Chip-baseret super opløsning Optisk mikroskopi er en ny tilgang til fluorescens mikroskopi og giver fordele i omkostningseffektivitet og gennemløb. Her vises protokollerne for spån klargøring og billeddannelse for TIRF-mikroskopi og lokaliserings baseret super opløsnings mikroskopi.
Total intern refleksion fluorescens (TIRF) er almindeligt anvendt i enkelt molekyle lokalisering baseret super-resolution mikroskopi, da det giver øget kontrast på grund af optisk skæring. Den konventionelle tilgang er at bruge høje numeriske blænde mikroskop TIRF mål for både excitation og indsamling, alvorligt begrænse synsfelt og gennemløb. Vi præsenterer en roman tilgang til at generere TIRF excitation til billeddannelse med optiske bølgeledere, kaldet chip-baserede nanoskopi. Formålet med denne protokol er at demonstrere, hvordan chip baseret billeddannelse udføres i en allerede opbygget opsætning. Den største fordel ved chip-baserede nanoskopi er, at excitation og indsamling veje er afkoblet. Imaging kan derefter gøres med en lav forstørrelse linse, hvilket resulterer i store synsfelt TIRF billeder, på prisen for en lille reduktion i opløsning. Leveren sinusformet endotelceller (lsecs) blev afbildet ved hjælp af direkte stokastiske optisk genopbygning mikroskopi (dStorm), viser en opløsning svarende til traditionelle super-resolution mikroskoper. Derudover demonstrerer vi funktionerne med høj kapacitet ved at afbilde en 500 μm x 500 μm-region med en lav forstørrelses linse, der giver en opløsning på 76 nm. Gennem sin kompakte karakter kan chip-baseret billeddannelse eftermonteres i de fleste almindelige mikroskoper og kan kombineres med andre on-chip optiske teknikker, såsom on-chip sensing, spektroskopi, optisk fældefangst, etc. Teknikken er således ideel til high gennemløb 2D super-resolution Imaging, men giver også store muligheder for multimodal analyse.
Siden den indledende demonstration af enkelt molekyle lokalisering mikroskopi, mange variationer er blevet udviklet til at løse forskellige udfordringer1,2,3. En udfordring, der er forblevet, er dog stort synsfelt dSTORM Imaging. Mange dstorm opsætninger bruger den samme objektiv linse til både at begejstre prøven og billedet. For at øge synsfeltet er der behov for en lav forstørrelse linse. Lav forstørrelse og lav numerisk blænde (NA) objektiv linser har typisk en stor dybde af felt, hvilket resulterer i et øget out-of-plane signal, der vil reducere lokaliserings præcision. TIRF mål er almindeligt anvendt til at øge billedets kontrast ved at reducere off-of-plane fluorescens. Gennem tirf er excitation begrænset til en optisk tykkelse på ca. 150 nm fra overfladen ved hjælp af en passive felt4. TIRF objektiv linser kræver en stor NA resulterer i en lille synsfelt (FOV) (f. eks 50 x 50 μm2), som begrænser gennemstrømningen betydeligt. Der er dog alternative måder at generere et passive felt.
En optisk bølge guide er en struktur, der vil begrænse og vejlede lys, hvis det er koblet ind i strukturen. Mest almindeligt, bølgeledere anvendes i fiber-baserede telekommunikation. Der er gjort en stor indsats for at udvikle 2D integrerede bølge føringer som en hovedbestanddel af fotoniske integrerede kredsløb. Teknologien har udviklet sig til et punkt, hvor opdigte lavt tab Nano-strukturerede optiske bølgeledere kan rutinemæssigt udføres5. I dag kan flere støberier rundt om i verden bruges til at udvikle fotoniske integrerede kredsløb. Waveguides guide lys gennem total intern reflektans også udstiller en passive felt på overfladen. Ved omhyggelig udformning af bølge guide struktur, en høj intensitet kan opnås i det evanescerende felt. En prøve placeret direkte på toppen af bølge vejledningens overflade kan således også belyses af det evanescerende felt til billedbehandlings applikationer. Det passive felt vil blive genereret langs hele længden og bredden af bølge guiden, og dermed kan det gøres vilkårligt store6.
