Mesane Dolgusu Sırasında Suburothelium Doğrudan Erişim için Kaldırılan Detrusor Kas ile Ademi Merkeziyet (Ex Vivo) Murine Mesane Modeli
Summary
Detrusor içermeyen mesane modeli, idrarın depolanması ve boşaltılmasını sırasında suburothelium/lamina propria’da biyolojik olarak aktif mediatör bulunabilirliğinin düzenlenmesi için yerel mekanizmaları incelemek için suburothelium’a doğrudan erişim sağlar. Hazırlık, bozulmamış bir mesanenin doldurulmasını çok benzer şekilde andırır ve basınç hacmi çalışmalarının sistemik etkiler olmadan yapılmasını sağlar.
Abstract
Daha önceki çalışmalar, Ussing odalarına yapıştırılmış ve hidrostatik basınç veya mekanik streç teki değişikliklere maruz kalan düz mesane mukozalarından ve hidrostatik basınç değişiklikleri, esneme, hücre şişmesi veya sürükleme kuvvetleri üzerine kültürlü ürotelyal hücrelerden ve dolgu sonunda mesane lümeninde kimyasal maddelerin salınımını ortaya çıkarmış. Bu bulgular, bu mediatörlerin mesane dolgusu sırasında suburothelium (SubU)/lamina propria (LP) olarak da salındıkları ve mesane duvarının derinliklerindeki hücreleri etkileyip mesane uyarılabilirliğini düzenleyeceği varsayımına yol açmıştır. Bu tür çalışmalarda en az iki belirgin sınırlama vardır: 1) Bu yaklaşımların hiçbiri SubU/LP’de arabulucuların varlığı hakkında doğrudan bilgi sağlamaz ve 2) kullanılan uyaranlar fizyolojik değildir ve mesanenin otantik dolgusunu tekrarlamaz. Burada, mesane dolgusu seyrinde mesane mukozasının suburothelial yüzeyine doğrudan erişim sağlayan bir prosedürü tartışıyoruz. Oluşturduğumuz mürin detrusorsuz preparat, bozulmamış mesanenin doldurulmasını çok benzer şekilde andırır ve omurilik refleksleri ve detrusor düz kaslardan gelen kafa karıştırıcı sinyal yokluğunda mesane üzerinde basınç-hacim çalışmalarıyapılmasını sağlar. Yeni detrusor içermeyen mesane modelini kullanarak, yakın zamanda arabulucuların intravesical ölçümlerinin mesane dolgusu sırasında SubU/LP’de salınan veya mevcut olan alabilen lere vekil olarak kullanılamayacağını gösterdik. Model, mesane dolumu sırasında metabolizma tarafından üretilen ve/veya SubU/LP’ye taşınan ürotelyum kaynaklı sinyal moleküllerinin incelenmesini sağlayarak mesanenin nöronlarına ve düz kaslarına bilgi aktarımı sağlar ve kontinent ve mikturition sırasında uyarılabilirliğini düzenler.
Introduction
Bu modelin amacı mesane dolgu farklı aşamalarında mesane mukozasının submukozal tarafına doğrudan erişim sağlamaktır.
Kritik hacim ve basınca ulaşıldığında mesane dolum sırasında erken kasılma ve boşalmaktan kaçınmalıdır. Anormal kontinans veya idrar voiding sık sık mesane dolgu seyrinde detrusor düz kas (DSM) anormal uyarılabilirlik ile ilişkilidir. DSM’nin uyarılabilirliği, düz kas hücrelerine özgü faktörler ve mesane duvarı içindeki farklı hücre tiplerinin ürettiği etkiler le belirlenir. Üriner mesanenin duvarı ürotelium (mukoza), suburothelium (SubU)/lamina propria (LP), detrusor düz kas (DSM) ve serosa ‘dan(Şekil 1A)oluşur. Ürotelyum şemsiye hücrelerden (yani, ürotelyumun en dış tabakası), ara hücrelerden ve bazal hücrelerden (yani ürotelin en iç tabakasından) oluşur. Interstisyel hücreler, fibroblastlar, afferent sinir terminalleri, küçük kan damarları ve bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli hücre türleri SubU/LP’de bulunur. Bu yaygın mesane ürotelyyum SubU / LP ve DSM hücreleri etkileyen submukoza içine arabulucu bırakarak refleks micturition ve kontinansbaşlatan bir duyu organı olduğu varsayılır1 ,2,3. Çoğunlukla, bu tür varsayımlar arabulucuların salınımını göstermiştir çalışmalara dayanmaktadır: hidrostatik basınçdeğişiklikleremaruz mukoza parçalarından 4,5; streç maruz kültürlü ürotellial hücrelerden6,7, hipotonisite kaynaklı hücreşişme7 veya sürükleme kuvvetleri8; reseptör veya sinir aktivasyonu üzerineizole mesane duvar şeritleri 9,10,11,12,13,14; ve mesane lümeni sonunda mesane dolgusularında 15,16,17,18,19. Bu tür çalışmalar mesane duvarı segmentleri veya kültürlü ürotelyal hücrelerin mekanik stimülasyon üzerine arabulucuların salınımını göstermek için etkili iken, onlar mesane dolgu üretmek fizyolojik uyaranlarla ortaya çıkan submukoza da arabulucuların serbest bırakılması için doğrudan kanıt tarafından desteklenmesi gerekir. Bu SubU / LP mesane duvarının derin mesane dolgu sırasında SubU / LP çevresine doğrudan erişim engel bulunan verilen zor bir görevdir.
