Summary
Het detrusor vrije blaas model maakt directe toegang tot het suburothelium mogelijk om lokale mechanismen te bestuderen voor regulatie van biologisch actieve mediator beschikbaarheid in suburothelium/lamina propria tijdens opslag en het vernietigen van urine. Het preparaat lijkt sterk op het vullen van een intacte blaas en maakt het mogelijk om druk volume studies te verrichten zonder systemische invloeden.
Abstract
Eerdere studies hebben het vrijkomen van chemische stoffen uit platte blaas slijmvlies bladen vastgesteld in Ussing kamers en blootgesteld aan veranderingen in hydrostatische druk of mechanisch stretch en uit gekweekte oerotheliale cellen bij hydrostatische drukveranderingen, Stretch, celzwelling, of sleep krachten, en in blaas lumen aan het einde van het vullen. Dergelijke bevindingen leidden tot de veronderstelling dat deze bemiddel kers ook vrijkomen in suburothelium (SubU)/lamina propria (LP) tijdens blaas vulling, waar ze de cellen diep in de blaaswand beïnvloeden om uiteindelijk de prikkelbaarheid van de blaas te reguleren. Er zijn ten minste twee duidelijke beperkingen in dergelijke studies: 1) geen van deze benaderingen bieden directe informatie over de aanwezigheid van mediatoren in SubU/LP, en 2) de gebruikte stimuli zijn niet fysiologisch en niet recapituleren authentieke vulling van de blaas. Hier bespreken we een procedure die directe toegang tot het suburotheliale oppervlak van het blaas slijmvlies in het verloop van de blaas vulling mogelijk maakt. De Murine detrusor-vrije bereiding die we hebben gemaakt, lijkt sterk op het vullen van de intacte blaas en maakt het mogelijk om druk volume studies op de blaas uit te voeren bij afwezigheid van verstorende signalering uit spinale reflexen en detrusor gladde spieren. Met behulp van het Roman detrusor-Free blaas model hebben we onlangs aangetoond dat intravesicale metingen van mediatoren niet kunnen worden gebruikt als een proxy voor wat is vrijgegeven of aanwezig in de SubU/LP tijdens blaas vulling. Het model maakt onderzoek mogelijk van urothelium-afgeleide signaal moleculen die vrijkomen, gegenereerd door metabolisme en/of getransporteerd naar de SubU/LP tijdens de blaas vulling om informatie naar neuronen en gladde spieren van de blaas te zenden en de prikkelbaarheid te reguleren tijdens continentie en mictie.
Introduction
Het doel van dit model is om directe toegang tot de submucosale kant van de blaas mucosa tijdens verschillende fasen van de blaas vulling mogelijk te maken.
De blaas moet afzien van voortijdige contractie tijdens het vullen en leeg zijn wanneer kritische volume en druk worden bereikt. Abnormale continentie of het vernietigen van urine worden vaak geassocieerd met abnormale prikkelbaarheid van de detrusor gladde spieren (DSM) in de loop van de blaas vulling. De prikkelbaarheid van DSM wordt bepaald door factoren die inherent zijn aan de gladde spiercellen en door invloeden die worden gegenereerd door verschillende celtypen binnen de blaaswand. De wand van de urineblaas bestaat uit urothelium (slijmvlies), suburothelium (SubU)/lamina propria (LP), detrusor gladde spieren (DSM) en serosa (Figuur 1a). Het urothelium bestaat uit paraplu cellen (d.w.z. de buitenste laag van het urothelium), intermediaire cellen en basale cellen (d.w.z. de binnenste laag van het urothelium). Verschillende soorten cellen, waaronder interstitiële cellen, fibroblasten, afferente zenuw terminals, kleine bloedvaten en immuuncellen bevinden zich in de SubU/LP. Er wordt algemeen verondersteld dat het blaas-urothelium een sensorisch orgaan is dat reflex mictie en continentie initieert door middel van mediatoren in de de die cellen in de subu/LP en de DSM1,2,3beïnvloeden. Voor het grootste deel zijn dergelijke veronderstellingen gebaseerd op studies die hebben aangetoond dat mediatoren vrijkomen: van stukjes slijmvlies blootgesteld aan veranderingen in hydrostatische druk4,5; van gekweekte oerotheliale cellen blootgesteld aan stretch6,7, hypotoniteit-geïnduceerde cel zwelling7 of sleep krachten8; van geïsoleerde blaaswand stroken op receptor of zenuw activatie9,10,11,12,13,14; en in blaas lumen aan het einde van de blaas vulling15,16,17,18,19. Hoewel dergelijke studies instrumentaal waren om het vrijkomen van bemiddel kers bij mechanische stimulatie van blaaswand segmenten of gekweekte oerotheliale cellen aan te tonen, moeten ze worden ondersteund door direct bewijs voor het vrijkomen van mediatoren in de de die wordt opgewekt door fysiologische stimuli die blaas vulling reproduceren. Dit is een uitdagende taak gezien het feit dat de SubU/LP zich diep in de blaaswand bevindt die de eenvoudige toegang tot de nabijheid van SubU/LP belemmert tijdens het vullen van de blaas.