Vi præsenterer en roman tilgang til TIRF dstorm, der tilbyder et vilkårligt stort synsfelt. I stedet for at bruge en tirf-linse til både excitation og indsamling, begejstre vi ved hjælp af det passive felt fra optiske bølgeledere. Dette afdækker den excitation og indsamling lys pathway, giver mulighed for total frihed langs samlingen lys sti uden at kompromittere den optiske skæring for en given bølgelængde, der leveres af Waveguide chip belysning. Lav forstørrelse linser kan således bruges til at afbilde meget store regioner i TIRF-tilstand, selv om en mindre NA vil reducere den laterale opløsning. Desuden er flerfarvet billeddannelse også meget forenklet ved hjælp af bølgeledere7, da flere bølgelængder kan styres og detekteres uden at justere systemet. Dette er fordelagtigt for dstorm, som lave bølgelængder kan bruges til at forbedre fluoroforet blinkende og for flerfarvet billeddannelse. Det er værd at bemærke, at indtrængnings dybden af det passive felt vil ændre sig som en funktion af bølgelængde, selv om det ikke påvirker, hvordan billedbehandlings proceduren udføres. Chippen er kompatibel med Live Cell Imaging8 og er ideel til applikationer såsom integration af microfluidics. Hver chip kan indeholde snesevis af bølge føringer, som kan give brugeren mulighed for at billede under forskellige forhold eller anvende optisk diffusering9 og Raman spektroskopi10.
Chip-baserede system fungerer lige godt for både diffraktion-begrænset og super-resolution Imaging. En lignende tilgang blev introduceret i 2005 ved hjælp af en prisme til at generere passive felt excitation4. Den fotoniske chip begejstrer også gennem det passive felt, men med moderne bølge guide fabrikation teknikker, kan man generere eksotiske lys mønstre med bølgeledere. Den nuværende chip-baserede nanoskopi-implementering er begrænset til 2D-billeddannelse, da excitation-feltet er låst inde i bølge vejledningens overflade. Fremtidig udvikling vil sigte mod 3D-applikationer. Desuden er andre super-resolution teknikker såsom struktureret belysning mikroskopi udvikles ved hjælp af samme chip-baserede mikroskop11.
Chip-baseret billeddannelse svarer til konventionel dstorm Imaging. Billedkvaliteten kan således måles ved hjælp af de samme tilgange som ved traditionel d-storm dannelse. Den væsentligste forskel for brugeren er, at det gennemsigtige glas glider udveksles med en uigennemsigtig si-wafer. Selv om de forekommer meget forskellige, er prøve håndteringen næsten analog med en glas rutsjebane. Chips er ganske robuste og kan nemt håndteres ved hjælp af wafer pincet. Billedbehandlings proceduren og billed genopbygningen er den samme som i et almindeligt d-storm eksperiment. Opsætning af et funktionelt chip baseret mikroskop kræver ingen særlige komponenter, bortset fra de fotoniske chips. Yderligere oplysninger om set-up kan findes i tidligere arbejde6,7. De chips, der anvendes i dette arbejde er blevet fremstillet ved hjælp af standard litografiske8.
Prøve præparatet omfatter forberedelsen af prøvekammeret. Når du fastgør PDMS frame til chippen, er det afgørende at undgå eventuelle små folder eller Ripper, hvor luften kan komme ind. Hvis pdm’er folder sig ud, når du vedhæfter den, skal du blot fjerne den forsigtigt med en pincet og sætte den i igen. Når prøven er klar inde i PDMS-kammeret, skal dækglasset presses mod det og forsegler regionen. Det er vigtigt at undgå eventuelle luftbobler, der kan dannes ved fastgørelse af dækglasset. Hvis der dannes en luftboble, skal du forsigtigt fjerne dækglasset og tilføje PBS i prøvekammeret for at sikre, at prøven er dækket. Forberedelsen og fastgørelse af dækslet slip kan derefter simpelthen være redone.
