En desentralisert (ex vivo) murine blære modell med Detrusor muskelen fjernet for direkte tilgang til Suburothelium under blære fylling
Summary
Den detrusor-frie blæren modellen gir direkte tilgang til suburothelium å studere lokale mekanismer for regulering av biologisk aktive mekler tilgjengelighet i suburothelium/lamina propria under lagring og annullering av urin. Forberedelsene ligner fylling av en intakt blære og gjør at trykk-volum studier skal utføres uten systemiske påvirkninger.
Abstract
Tidligere studier har etablert utgivelsen av kjemiske stoffer fra flat blære mucosa ark festet i ussing kamre og utsatt for endringer i hydrostatisk trykk eller mekanisk strekk og fra kultivert urotelialt celler på hydrostatisk trykk endringer, strekk, celle hevelse, eller dra krefter, og i blæren lumen på slutten av fylling. Slike funn førte til antagelsen om at disse meglere er også utgitt i suburothelium (SubU)/lamina propria (LP) under blære fylling, hvor de påvirker celler dypt i blæren veggen til slutt regulere blæren excitability. Det er minst to åpenbare begrensninger i slike studier: 1) ingen av disse tilnærmingene gir direkte informasjon om tilstedeværelsen av meglere i SubU/LP, og 2) stimuli som brukes er ikke fysiologiske og ikke recapitulate autentisk fylling av blæren. Her diskuterer vi en prosedyre som gir direkte tilgang til den suburothelial overflaten av blæren mucosa i løpet av blæren fylling. Den murine detrusor-fri forberedelse vi skapte ligner fylling av intakt blæren og tillater trykk-volum studier som skal utføres på blæren i fravær av forvirrende signalering fra spinal reflekser og detrusor glatt muskel. Ved hjelp av romanen detrusor-fri blære modell, vi nylig viste at intravesical målinger av meglere ikke kan brukes som en proxy til hva som er utgitt eller finnes i SubU/LP under blære fylling. Modellen muliggjør undersøkelse av urothelium-avledet signalering molekyler som er utgitt, generert av metabolisme og/eller transporteres inn i SubU/LP i løpet av blæren fylling å overføre informasjon til neurons og glatte muskelen i blæren og regulere sin excitability under continence og vannlating.
Introduction
Hensikten med denne modellen er å muliggjøre direkte tilgang til den submucosal siden av blæren mucosa under ulike faser av blæren fylling.
Blæren må avstå fra for tidlig sammentrekning under fylling og tom når kritisk volum og trykk er nådd. Unormal continence eller annullering av urin er ofte forbundet med unormal excitability av den detrusor glatte muskelen (DSM) i løpet av blære fylling. Excitability av DSM bestemmes av faktorer som er iboende til den glatte muskelceller og ved påvirkninger generert av ulike celletyper i blæren veggen. Veggen av urin blæren består av urothelium (mucosa), suburothelium (SubU)/lamina propria (LP), detrusor glatt muskel (DSM) og serosa (figur 1a). Urothelium består av paraply celler (dvs. det ytterste laget av urothelium), mellomliggende celler og basal celler (dvs. det innerste laget av urothelium). Ulike typer celler, inkludert interstitiell celler, fibroblaster, afferente nerve terminaler, små blodkar, og immunceller bor i SubU/LP. Det er allment antatt at blæren urothelium er en sensorisk organ som initierer refleks vannlating og continence ved å slippe meglere i submukosa som påvirker cellene i SubU/LP og DSM1,2,3. For det meste er slike forutsetninger basert på studier som har vist utgivelsen av meglere: fra biter av mucosa utsatt for endringer i hydrostatisk trykk4,5; fra kultivert urotelialt celler utsatt for strekk6,7, hypotonicity-indusert celle hevelse7 eller drag styrker8; fra isolerte blære vegg strimler ved reseptor eller nerve aktivering9,10,11,12,13,14; og i blæren lumen på slutten av blæren fylle15,16,17,18,19. Mens slike studier var medvirkende til å demonstrere utgivelsen av meglere ved mekanisk stimulering av blære vegg segmenter eller kultivert urotelialt celler, må de støttes av direkte bevis for frigjøring av meglere i submukosa som er elicited av fysiologiske stimuli som reproduserer blære fylling. Dette er en utfordrende oppgave gitt at SubU/LP ligger dypt i blæreveggen hindrer enkel tilgang til nærheten av SubU/LP under blære fylling.
