ratti SD durante il test SNP utilizzando il software TrackRodent. Grafici per tutte le analisi facoltative del software TrackRodentPopulationSummary (Figura 2E) impiegati per una popolazione di 59 ratti maschi adulti SD che eseguono il test SNP. I vari grafici vengono visualizzati in un ordine e in modo simili come sono apparsi sullo schermo del computer (vedere la sezione dei risultati rappresentativi per una spiegazione dettagliata di ogni grafico). (A-Q) Come descritto nella Figura 3. (R) Mappa termica della durata dell'incontro con Familiare, (S) Mappa termica della durata dell'incontro con Novel. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Il taglio baffi di topi e ratti compromette in modo differenziale il comportamento sociale. (A) Traccia del tempo medio di indagine (misurato in 20 s bidoni) durante il test SP per i topi maschi C57BL/6J (n - 58). (B) Distribuzione (1 min bin) del tempo medio totale di lunghi (>19 s) s bouts lungo il test SP mostrato nel pannello A per stimoli sociali e oggetto. Si noti il tempo molto più lungo di lunghi periodi di indagine verso lo stimolo sociale rispetto all'oggetto. (C) Distribuzione (1 min bin) del tasso di transizione durante il periodo del test SP mostrato in (A). (D-F) Come mostrato nei pannelli A-C, 29 baffi di topi sono stati tagliati circa 1 settimana prima del test. Questi animali hanno perso la loro preferenza sociale, come dimostrato dal tempo generale di indagine (D)e dalla distribuzione (E) di lunghi bout. Hanno anche mostrato un più alto tasso generale di transizioni (F), suggerendo interazioni meno sostenute con lo stimolo sociale. (G-I) Come mostrato nei pannelli A-C, 60 ratti SD hanno eseguito il test SP. Si noti la diversa dinamica del comportamento dei ratti rispetto ai topi, con tassi di transizione più bassi e lunghi periodi di lunghi periodi di indagine nella fase iniziale (2 min) del test. (J-L) Come mostrato nei pannelli G-H, 33 ratti sono stati tagliati a baffi. Si noti che mentre i ratti non hanno perso la preferenza sociale a seguito di piaghe-trimming come i topi ha fatto, la dinamica del loro comportamento sociale nei primi 2 min del test è stato cambiato, mostrando più transizioni e meno lunghi accouts. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il sistema sperimentale qui descritto, che è stato progettato come alternativa all'apparato a tre camere^2,5, consente di eseguire gli stessi test risolvendo alcuni dei suoi limiti. L'uso di camere triangolari, che si trovano in due angoli opposti dell'arena rettangolare, limita l'area di interazione soggetto-stimolo a un piano ben definito, consentendo così un'analisi automatizzata precisa del comportamento dell'indagine. Un vantaggio è l'uso del software di analisi (TrackRodent) per calcolare più parametri comportamentali per ogni test. Permette anche il riposizionamento delle camere in angoli opposti casuali dell'arena durante le varie fasi del paradigma, neutralizzando eventuali effetti delle abilità di navigazione spaziale.

Inoltre, i due angoli dell'arena, che vengono lasciati vuoti durante ogni tappa, offrono al soggetto un luogo conveniente per riposare e governare e allontanarlo dalle camere, riducendo al minimo i risultati falsi positivi. Così, il sistema consente la valutazione diretta della motivazione del soggetto per indagare ogni stimolo durante i test SP e SNP. Inoltre, poiché l'analisi comportamentale dei video viene eseguita in modo automatizzato dal software TrackRodent, uno sperimentatore può caricare più filmati per l'analisi, definire i parametri corretti per ciascuno e lasciare che il processo software durante la notte, risparmiando tempo prezioso. In particolare, il sistema può essere utilizzato per qualsiasi tipo di test di discriminazione sociale, come la discriminazione tra stimoli sociali maschili e femminili o stimoli di ceppi distinti. Inoltre, non ci sono limiti (superiore/inferiore) alle dimensioni dei soggetti che possono essere monitorati utilizzando questo sistema; pertanto, può essere utilizzato con giovani o animali obesi. Questo sistema sperimentale è economico e semplice da produrre, e i codici informatici utilizzati per l'analisi sono pubblicamente disponibili come codici open source, consentendo a qualsiasi laboratorio di adottare facilmente il metodo.

Il rilevamento automatico del comportamento di indagine nel sistema si basa sul rilevamento del contatto fisico tra i contorni del corpo di un soggetto e ciascuna delle aree definite dallo sperimentatore come "stimoli". Pertanto, se il soggetto tocca l'area degli "stimoli" con il suo corpo piuttosto che con la testa, questo evento è considerato investigativo (cioè un falso positivo). A tale scopo, è stato generato l'algoritmo basato sulla direzionalità della testa, che identifica la testa del soggetto e tiene conto solo del contatto tra la testa e gli "stimoli". Tuttavia, questo algoritmo viene eseguito significativamente più lentamente rispetto agli algoritmi basati sul corpo; quindi, non è raccomandato per l'analisi di un gran numero di film, a meno che le condizioni sperimentali lo richiedano.