Koblings lyset i bølge styret forenkles ved hjælp af den protokol, der foreslås i dette papir. Der er dog et par fælles udfordringer, der kan begrænse koblingen. For det første, hvis chippen ikke blev rengjort ordentligt og alle rester PBS fjernet helt, kan der være snavs eller krystalliseret PBS på bølge føringen. Dette kan medføre store tab, hvilket resulterer i meget lidt strøm i billedområdet. Ved hjælp af en fugtig vatpind til at rense regionen uden for dækslet glas kan forbedre strømmen betydeligt. For det andet, hvis bølge vejledningens koblings facet er beskadiget (f. eks. ved forkert håndtering), kan koblings tabet stige drastisk. Optisk inspektion af kanten vil normalt afsløre eventuelle skader nemt. Hele koblings facetten af chippen kan poleres forsigtigt, meget gerne en optisk fiber, og vil give en glat kobling facet, som derefter øger den koblede strøm.
Efter at lyset er blevet koblet, er billedbehandlings proceduren den samme som i enhver konventionel d-storm opsætning. Hvis billedet har uhomogen excitation, som vist i figur 2A, så sandsynligvis den tilstand gennemsnit fungerede ikke godt. De to mest almindelige årsager til dette er: 1) for få billeder fanget for at skabe en gennemsnitlig stak og 2) for kort af en svingnings afstand/for stor af en trin størrelse. Indsamling for få billeder kan udelade nogle excitation mønstre og gennemsnittet vil således være inhomogene. Dette kan nemt løses ved at øge antallet af billeder i den gennemsnitlige stak. For kort af en svingnings afstand kan også resultere i et inhomogent billede, da ikke nok mode mønstre er ophidset. Dette kan også nemt løses ved at øge svingnings afstanden og/eller formindske trin størrelsen. I dette arbejde har vi brugt en piezo fase til at scanne input laserstråle over 20 μm og erhverve mindst 300 billeder. En anden fremgangsmåde kunne være at bruge High-Speed galvo-spejle til at scanne lyset på tværs af input Waveguide facet inden for en enkelt erhvervelse tid, såsom 10-30 MS. denne indstilling er velegnet til live Cell tirf Imaging, hvor sub-cellulære organeller er i konstant bevægelse.
Chip-baseret dstorm tilbyder en hidtil uset stor område tirf excitation, hvilket gør det ideelt egnet til høj gennemløb Imaging. Den kompakte karakter giver mulighed for efter montering til kommercielle systemer, hvor chippen kan placeres på hovedet for inverterede opsætninger eller gennemsigtige substrater kan udvikles. Chips er masse fabrikerede og kan ændres, så de passer til mange behov. I øjeblikket er den vigtigste begrænsning er, at det er begrænset til 2D. Det passive felt er kun tilgængelig ca. 200 Nm væk fra bølge føringen overflade, så kun fluorophores i denne region vil være spændt. Samlet giver området for integreret optik mange muligheder for chip baseret mikroskopi i den nærmeste fremtid ved at tackle nye billedbehandlings spørgsmål samt give nye muligheder til eksisterende.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende det Europæiske Forskningsråd (Grant nr. 336716-B.S.A.). Forfatterne vil også gerne takke Irati Lagfragua for hendes uvurderlige assistance med optagelse og redigering af videoen.
1-axis sample stage | Standa | 7T173-20 | |
2-axis sample translation stage | Mad City Labs | Custom order | |
3-axis NanoMax stage | Thorlabs | MAX311D | |
BXFM microscope body | Olympus | OLY-LSM-037018 | |
CellMask Deep Red, Life technologies | ThermoFisher | C10046 | |
Cleanroom grade swabs | MRC Technology | MFS-758 | |
Fiber-coupled laser | Cobolt | Flamenco | |
Filter Holder | Homemade | ||
Hellmanex III, Hellma Gmbh | Sigma-Aldrich | Z805939 | Cleaning detergent concentrate |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935-1L | |
KL 1600 LED | Olympus | OLY-LSM-E0433314 | |
Olympus Coupling lens | Olympus | LMPLFLN 50x/0.5 | |
Orca Flash 4.0 V2 | Hamamatsu | ||
PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Mix according to descriptions |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer 1.1 kg kit | Dow | 1673921 | |
Tip-tilt stage | Thorlabs | APR001 | |
Vacuum holder | Thorlabs | HWV001 | |
Wafer Tweezers Type 2W | Agar scientific | AGT5051 |