Her illustrerer vi en desentralisert (ex vivo) murine blære modell med detrusor muskelen fjernet13 som ble utviklet for å lette studier på lokale mekanismer for mechanotransduction som deltar i signalering mellom blæren urothelium, DSM og andre celletyper i blæren veggen. Denne tilnærmingen er overlegen ved hjelp av flat blæreveggen ark, blære vegg strimler eller kultivert urotelialt celler fordi det tillater direkte målinger i nærheten av SubU/LP av urothelium-avledet meglere som er utgitt eller dannet som svar på fysiologiske trykk og volumer i blæren og unngår potensielle fenotypiske endringer i celle kulturen. Den kan brukes til å måle tilgjengelighet, utgivelse, metabolisme og transurothelial transport av meglere i SubU/LP på ulike stadier av blære fylling (figur 1B). Preparatet kan også brukes til å undersøke urotelialt signalering og mechanotransduction i modeller av overaktiv og underactive blære syndromer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Blæren har to funksjoner: lagring og annullering av urin. Normal drift av disse funksjonene krever riktig mekanisk sensing av intraluminal volum og trykk og Transduction av signaler gjennom celler i blæren veggen for å regulere detrusor muskel excitability. Blæren mucosa (urothelium) antas å regulere blæren excitability ved å slippe en rekke signalering molekyler i SubU/LP som påvirker mange celletyper i blæren veggen. For tiden, de fleste forsøk på karakterisering av urothelium-avledede meglere innebære bruk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institute of diabetes og fordøyelses-og nyre sykdommer Grant DK41315.
Materials
| CaCl2 | Fisher | C79 | Source flexible |
| Dextrose | Fisher | D16 | Source flexible |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Source flexible |
| Infusion Pump | Kent Scientific | GenieTouch | Source flexible |
| KCl | Fisher | P217 | Source flexible |
| KH2PO4 | Fisher | P284 | Source flexible |
| Light source | SCHOTT ACEI | Source flexible | |
| Microscope | Olympus SZX7 | Flexible to use any scope | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | Source flexible |
| NaCl | Fisher | S671 | Source flexible |
| NaHCO3 | Fisher | S233 | Source flexible |
| Needles 25G | Becton Dickinson | 305122 | Source flexible |
| Organ bath | Custom made | Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish | |
| PE-20 tubing | Intramedic | 427405 | Source flexible |
| Pressure transducer | AD instrument | Source flexible | |
| S&T Forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | Source flexible |
| Software pressure-volume | AD Instruments | Power lab | |
| Suture Nylon, 6-0 | AD surgical | S-N618R13 | Source flexible |
| Suture Silk, 6-0 | Deknatel via Braintree Scientific, Inc. | 07J1500190 | Source flexible |
| Syringes 1 ml | Becton Dickinson | 309602 | Source flexible |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Source flexible |
| Water circulator | Baxter | K-MOD 100 | Source flexible |
References
- Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).
- Fry, C. H., Vahabi, B. The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. , 57-62 (2016).
- Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder. Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).
- Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes–a possible sensory mechanism?. Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).
- Wang, E. C., et al. ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells. Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).
- Miyamoto, T., et al. Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).
- Mochizuki, T., et al. The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).
- McLatchie, L. M., Fry, C. H. ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved. BJU International. 115, 987-993 (2015).
- Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder. American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).
- Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release. Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).
- Birder, L. A., et al. Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).
- Birder, L. A., et al. Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells. Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).
- Yoshida, M., et al. Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium. Urology. 67, 425-430 (2006).
- Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).
- Collins, V. M., et al. OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium. BJU International. 112, 1018-1026 (2013).
- Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder. Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).
- Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders. American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).
- Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability. Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).
