מבוזרים (Ex Vivo) מורלין מודל שלפוחית השתן עם השריר הדטראאור הוסר עבור גישה ישירה Suburothelium במהלך מילוי שלפוחית השתן
Summary
מודל שלפוחית השתן מאפשר גישה ישירה לסובורוטנום כדי ללמוד מנגנונים מקומיים לוויסות זמינות מגשרת פעילה ביולוגית בסווברואלינום/לאמה קינאה במהלך אחסון ובדיקת שתן. ההכנה דומה מאוד למילוי של שלפוחית השתן והיא מאפשרת לבצע מחקרים בלחץ-נפח שיבוצעו ללא השפעות מערכתיות.
Abstract
מחקרים קודמים הקימו את שחרורו של חומרים כימיים מן הסדינים שטוח רירית השלפוחית מודבקת בתאי Ussing וחשופים שינויים בלחץ הידרוסטטי או למתוח מכני ומתאי אורוטאליאל מתורבת על שינויי לחץ הידרוסטטי, למתוח, תא נפיחות, או לגרור כוחות, ובשלפוחית השתן בסוף מילוי. ממצאים כאלה הובילו את ההנחה כי מגשרים אלה שוחררו גם suburothelium (SubU)/lamina קינא (LP) במהלך מילוי שלפוחית השתן, שם הם משפיעים על התאים עמוק בקיר שלפוחית השתן כדי להסדיר בסופו של דבר את שלפוחית השתן. יש לפחות שתי מגבלות ברורות במחקרים כאלה: 1. אף אחת מגישות אלה אינה מספקת מידע ישיר על נוכחות המגשרים בסובו/LP, ו-2) הגירויים ששימשו אינם פיסיולוגיים ואינם ממלאים את השלפוחית במילוי אותנטי של שלפוחית השתן. כאן, אנו דנים הליך המאפשר גישה ישירה אל פני השטח suburothelial של רירית שלפוחית השתן במהלך מילוי שלפוחית השתן. ההכנה המבטלת-חופשית שיצרנו דומה מאוד למילוי של שלפוחית השתן ומאפשרת מחקרים בלחץ-נפח שיבוצעו על שלפוחית השתן בהעדר איתות מתוך רפלקסים מעמוד השדרה והשריר החלק. באמצעות מודל שלפוחית השתן הרומן הספר, הדגמנו לאחרונה כי מדידות הפנימי של המגשרים אינם יכולים לשמש כפרוקסי למה שוחרר או נוכח SubU/LP במהלך מילוי שלפוחית השתן. המודל מאפשר בדיקת מולקולות איתות נגזרות מסוג urothelium שפורסמו, שנוצר על-ידי חילוף החומרים ו/או מועברים לתוך SubU/LP במהלך מילוי שלפוחית השתן כדי להעביר מידע לנוירונים ושריר חלק של שלפוחית השתן ולווסת את הרגש שלה במהלך המשך ו-micturition.
Introduction
מטרת מודל זה היא לאפשר גישה ישירה לצד submucosal של רירית שלפוחית השתן במהלך שלבים שונים של מילוי שלפוחית השתן.
שלפוחית השתן חייבת להימנע התכווצות מוקדמת במהלך מילוי וריק כאשר הנפח הקריטי והלחץ מגיעים. מסלול לא תקין או הרקה של שתן משויכים לעתים קרובות עם מרגש נורמלי של שריר הדטרואו חלק (DSM) במהלך מילוי שלפוחית השתן. הרגש של DSM נקבע על ידי גורמים פנימיים לתאי השריר חלקה ועל ידי השפעות שנוצרו על ידי סוגי תאים שונים בתוך הקיר שלפוחית השתן. הקיר של שלפוחית השתן מורכב מאורואלינום (רירית), סובורוטנום (SubU)/לאמינה קינאה (LP), שריר החלקה (DSM) ו serosa (איור 1A). האורוטנום מורכב מתאי מטריה (כלומר, השכבה החיצונית ביותר של האורואלינום), תאי ביניים ותאי בסיס (כלומר, השכבה הפנימית ביותר של האורואלינום). סוגים שונים של תאים, כולל תאים ביניים, תאי מסופים, מסופי עצבים כלי לימפה, כלי דם קטנים, ותאים חיסוניים שוכנים subu/LP. ההנחה היא ששלפוחית השתן היא עוגב חושי היוזם מיקרו-מתווכים של רפלקס ומוסר על ידי שחרור המגשרים לתוך רירית המשנה המשפיעים על התאים ב-subu/LP ו-DSM1,2,3. לרוב, הנחות כאלה מבוססות על מחקרים שהפגינו שחרור מגשרים: מפיסות רירית חשופים לשינויים בלחץ ההידרוסטטי4,5; מתוך מגוון התאים המתורבתות חשופים למתיחה6,7, היפוטונזה המושרה תא נפיחות7 או לגרור כוחות8; מתוך שלפוחית בודדה רצועות קיר על הקולטן או הפעלה עצביים9,10,11,12,13,14; ובשלפוחית השתן לומן בסוף שלפוחית השתן מילוי15,16,17,18,19. בעוד שמחקרים כאלה היו אינסטרומנטלי להפגין שחרור של מגשרים על גירוי מכני של מקטעי קיר שלפוחית השתן או תאים מתורבתים של אורוטאליאל, הם צריכים להיות נתמכים על ידי ראיות ישירות לשחרור של מגשרים ברירית המשנה כי הוא הרוויח על ידי גירויים פיסיולוגיים לשכפל מילוי שלפוחית השתן. זוהי משימה מאתגרת בהתחשב בעובדה SubU/LP ממוקם עמוק בתוך הקיר שלפוחית השתן מכניסה את הגישה הישירה לקרבת SubU/LP במהלך מילוי שלפוחית השתן.