Risultati simili sono stati osservati (1,1% di differenza, n - 11 esperimenti, 5 min ciascuno, dati non mostrati) tra i due algoritmi; pertanto, gli algoritmi basati sul corpo sono stati più spesso utilizzati. Va notato che, sebbene qui siano presentate analisi di grandi gruppi di animali, è necessaria una dimensione di gruppo molto più piccola per osservare una differenza statisticamente significativa tra due stimoli, in base al tempo totale di indagine misurato dal sistema. Ad esempio, i calcoli di potenza hanno rivelato che le dimensioni del campione di soli cinque e otto animali sono necessari rispettivamente per i test SP e SNP dei mouse (z 0,05, potenza e 0,8). Eppure, gruppi di animali significativamente più grandi sono stati utilizzati qui per garantire l'osservazione di tutte le dinamiche del comportamento sociale.

Il sistema richiede che lo sperimentatore definisca manualmente la soglia per il rilevamento dei contorni del corpo del soggetto. Trovare la giusta soglia da utilizzare può richiedere una certa esperienza; quindi, la maggior parte degli algoritmi utilizzati in questo sistema hanno versioni regolari e più lente. Queste versioni presentano il film analizzato e rilevare gli eventi di indagine online, mentre le loro versioni veloci non consentono la presentazione online. Si raccomanda ai nuovi utenti di utilizzare le versioni regolari e monitorare le analisi online per assicurarsi che funzioni correttamente e che utilizzino gli algoritmi "veloci" solo dopo aver raccolto l'esperienza con la procedura di analisi.

Un vantaggio di questo sistema rispetto al test a tre camere è che misura più parametri del comportamento dell'indagine, supportando così analisi più dettagliate. Questo vantaggio è duplice. In primo luogo, lo sperimentatore non deve fare affidamento esclusivamente sul tempo totale dell'indagine per determinare la preferenza. Si è constatato che i lunghi scontri di indagine e i lunghi intervalli sono più sensibili del tempo totale dell'indagine quando si rileva una preferenza di uno stimolo rispetto a un altro. Per quanto riguarda questi parametri, va notato che i loro valori durante l'ultimo minuto del test sono di parte verso il basso, come i lunghi periodi di indagine e gli intervalli sono prematuramente terminati alla fine della sessione di 5 minuti.

In secondo luogo, i molteplici parametri permettono di rilevare sottili cambiamenti nelle dinamiche dell'indagine sociale a seguito di varie manipolazioni. Ad esempio, si è scoperto che i topi maschi C57BL/6J hanno perso la loro preferenza sociale dopo il taglio del baffo. Al contrario, i ratti maschi SD mantennero la loro preferenza sociale, ma cambiarono le dinamiche di comportamento sociale come mostrato da brevi sbucc di indagine e un più alto livello di transizioni nella fase iniziale del test. Nel complesso, questi dati suggeriscono una riduzione della tendenza di ratti e topi per le interazioni sociali dopo il taglio del baffo. Pertanto, questo sistema supporta un'analisi rigorosa delle dinamiche del comportamento sociale, che possono essere altamente sensibili a varie manipolazioni.

In sintesi, abbiamo presentato qui un nuovo, semplice e conveniente sistema sperimentale che supporta l'analisi automatizzata delle dinamiche di comportamento di indagine sociale. Questo sistema faciliterà analisi dettagliate dei deficit comportamentali sociali in vari ceppi e linee geneticamente modificate di piccoli roditori. Inoltre, il rilevamento preciso degli scongiuri di indagine dimostrato qui, combinato con la capacità di questo sistema di analizzare il comportamento mentre i soggetti sono collegati a cavi elettrici o fibre ottiche, consente il suo utilizzo in esperimenti che coinvolgono la registrazione dell'attività cerebrale associata al comportamento sociale.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flea3 1.3 MP Mono USB3 Vision	FLIR (formerly PointGrey)	FL3-U3-13Y3M-C	Monochromatic Camera
FlyCap 2.0	FLIR (formerly PointGrey)	FlyCapture 2.13.3.61X64	Video recording software
Home 5 minute Epoxy glue	Devocon	20845	For gluing the metal mesh to the Plexiglas stimuli chambers
Matlab 2014-2019	MathWorks	R2014a - R2019a	Programming environment
Plexiglas boards (6 mm thickBlack or white)	Melina (1990) LTD, Israel	NaN	For arena and stimuli chambers construction
Red led strips (60 leds per meter) connected to a 12 V power supply	2012topdeal eBay supplier	NaN	For illumination of the acoustic chamber