Målet med denne protokol var at udvikle en murine model af lav-niveau toksin eksponering, der ikke forårsager åbenlys leverskade, men snarere forværrer præ-eksisterende leverskader. Dette paradigme bedre rekapitulerer menneskelig eksponering og de subtile ændringer, der opstår ved udsættelse for toksin koncentrationer, der betragtes som sikre.
Vinylchlorid (VC), et rigeligt miljøforurenende stof, forårsager steatohepatitis på højt niveau, men betragtes som sikkert på lavere niveauer. Selv om flere undersøgelser har undersøgt rollen som VC som en direkte hepatotokgift, konceptet, at VC ændrer følsomhed af leveren til andre faktorer, såsom ikke-alkoholiske fedt leversygdom (NAFLD) forårsaget af højt fedtindhold kost (HFD) er roman. Denne protokol beskriver et eksponerings paradigme til at evaluere virkningerne af kronisk, lavt niveau eksponering for VC. Mus akklieres til fedtfattig eller fedtfattig diæt en uge før begyndelsen af inhalations eksponeringen og forbliver på disse diæter i hele eksperimentet. Mus er udsat for VC (sub-OSHA niveau: < 1 ppm) eller rum luft i inhalations kamre i 6 timer/dag, 5 dage/uge, i op til 12 uger. Dyrene overvåges ugentligt for kropsvægt øgning og fødeindtagelse. Denne model af VC eksponering forårsager ingen åbenlys leverskade med VC indånding alene. Men, kombinationen af VC og HFD betydeligt forbedrer leversygdom. En teknisk fordel ved denne Co-eksponering model er hele kroppen eksponering, uden tilbageholdenhed. Desuden ligner betingelserne nærmere en meget almindelig menneskelig situation for en kombineret eksponering for VC med underliggende ikke-alkoholiske fedt leversygdom og støtter derfor den nye hypotese, at VC er en miljømæssig risikofaktor for udviklingen af leverskader som en komplikation af fedme (dvs., NAFLD). Dette arbejde udfordrer paradigmet om, at de nuværende eksponeringsgrænser for VC (erhvervsmæssig og miljømæssig) er sikre. Brugen af denne model kan kaste nyt lys og bekymring på risiciene ved VC eksponering. Denne model af toksisk stof induceret leverskade kan anvendes til andre flygtige organiske forbindelser og til at studere andre interaktioner, der kan påvirke leveren og andre organ systemer.
Talrige giftstoffer er til stede i den luft, vi indånder på meget lave niveauer. Vinylchlorid (VC) er monomerisk gas, der anvendes af industrien til at skabe polyvinylchlorid (PVC) plastprodukter1. Det er en fremherskende miljømæssig hepatotoktoksisk, kendt carcinogen, og er rangeret #4 på ATSDR farligt stof prioriteret liste2. For bedre at forstå de toksiske virkninger på menneskers sundhed og samspillet med eksisterende Co-morbiditeter er det afgørende at fastsætte modeller for eksponering, der efterligner menneskers eksponering. Den primære interesse for denne gruppe er at studere de hepatiske virkninger af kronisk VC eksponering ved lave koncentrationer. VC udøver sine vigtigste virkninger på leveren, hvor det er blevet påvist (ved høje koncentrationer) at forårsage steatosis, og toksisk-associeret steatohepatitis (TASH) med nekrose, fibrose, cirrhose3,4, samt hepatocellulært karcinom (HCC) og den ellers ekstremt sjældne hepatiske hemangiosarcoma5. TASH har sandsynligvis eksisteret i befolkningen i årtier, men forblev ukarakteriseret og undervurderet af forskerne4,6. Som et resultat af forskning, der påviser de direkte toksicitets problemer for VC-eksponeringen, sænkede Arbejdsmiljøstyrelsen (OSHA) den acceptable eksponerings tærskel til 1 ppm over en 8 h arbejdsdag7. Selv om eksponerings tærsklen er blevet sænket, er virkningen af denne koncentration af VC på menneskers sundhed uklar7. Desuden, virkningen af VC eksponering på eksisterende komorbiditeter, såsom leversygdom, er stort set ukendt8. Denne videnkløft er især vigtig i dag på grund af den stigende globale udbredelse af ikke-alkoholiske fedt leversygdom (nalfd)4,6,7,9,10,11,12. Vigtigere, VC har for nylig vist sig at være en uafhængig risikofaktor for leversygdom fra andre årsager13. Formålet med denne protokol var derfor at udvikle en relevant inhalations model for eksponering for det flygtige miljø toksisk stof, VC i forbindelse med underliggende leverskade, at efterligne menneskelig eksponering og identificere potentielle, nye mekanismer af VC-induceret eller VC-forbedret leverskade.