Hier illustreren we een gedecentraliseerd (ex vivo) Murine blaas model met de detrusor spier verwijderd13 die werd ontwikkeld om studies te faciliteren over lokale mechanismen van mechanotransductie die deelnemen aan de signalering tussen de blaas-urothelium, DSM en andere celtypen in de blaaswand. Deze aanpak is superieur aan het gebruik van platte blaaswand vellen, blaaswand stroken of gekweekte urotheliale cellen, omdat het directe metingen toelaat in de nabijheid van SubU/LP van urothelium-afgeleide bemiddel kers die vrijkomen of gevormd worden als reactie op fysiologische druk en volumes in de blaas en voorkomt mogelijke fenotypische veranderingen in de celcultuur. Het kan worden gebruikt voor het meten van beschikbaarheid, vrijkomen, metabolisme en transurotheliaal transport van mediatoren in SubU/LP in verschillende stadia van blaas vulling (Figuur 1b). De bereiding kan ook worden gebruikt om de urotheliale signalering en mechanotransductie in modellen van overactieve en onderactieve blaas syndromen te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures met betrekking tot dieren die in dit manuscript worden beschreven, zijn uitgevoerd volgens de National Institutes of Health Guide voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en het institutionele dierengebruiks-en zorg Comité van de Universiteit van Nevada.
Opmerking: het hier gepresenteerde model bestaat uit het verwijderen van de detrusor spier terwijl het urothelium en subu/LP intact blijven (Figuur 1B) om onderzoekers in staat te stellen direct toegang te krijgen tot subu/LP in het verloop van de blaas vulling.
1. dissectie van de detrusor-vrije blaas voorbereiding
- Plaats de geïsoleerde blaas in een afsnij schaal gevuld met koud (10 °C) en met zuurstoftoevoer met 5% CO2/95% O2 Krebs BICARBONAAT oplossing (KBS) met de volgende samenstelling (mm): 118,5 NaCl, 4,2 KCl, 1,2 mgcl2, 23,8 NaHCO3, 1,2 KH2po4, 11,0 dextrose, 1,8 CACL2 (pH 7,4)13.
- Speld een klein deel van de koepel van de geïsoleerde blaas aan een door Sylgard bedekte dissectie schotel gevuld met KBS. Zorg ervoor dat de PIN gaat door een stuk van de serosa of de buitenste rand van de detrusor spier ver van de binnenste rand van de spier die wordt geconfronteerd met de SubU/LP.
- Identificeer met behulp van een microscoop de urethra en urineleiders en speld elk van hen aan de onderkant van de dissectie schotel.
- Verwijder het overtollige vetweefsel en bindweefsel zodat het hele hoofd lichaam van de blaas, de urethra en beide urineleiders worden weergegeven.
- Bind de urineleiders met 6-0 nylon hechtingen. Speld vervolgens de open uiteinden van urineleiders naar de onderkant van de ontsnij bare schaal om de bereiding te beveiligen.
- Met behulp van fijn-Tip Tang, Trek voorzichtig een stukje van de serosa op de hoek tussen de urineleider en de blaas lichaam.
- Pas het licht van de Microscoop aan om de transparantie te vergroten en de marge van de de onder de detrusor spier te onderscheiden.