כאן, אנו להמחיש מבוזר (ex vivo) מודל שלפוחית השתן murine עם שריר השריר הוסר13 אשר פותחה כדי להקל על מנגנונים מקומיים של המנגנון המנגנון השתתפות האיתות בין שלפוחית השתן urothelium, DSM וסוגי תאים אחרים בקיר שלפוחית השתן. גישה זו היא מעולה לשימוש סדינים שטוח הקיר, רצועות הקיר שלפוחית השתן או התאים התרבותיים אורוטאליאל משום שהוא מאפשר מדידות ישירה בקרבת SubU/LP של urothelial המגשרים, כי הם שוחרר או הוקמה בתגובה ללחצים פיזיולוגיים וכלי שלפוחית השתן וימנע השינויים הפוטנציאליים בתרבות התא ניתן להשתמש בו כדי למדוד זמינות, שחרור, חילוף החומרים והעברת התחבורה של המגשרים SubU/LP בשלבים שונים של מילוי שלפוחית השתן (איור 1B). ההכנה יכולה לשמש גם כדי לבחון את האיתות האורואליאל והמכונה במודלים של תסמונות שלפוחית השתן הפרוע.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלפוחית השתן יש שתי פונקציות: אחסון ו-ווצמה של שתן. הפעולה הרגילה של פונקציות אלה דורש חישה מכנית נאותה של נפח intraluminal והלחץ והתמרה של אותות דרך תאים בקיר שלפוחית השתן כדי לווסת את השרירים שרירים או מרגש. רירית שלפוחית השתן (אורוטאלינום) הוא האמין לווסת את הרגש שלפוחית השתן על ידי שחרור מגוו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות גרנט DK41315.
Materials
| CaCl2 | Fisher | C79 | Source flexible |
| Dextrose | Fisher | D16 | Source flexible |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Source flexible |
| Infusion Pump | Kent Scientific | GenieTouch | Source flexible |
| KCl | Fisher | P217 | Source flexible |
| KH2PO4 | Fisher | P284 | Source flexible |
| Light source | SCHOTT ACEI | Source flexible | |
| Microscope | Olympus SZX7 | Flexible to use any scope | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | Source flexible |
| NaCl | Fisher | S671 | Source flexible |
| NaHCO3 | Fisher | S233 | Source flexible |
| Needles 25G | Becton Dickinson | 305122 | Source flexible |
| Organ bath | Custom made | Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish | |
| PE-20 tubing | Intramedic | 427405 | Source flexible |
| Pressure transducer | AD instrument | Source flexible | |
| S&T Forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | Source flexible |
| Software pressure-volume | AD Instruments | Power lab | |
| Suture Nylon, 6-0 | AD surgical | S-N618R13 | Source flexible |
| Suture Silk, 6-0 | Deknatel via Braintree Scientific, Inc. | 07J1500190 | Source flexible |
| Syringes 1 ml | Becton Dickinson | 309602 | Source flexible |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Source flexible |
| Water circulator | Baxter | K-MOD 100 | Source flexible |
References
- Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).
- Fry, C. H., Vahabi, B. The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. , 57-62 (2016).
- Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder. Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).
- Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes–a possible sensory mechanism?. Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).
- Wang, E. C., et al. ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells. Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).
- Miyamoto, T., et al. Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).
- Mochizuki, T., et al. The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).
- McLatchie, L. M., Fry, C. H. ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved. BJU International. 115, 987-993 (2015).
- Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder. American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).
- Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release. Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).
- Birder, L. A., et al. Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).
- Birder, L. A., et al. Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells. Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).
- Yoshida, M., et al. Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium. Urology. 67, 425-430 (2006).
- Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).
- Collins, V. M., et al. OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium. BJU International. 112, 1018-1026 (2013).
- Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder. Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).
- Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders. American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).
- Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability. Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).