Den vigtigste eksponeringsvej for mange miljøgifte og forurenende stoffer er via inhalation. Når inhaleret, stoffet kan indtaste systemisk cirkulation gennem lungerne, rejse til leveren, og blive metabolisk aktiveret af hepatiske enzymer forud for at blive udskilt14,15,16. Det er ofte disse aktive metabolitter, der forårsager toksicitet og skader i kroppen. Tidligere undersøgelser af denne gruppe og andre har brugt VC metabolitter som surrogater for udsættelse for VC gas17,18. Andre grupper har brugt inhalations modeller af VC; imidlertid blev der gennemført ekstremt høje eksponeringsniveauer (> 50 ppm) for at inducere akut toksicitet, svær leverskade og tumor udvikling19. Selv om disse undersøgelser har givet afgørende oplysninger og mekanismer af VC-induceret carcinogenicitet, de ikke rekapitulere de subtile virkninger og komplekse interaktioner med andre medvirkende faktorer og derfor er mindre relevante for menneskers eksponering.
Modellen VC-inhalation plus High fat Diet (HFD), der er beskrevet her (Se figur 1 for tidslinje), er den første model af kronisk, LAVDOSIS VC-eksponering (dvs. sub-OSHA-koncentration), hvor mus udsættes for toksin under forhold, der efterligner den humane eksponering meget nøjere. Faktisk, data fra denne model rekapitulerede resultater observeret hos mennesker eksponeret for VC, såsom virkningen på metaboliske veje20, oxidativt stress og mitokondriel dysfunktion4. Andre musemodeller af indånding, såsom hoved-og næse-only modeller21, kræver, at dyret være tilbageholdende, hvilket forårsager stress for dyret. Her, denne helkrops eksponering metode kræver ikke injektion eller unødvendige stress for dyrene. Dyrene har ad libitum adgang til mad og vand og anbringes i det større inhalations kammer i et bestemt antal timer pr. dag og dage pr. uge. Desuden er det begreb, at VC modificerer følsomhed over for et andet hepatotoksicitet, et nyt fund, der først demonstreres af denne gruppe12 og har konsekvenser for VC-eksponeringen ved koncentrationer, der ligger langt under de behov, som er nødvendige for direkte hepatotoktoksicitet.
Denne metode til indånding eksponering kan anvendes til at efterligne udsættelse for en række gasformige giftstoffer, herunder andre flygtige organiske forbindelser, der findes i vores miljø. Flygtige organiske forbindelser er faktisk en stor gruppe af miljø toksiske stoffer og mere udbredte i industriområder, hvilket medfører, at visse populationer har en højere risiko for kronisk eksponering22. Denne protokol kan ændres, så den passer til forskellige eksperimentelle spørgsmål. Længden af tid og koncentration af sammensat administreret kan varieres. Selv om de oprindeligt er udviklet til bestemmelse af leverskade, andre organ systemer kan og er blevet undersøgt med denne model23. Efterforskere, der har til formål at studere kroniske eksponeringer med dyr, men ønsker at minimere dyrs stress, bør overveje at bruge denne model.
Denne model af VC-Enhanced NAFLD er en ny metode til at evaluere effekten af sub-OSHA grænse VC eksponering i en helkrops inhalations paradigme. Denne model gør det muligt for undersøgere at studere sub-hepatotoksiske og sensibiliserende virkninger ved lave niveauer af VC alene. Faktisk, denne Co-eksponering model opnår øget leverskade, elevation af plasma ALAT og AST og moderat inflammation, mens stort set ikke påvirker andre organ systemer, såsom hjerte, på denne koncentration23. Denne kroniske model kræver helkrops inhalations kamre, men minimerer stress og eksponeringskoncentrationer. Selv om protokollen præsenteres her er en software-drevet tilgang, vores erfaring har vist, at den manuelle tilgang er også en nøjagtig og konsekvent metode til eksponering12,24. Desuden er det let anvendelig på flere forskningsområder, herunder andre organskader23 forårsaget af flygtige organiske sammensatte eksponering22. Denne model kan især i højere grad ligne patogenesen af humane Co-eksponeringer mod miljøkemikalier og underliggende sygdom5.