- Begin met snijden (niet peeling!) de blaaswand met fijn punt schaar langs het binnenoppervlak van de detrusor spierlaag terwijl het snij segment voorzichtig uit de buurt van het preparaat wordt getrokken. Te allen tijde, ervoor te zorgen dat de laterale rand van slijmvlies kan worden gezien en Vermijd aanraken.
- Verwijder de detrusor spier volledig door de ontsnij schaal te draaien zodat de positie van het preparaat comfortabel is om door te gaan met het ontleden van de ontspanende spier.
- Laat een klein stukje detrusor spier op de bovenkant van de blaas koepel om de mogelijkheid te garanderen om de voorbereiding te immobiliseren tijdens de resterende stappen van het protocol.
- Maak een dubbele lus van 6-0 nylon draad, plaats deze rond de hals van de blaas voorbereiding en laat de lus los.
- Voeg een tweede dubbele lus van 6-0 zijden draad, plaats het rond de hals van de blaas voorbereiding, en laat de lus verliezen. Het hebben van twee hechtingen voorkomt lekken rond de hechtingen.
- Snijd ongeveer 2 cm van 20 PE tubing (katheter), opflakkering van de tip door langzaam bewegen de punt dicht bij een vlam.
- Vul de katheter met warme (37 °C) zuurstof KBS.
- Plaats de katheter in de opening van de blaas urethra en duw voorzichtig de katheter totdat de katheter Tip ongeveer het midden van de blaas bereikt.
- Bind de hechtdraad rond de katheter en het omringende weefsel van de blaashals.
- Vul de blaas langzaam met ongeveer 50-100 μL warme (37 °C) zuurstof KBS, til deze kort op (< 10 s) boven het oppervlak van KBS en bewaak de lekkages bij de hechtingen en de blaas organen.
- Als er geen lekkage wordt waargenomen, is het preparaat klaar voor het experiment. Als er een lek rond de hechtdraad wordt waargenomen, verwijdert u de hechting en vervangt u deze. Als een lek uit een gat in de blaas lichaam wordt opgemerkt, gooi het preparaat weg.
2. vulling van de Gedenudeerde blaas voorbereiding
- Parfumeren KBS (37 ° c) in een 3 ml kamer van een water (37 °c) mantel orgel schotel met een sylgard bodem.
- Pas de zuurstof-en zuigleidingen aan.
- Plaats de gedenuded blaas preparaat in de kamer.
- Bevestig de katheter aan de zijkant van de kamer zodat het preparaat niet boven het oppervlak van de perfusie oplossing zweeft.
- Verbind de blaaskatheter met een langere PE20 slang (infuuslijn) die is aangesloten op de drie richtings kraantje met dezelfde maat fitting.
- Zorg ervoor dat de lijnen tussen de infusiepomp, de druk transducer en de blaas open zijn.
- Vul de infusie spuit met verse, warme (37 °C) en zuurstof zuur KBS.
- Stel de pomp parameters in: type/volume spuit (d.w.z. 1 mL), werking (d.w.z. Inzekering), debiet (d.w.z. constant) en debiet (d.w.z. 15 μL/min).
- Druk op de Start knop op de pomp van de spuit om de blaas te vullen.
- Monitor vulvolume en intravesicale druk tijdens het vullen van de blaas.
3. detectie van mediatoren in het SubU/LP-aspect van de voorbereiding van de Gedenudeerde blaas
- Verzamel aliquots van de badoplossing in ijskoude micro centrifugebuizen of hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) wisselplaten.
- Voorbereiden en verwerken van de monsters volgens de juiste detectie toepassing. In het geval van het opsporen van de beschikbaarheid van de purine, de monsters verwerken met HPLC met fluorescentiedetectie13,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De wand van Murine detrusor-vrije blaas voorbereiding is intact en bevat alle lagen behalve de DSM en serosa. Proof-of-principe studies toonden aan dat de DSM-vrije blaaswand urothelium en SubU/LP bevat terwijl de Tunica Muscularis en de serosa afwezig zijn (Figuur 2)13.