Burada, mesane ürotelyumu, DSM ve mesane duvarındaki diğer hücre tipleri arasındaki sinyalizasyona katılan mechanotransdüksiyonun lokal mekanizmaları üzerinde çalışmaları kolaylaştırmak için geliştirilen detrusor kası13 ile ademi merkeziyetçi (ex vivo) murine mesane modelini gösteriyoruz. Bu yaklaşım düz mesane duvar tabakaları, mesane duvar şeritleri veya kültürlü ürotelyal hücreler kullanmaktan daha üstündür, çünkü mesanedeki fizyolojik basınç ve hacimlere yanıt olarak serbest bırakılan veya oluşan ürotenyum kaynaklı mediatörlerin SubU/LP çevresinde doğrudan ölçümlere izin verir ve hücre kültüründeki potansiyel henotypik değişimleri önler. SubU/LP’deki arabulucuların mesane dolgusu farklı aşamalarında kullanılabilirliğini, salınımını, metabolizmasını ve transurothelial naklini ölçmek için kullanılabilirliği, salınımını, metabolizmasını ve transurothelial naklini ölçmek için kullanılabilir(Şekil 1B). Hazırlık ayrıca aşırı aktif ve az aktif mesane sendromları modellerinde ürotelyal sinyalizasyon ve mekanotransdüksiyon uzerinde nisrarl incelemede de kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mesanenin iki işlevi vardır: idrarın depolanması ve boşaltılsa. Bu fonksiyonların normal çalışması, detrusor kas uyarılabilirliğini düzenlemek için intraluminal hacim ve basıncın ve sinyallerin mesane duvarındaki hücreler den aktarılmasını uygun mekanik algılamayı gerektirir. Mesane mukozasının (ürotelyum) SubU/LP’de mesane duvarındaki çok sayıda hücre tipini etkileyen çeşitli sinyal molekülleri salarak mesane uyarılabilirliğini düzenlediğine inanılmaktadır. Şu anda, ürotelyum ka…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Diyabet Enstitüsü ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Hibe DK41315 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| CaCl2 | Fisher | C79 | Source flexible |
| Dextrose | Fisher | D16 | Source flexible |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Source flexible |
| Infusion Pump | Kent Scientific | GenieTouch | Source flexible |
| KCl | Fisher | P217 | Source flexible |
| KH2PO4 | Fisher | P284 | Source flexible |
| Light source | SCHOTT ACEI | Source flexible | |
| Microscope | Olympus SZX7 | Flexible to use any scope | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | Source flexible |
| NaCl | Fisher | S671 | Source flexible |
| NaHCO3 | Fisher | S233 | Source flexible |
| Needles 25G | Becton Dickinson | 305122 | Source flexible |
| Organ bath | Custom made | Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish | |
| PE-20 tubing | Intramedic | 427405 | Source flexible |
| Pressure transducer | AD instrument | Source flexible | |
| S&T Forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | Source flexible |
| Software pressure-volume | AD Instruments | Power lab | |
| Suture Nylon, 6-0 | AD surgical | S-N618R13 | Source flexible |
| Suture Silk, 6-0 | Deknatel via Braintree Scientific, Inc. | 07J1500190 | Source flexible |
| Syringes 1 ml | Becton Dickinson | 309602 | Source flexible |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Source flexible |
| Water circulator | Baxter | K-MOD 100 | Source flexible |
References
- Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).
- Fry, C. H., Vahabi, B. The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. , 57-62 (2016).
- Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder. Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).
- Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes–a possible sensory mechanism?. Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).
- Wang, E. C., et al. ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells. Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).
- Miyamoto, T., et al. Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).
- Mochizuki, T., et al. The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).
- McLatchie, L. M., Fry, C. H. ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved. BJU International. 115, 987-993 (2015).
- Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder. American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).
- Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release. Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).
- Birder, L. A., et al. Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).
- Birder, L. A., et al. Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells. Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).
- Yoshida, M., et al. Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium. Urology. 67, 425-430 (2006).
- Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).
- Collins, V. M., et al. OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium. BJU International. 112, 1018-1026 (2013).
- Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder. Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).
- Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders. American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).
- Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability. Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).