For at opnå lignende resultater skal visse kritiske trin i protokol optimering opnås. For eksempel skal investigatorerne fastslå, at koncentrationen af VC eller andet giftstof inden for kamrene ligger inden for det ønskede eksponeringsområde (dvs. lavt niveau, sub-OSHA eller akut niveau). Optimering af dette trin i inhalations kammeret er afgørende for en vellykket model af den menneskelige eksponering af interesse. For det andet kan justering af eksponeringstid pr. dag og varighed af eksperimentet også ændres. Af hensyn til denne gruppes interesser blev en erhvervsmæssig eksponeringsindstilling opnået, og en ekstra parameter for diæt blev også undersøgt. Miljø-og akutte eksponeringer kan dog også modelleret med denne protokol.
Dette arbejde udfordrer paradigmet om, at de nuværende eksponeringsgrænser for VC (erhvervsmæssig og miljømæssig) er sikre. Faktisk, selv om den nuværende OSHA eksponeringsgrænse for VC er 1 ppm, denne model har vist, at koncentrationer af VC under denne grænse er tilstrækkelige til at forbedre leverskade forårsaget af HFD i mus. Denne protokol gør det muligt for efterforskere at studere og karakterisere en ny toksisk stof eksponering paradigme og model TASH.
Dette er den første model af kronisk, lav-dosis VC eksponering. Tidligere arbejde brugte meget høje bolte koncentrationer, akut eksponering eller aktive metabolitter som surrogater for VC eksponering. Alle disse tilgange mindsker relevansen af resultaterne for menneskers eksponering. Derfor er denne nye model af TASH-NAFLD interaktion giver den nødvendige platform for undersøgere til at undersøge komplekse interaktioner af lav-niveau VC eksponering.
Denne model af toksisk stof-induceret leverskade kan anvendes til andre flygtige organiske forbindelser og også til at studere andre interaktioner, der kan påvirke leveren og andre organ systemer8,22,23. Desuden har denne model været og kan blive yderligere anvendt til at undersøge interventions terapier og dybtgående Mekanistiske undersøgelser af virkningsmåden for dette fremherskende giftstof24. Da VC er et kendt kræftfremkaldende26,27,28, kan dette eksponerings paradigme også modificeres til studiet af VC-induceret cancer. Andre Co-morbiditeter som alkoholisk leversygdom kan også forstærkes af VC Co-eksponering. Desuden ville det være af interesse at studere forskellige typer af fedt, såsom flerumættede fedt18,29,30, eller forskellige typer af kulhydrater31 og deres Co-eksponering med VC i denne model. Faktisk, alle disse faktorer er kendt for at have differentierede virkninger på udviklingen af leverskade og kan spille en rolle i VC-induceret leversygdom.
Afslutningsvis, dette er en roman indånding model af miljø toksisk stof-induceret leverskade og etablerer en eksponering paradigme for kronisk, lav-niveau VC eksponering. Koncentrationen af VC anvendes i denne model er sub-hepatotoksiske af sig selv, mens det forbedrer leverskade forårsaget af en anden faktor (HFD) i mus. Denne model vil gøre det muligt for undersøgere at studere mekanismer og interventioner for kronisk VC-toksicitet og kan være nyttige for translationelle undersøgelser, der ser på udsatte forsøgspersoner og med den højeste risiko for eksponering.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev finansieret af Awards fra National Institutes of Health (K01 DK096042 og R03 DK107912) til Juliane Beier. Forskningen blev også støttet af en institutionel Udviklingspris (IDeA) fra National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under tilskudsnummer P20GM113226 og det nationale Institut for alkoholmisbrug og alkoholisme i Nationale institutter for sundhed under tildeling nummer P50AA024337. Indholdet er udelukkende ansvaret for forfatterne og ikke nødvendigvis repræsenterer de officielle synspunkter af de nationale institutter for sundhed.
ALT/AST reagents | Thermo Fisher | TR70121, TR71121 | |
C57Bl/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animal studies must conform to all relevant ethics and animal welfare regulations and must be reviewed and approved by the appropriate governmental and institutional animal care and use committees. Since this is a chronic study, we recommend using male or female mice 4-6 weeks of age. |
CO2 Monitor | IEStechno | Ex-Sens | |
Eosin | Sigma | E6003 | |
Hematoxylin | Sigma | HHS16 | |
Inhalation exposure chamber system | IEStechno | GasExpo | The inhalation exposure chamber system includes custom software, interface and controller hubs |
Saturated fat (13%) control diet | Teklad Diets | TD.120336 | |
Saturated fat (42%) diet | Teklad Diets | TD.07511 | |
Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
Vinyl Chloride | MATHESON TRI-GAS | Series 3590-CGA* | Handle gas with caution |