Het vullen van de detrusor-vrije blaas benadert de normale blaas vulling. Figuur 3 toont schematische voorstellingen van de experimentele opstelling voor het vullen van ex vivo blaas preparaten bij verschillende vulsnelheden, volumes en intraluminale druk. De Murine ex vivo intact en gedenudeerde blaas preparaten vereisen een breed scala aan vulvolumes om de ongeldig maken druk13te bereiken. De druk volume verhoudingen zijn opmerkelijk gelijkaardig in de intacte en gedenudeerde preparaten (film 1, film 2en Figuur 4). Daarom is de DSM-vrije voorbereiding geschikt voor functionele studies van de rol van urothelium en SubU/LP in blaas mechanosensation en mechanotransduction.
Mogelijk gebruik van het detrusor-vrije blaas model
Meet beschikbaarheid van mediatoren in blaas lumen en SubU/LP tijdens blaas vulling
De experimentele opstelling voor het verzamelen van extraluminale (EL; bijvoorbeeld Baden SubU/LP) en intraluminus (IL) monsters tijdens het vullen van blaas preparaten tijdens het monitoren van de blaas druk wordt geïllustreerd in Figuur 5. De geschiktheid van het model voor het meten van door de urothelium afgeleide mediatoren die tijdens het vullen in de SubU/LP-zijde vrijkomen, werd getest door het meten van het vrijkomen van purine-bemiddel kers (bijv. adenosine 5 '-trifosfaat, ATP; adenosine 5 '-difosfaat, ADP; Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD; adenosine 5 '-monofosfaat, AMP; en adenosine, ADO) in de oplossing zwemmen de SubU/LP van de gedenudeerde voorbereiding. Zoals aangetoond in Figuur 6A, werden verwaarloosbare hoeveelheden purines aangetroffen in het bad met een geïsoleerde BLAAS preparaat met intact DSM, terwijl de hoeveelheden van deze purines significant hoger waren in monsters die werden verzameld uit het bad met een gedenudeerde blaas preparaat (Figuur 6B). Met name verschaften de verdeling van purines en metabolieten in monsters van het lumen en de SubU/LP aan het eind van de vulling significant (Figuur 6C).
Onderzoek extracellulair metabolisme van mediatoren in SubU/LP tijdens blaas vulling
Toevoeging van het sterk fluorescerende analogon van ATP, 1,N6-Etheno-ATP (εatp), aan de suburotheliale zijde van de detrusor-vrije voorbereiding resulteerde in een afname van εatp en een toename van de Εatp-producten Εadp, Εamp en εado (Figuur 7AA en Figuur 7AB). Ook de toevoeging van εATP aan het preparaat lumen resulteerde in een afname van εATP en een toename van εADP, εAMP en εADO in het lumen (Figuur 7BA en Figuur 7BB). Daarom is het model geschikt voor onderzoek naar het metabolisme van bioactieve mediatoren aan beide zijden van het urothelium tijdens het vullen van de blaas.
Onderzoek transurotheliaal transport van mediatoren tijdens het vullen van de blaas
De toevoeging van εATP aan de SubU/LP-zijde van de gedenudeerde voorbereiding resulteerde in het uiterlijk van εAMP, εADO en sommige εADP in het lumen, wat suggereert dat purines van de SubU/LP naar het lumen13 (Figuur 7AC) kunnen worden vervoerd. Evenzo resulteerde het toevoegen van εATP in het lumen in het uiterlijk van εAMP en εADO in SubU/LP13 (Figuur 7db). Houd er rekening mee dat er geen εATP werd waargenomen aan de andere kant van de εATP-toepassing. Samen suggereren deze observaties sterk dat de detrusor-vrije blaas voorbereiding geschikt is voor studies van bilateraal transurotheliaal transport van mediatoren tijdens het vullen.
Figuur 1: principe van het detrusor-vrije blaas model. (A) De blaaswand bestaat uit urothelium, suburothelium/lamina propria (SubU/LP), detrusor spier en serosa. Elk van deze lagen bevat verschillende celtypen die belangrijk zijn voor blaas functies tijdens de opslag en het vernietigen van urine. Tijdens het vullen van de blaas worden biologisch actieve mediatoren uit het urothelium in de blaas lumen en in de SubU/LP vrijgelaten om cellen diep in de blaaswand te beïnvloeden, met inbegrip van de detrusor spier. Hoewel de toegang tot de blaas lumen relatief eenvoudig is, is er geen directe toegang tot de SubU/LP tijdens het vullen om urothelium-afgeleide mediatoren te detecteren die cellen in de blaaswand kunnen beïnvloeden en de prikkelbaarheid van de detrusor te beheersen. B) het verwijderen van de detrusor spier lagen samen met de serosa onthult het gehele oppervlak van SUBU/LP, waardoor directe toegang tot de subu/LP mogelijk is, waar urothelium-afgeleide signaal moleculen kunnen worden gemeten in verschillende stadia van blaas vulling. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: histologie van Murine intact en detrusor-vrije blaas wanden. Masson's trichrome kleuring van gevulde intact (A) en detrusor-vrije (B) blaas wanden toont aan dat de gedenudeerde bereiding bevat intact Urothelium (U) en subu/LP, maar niet de detrusor spier (D) en serosa (s). L, lumen. Dit cijfer is overgenomen uit een vorige publicatie13. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: schematische weergave van de experimentele opstelling die wordt gebruikt bij het vullen van ex vivo blaas preparaten. De ex vivo intact of gedenuded urineblaas (UB) preparaat wordt geplaatst in een warme (37 ° c) water-jacketed orgel kamer die wordt geperfectioneerd met zuurstof zuur Krebs-bicarbonaat oplossing (KBS, 37 °C, pH 7,4). De blaas bereiding is geïnfundeerd met KBS bij verschillende vullings percentages en volumes en de intraluminale blaas druk (BP) wordt gedurende het experiment geregistreerd dit cijfer is gereproduceerd uit een vorige publicatie13. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: druk volume verhoudingen in intacte en detrusor vrije preparaten. A) enB) zijn representatieve opnames van intravesicale volume en druk van ex vivo intact en gedenudeerde blaas preparaten die gevuld zijn met Krebs-bicarbonaat oplossing bij 15 μL/min. Zoals verwacht, ontwikkelde het intacte preparaat voorbijgaande contracties (televisiecamerasystemen) door de aanwezigheid van de detrusor. De gedenudeerde voorbereiding ontbrak daarentegen TCs. (C) en (D) vertonen samengevatte gegevens van druk volume verhoudingen van intact en gedenudeerde blaas preparaten die > 250 μL oplossing hebben ondergebracht. Merk op dat de vulvolumes en intravesicale druk opmerkelijk vergelijkbaar waren in de intact en gedenudeerde blaas preparaten. Dit cijfer is overgenomen uit een vorige publicatie13. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Schematisch diagram van het geïsoleerde blaas model dat wordt gebruikt om de beschikbaarheid van in urothelium afgeleide mediatoren in SubU/LP en lumen tijdens het vullen te evalueren. De blaas voorbereiding wordt geplaatst in een kamer met watermantel en superfused met zuurstof zuur Krebs bicarbonaat oplossing (KBS). De urineblaas (UB) preparaat is gevuld met warme zuurstofhoudende KBS via een katheter in de urethra aangesloten op een infusiepomp. Blaas druk (BP) wordt bewaakt via een drieweg-connector via de infuuslijn tijdens het vullen van de blaas. Monsters van extraluminale (EL-, orgaanbad) en intraluminus (IL)-oplossingen worden verwerkt voor detectie van mediatoren (m) volgens detectie toepassingen. Dit cijfer is overgenomen uit een vorige publicatie13. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: de detrusor-vrije blaas voorbereiding is geschikt voor het meten van de beschikbaarheid van mediatoren in SubU/LP tijdens het vullen. Representatieve chromatogrammen die de beschikbaarheid van purines in de monsters van de extraluminus aantonen in onbeschadigde (a) en detrusor vrije (B) blaas preparaten. Merk op dat purine-bemiddel kers beter worden gedetecteerd in de gedenudeerde voorbereiding dan in de intacte bereiding. C) de relatieve bijdrage van individuele purines aan de in het lumen en in subu/LP van de gedenudeerde voorbereiding geconstateerde purine Pools is significant verschillend. Dit cijfer is overgenomen uit een vorige publicatie13. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: de detrusor-vrije blaas voorbereiding is geschikt voor het onderzoeken van metabolisme en transurotheliaal transport van mediatoren tijdens het vullen van de blaas. (a, B) Representatieve chromatogrammen die εATP substraat (AA, BA) vertonen. Wanneer het substraat wordt toegepast op zowel de SubU/LP (AB) als het lumen (BB), is εatp afgenomen en zijn de producten Εadp, Εamp en εado verhoogd. Daarom wordt εATP aan beide zijden van de toepassing afgebroken; de vorming van εATP-producten is echter asymmetrisch in SubU/LP en lumen. Merk op dat de εATP-producten εAMP en εADO, maar niet het substraat εATP, aan de andere kant van de εATP-toepassing (AC, BC) verschenen. Daarom lijken purines te worden getransporteerd door de wand van de detrusor-vrije voorbereiding tijdens het archiveren. Dit cijfer is gewijzigd van13. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Video 1: representatieve opname van intacte blaas vulling. De blaas werd gevuld met 15 μL/min. video werd opgenomen met behulp van een zoom stereomicroscoop met een opgeladen gekoppelde apparaat (CCD) camera op 5 Hz; de opname werd gestopt bij het bereiken van 25 mmHg intraluminus druk. De volledige duur van de afbeelding is 64x real-time. Deze video is gereproduceerd vanaf13. Klik hier om deze video te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Video 2: representatieve opname van detrusor-vrije blaas vulling. De blaas werd gevuld met 15 μl/min. video werd opgenomen met behulp van een zoom stereomicroscoop met een CCD-camera op 5 Hz; de opname werd gestopt bij het bereiken van 25 mm Hg intraluminus druk. De volledige duur van de afbeelding is 64 keer real-time. Deze video is gereproduceerd vanaf13. Klik hier om deze video te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De blaas heeft twee functies: opslag en het vernietigen van urine. De normale werking van deze functies vereist een goede mechanische detectie van het intraluminale volume en de druk en de transductie van signalen via cellen in de blaaswand om de prikkelbaarheid van de detrusor te reguleren. Het blaas slijmvlies (urothelium) wordt verondersteld om de blaas prikkelbaarheid te reguleren door het vrijgeven van een verscheidenheid van signalering moleculen in de subu/LP die invloed hebben op talrijke celtypen in de blaaswand. Momenteel betrekken de meeste pogingen tot karakterisering van met urothelium afgeleide bemiddel kers het gebruik van blaas preparaten (bijv. vlakke blaaswand vellen, blaas stroken of gekweekte cellen) die geen fysiologische blaas vulling reproduceren. Metingen van bemiddel kers die vrijkomen in de blaas lumen aan het einde van de blaas vulling, worden vaak gebruikt als indicatie voor het vrijkomen van deze mediatoren vanaf de andere kant van het urothelium. Recente studies suggereren echter dat het intraluminale gehalte van mediatoren niet representatief is voor wat er diep in de blaaswand13beschikbaar is. Nieuwe experimentele benaderingen die toegang tot SubU/LP mogelijk maken tijdens het vullen van de blaas zijn nodig om ons begrip van lokale mechanismen van signalering tussen blaas-urothelium, SubU/LP en DSM verder te begrijpen.
Hier demonstreren we een nieuw dier blaas model waarin de detrusor spier wordt verwijderd om directe toegang te bieden tot mediatoren die vrijkomen uit het urothelium in SubU/LP tijdens het vullen van13. De gedenudeerde voorbereiding lijkt sterk op het vullen van de intacte blaas13,18, wat suggereert dat het ontbreken van de detrusor spier de mechanosensitieve eigenschappen van het urothelium niet verandert tijdens het vullen van de blaas. Het preparaat maakt het mogelijk om druk volume studies uit te voeren op de blaas bij afwezigheid van verstorende signalering van spinale reflexen en detrusor spier. Daarom kunnen bemiddel kers die vrijkomen in SubU/LP worden gemeten zonder systemische invloeden of contaminatie uit andere bronnen. De mogelijkheid om direct toegang te krijgen tot de nabijheid van SubU/LP bij verschillende volumes en drukken tijdens het vullen van de blaas maakt het model geschikt om vrij te studeren, metabolisme en transurotheliaal transport van biologisch actieve mediatoren tijdens de opslag en pre-voiding stadia van blaas vulling.
De meest kritieke stap in dit protocol is het verwijderen van de detrusor gladde spieren terwijl het urothelium en SubU/LP intact blijven. De procedure is bijzonder eenvoudig in de muis blaas als gevolg van de losse verbinding tussen de detrusor spier en SubU/LP. De preparaten toonden een uitstekende reproduceerbaarheid met opmerkelijk vergelijkbare druk volume karakteristieken aan intacte blazen13. Het model is ook haalbaar in blazen van grotere dieren waarbij de detrusor spier gedeeltelijk of volledig kan worden verwijderd. We hebben bijvoorbeeld eerder aangetoond dat het model kan worden gereproduceerd in de blaas van de Cynomolgus Monkey Macaca fascicularis en toonde aan dat mediatoren kunnen worden gemeten in subu/LP tijdens de bereiding vulling13.
De mogelijke beperking van dit ex vivo-model is het probleem dat de sterkte van het preparaat is, in essentie, het gebrek aan systemische effecten van het centrale zenuwstelsel en de circulatie maakt een grondig onderzoek mogelijk van lokale mechanismen van mucosa-detrusor connectiviteit tijdens het vullenvan de blaas . Het ontbreken van systemische effecten wordt gedeeld met talrijke ex vivo-benaderingen, waaronder geïsoleerde blaas vellen of strips of gekweekte oerotheliale cellen. Het detrusor-vrije blaas model is echter superieur aan de bovengenoemde benaderingen in urotheelceltumoren onderzoek, omdat het directe toegang tot de subu/LP mogelijk maakt in de loop van blaas vulling. Daarom zal het gebruik van deze aanpak het begrip verbeteren van mechanosensitieve mechanotransductie-mechanismen die van oorsprong zijn in het urothelium tijdens het vullen van de blaas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Onderdelen van dit werk werden eerder gepubliceerd in het Journal of Fysiologie (PMCID: PMC6418748; DOI: 10.1113/JP27692413). Toestemming is verleend door Wiley en Sons, Inc. voor het gebruik van materialen uit deze publicatie. De auteurs hebben geen financiële of andere conflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door het National Institute of diabetes en spijsverterings-en nierziekten Grant DK41315.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CaCl2 | Fisher | C79 | Source flexible |
| Dextrose | Fisher | D16 | Source flexible |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Source flexible |
| Infusion Pump | Kent Scientific | GenieTouch | Source flexible |
| KCl | Fisher | P217 | Source flexible |
| KH2PO4 | Fisher | P284 | Source flexible |
| Light source | SCHOTT ACEI | Source flexible | |
| Microscope | Olympus SZX7 | Flexible to use any scope | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | Source flexible |
| NaCl | Fisher | S671 | Source flexible |
| NaHCO3 | Fisher | S233 | Source flexible |
| Needles 25G | Becton Dickinson | 305122 | Source flexible |
| Organ bath | Custom made | Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish | |
| PE-20 tubing | Intramedic | 427405 | Source flexible |
| Pressure transducer | AD instrument | Source flexible | |
| S&T Forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | Source flexible |
| Software pressure-volume | AD Instruments | Power lab | |
| Suture Nylon, 6-0 | AD surgical | S-N618R13 | Source flexible |
| Suture Silk, 6-0 | Deknatel via Braintree Scientific, Inc. | 07J1500190 | Source flexible |
| Syringes 1 mL | Becton Dickinson | 309602 | Source flexible |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Source flexible |
| Water circulator | Baxter | K-MOD 100 | Source flexible |
References
- Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A.
- Fry, C. H., Vahabi, B. The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. , 57-62 (2016).
- Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder. Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).
- Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes--a possible sensory mechanism? Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).
- Wang, E. C., et al. ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells. Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).
- Miyamoto, T., et al. Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).
- Mochizuki, T., et al. The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).
- McLatchie, L. M., Fry, C. H. ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved. BJU International. 115, 987-993 (2015).
- Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder. American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).
- Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release. Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).
- Birder, L. A., et al. Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).
- Birder, L. A., et al. Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells. Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).
- Yoshida, M., et al. Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium. Urology. 67, 425-430 (2006).
- Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).
- Collins, V. M., et al. OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium. BJU International. 112, 1018-1026 (2013).
- Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder. Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).
- Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders. American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).
- Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability. Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).
