Summary
Çip tabanlı süper çözünürlüklü optik mikroskopi floresan mikroskobu için yeni bir yaklaşım dır ve maliyet etkinliği ve iş akışı avantajları sunuyor. Burada TIRF mikroskobu ve lokalizasyon tabanlı süper çözünürlüklü mikroskopi için çip hazırlama ve görüntüleme protokolleri gösterilmiştir.
Abstract
Toplam iç yansıma floresansı (TIRF), optik kesit sayesinde gelişmiş kontrast sağladığından tek moleküllü lokalizasyon tabanlı süper çözünürlüklü mikroskopide yaygın olarak kullanılır. Geleneksel yaklaşım, hem uyarma hem de toplama için yüksek sayısal diyafram mikroskobu TIRF hedefleri kullanmak, görüş ve iş verme alanını ciddi şekilde sınırlamaktır. Çip tabanlı nanoscopy adı verilen optik dalga kılavuzları ile görüntüleme için TIRF uyarma oluşturmaya yeni bir yaklaşım savuruyoruz. Bu protokolün amacı, yonga tabanlı görüntülemenin önceden oluşturulmuş bir kurulumda nasıl gerçekleştirildiğini göstermektir. Çip bazlı nanoscopy'nin en büyük avantajı uyarma ve toplama yollarının ayrılmasıdır. Görüntüleme daha sonra çözünürlükte küçük bir azalma fiyata, görüş TIRF görüntüleri geniş bir alan sonuçlanan, düşük büyütme lens ile yapılabilir. Karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (LSECs) geleneksel süper çözünürlüklü mikroskoplar ile karşılaştırılabilir bir çözünürlük gösteren, doğrudan stokhastik optik rekonstrüksiyon mikroskopları(dSTORM) kullanılarak görüntülendi. Buna ek olarak, 500 μm x 500 m'lik bir bölgeyi düşük büyütme li lensle görüntüleyerek yüksek üretim özelliklerini gösteriyoruz ve 76 nm çözünürlük sağlıyoruz. Kompakt karakteri sayesinde, çip tabanlı görüntüleme en yaygın mikroskoplar içine güçlendirilmiş olabilir ve diğer çip üzerinde optik teknikleri ile kombine edilebilir, çip algılama gibi, spektroskopi, optik bindirme, vb. Bu nedenle bu teknik, yüksek iş yapma oranı 2B süper çözünürlüklü görüntüleme için idealdir, ancak aynı zamanda çoklu modal analiz için de harika fırsatlar sunar.
Introduction
Tek molekül lokalizasyon mikroskopisi ilk gösteribu yana, birçok varyasyon farklı zorlukları çözmek için geliştirilmiştir1,2,3. Ancak kalan bir sorun, geniş görüş alanı dSTORM görüntüleme. Birçok dSTORM kurulumları hem örnek heyecanlandırmak ve görüntü için aynı objektif lens kullanın. Görüş alanını artırmak için düşük büyütmeli bir merceğe ihtiyaç vardır. Düşük büyütme ve düşük sayısal diyafram (NA) nesnel lensler genellikle geniş bir alan derinliğine sahiptir ve bu da yerelleştirme hassasiyetini azaltacak uçak dışı sinyalin artmasına neden olur. TIRF hedefleri genellikle düzlem dışı floresan azaltarak görüntü kontrastını artırmak için kullanılır. TIRF sayesinde, uyarma bir evanescent alan4ile yüzeyden yaklaşık 150 nm optik kalınlığı ile sınırlıdır. TIRF objektif lensler, büyük bir NA'ya ihtiyaç duyar ve bu da büyük bir görüş alanı (FOV) (örn. 50 x 50 μm2),elde edilen kısmı önemli ölçüde sınırlar. Ancak, bir evanescent alan oluşturmak için alternatif yollar vardır.
Optik dalga kılavuzu, yapıya birleştiğinde ışığı sınırlandıracak ve yönlendirecek bir yapıdır. En yaygın olarak, dalga kılavuzları fiber tabanlı telekomünikasyon kullanılır. Fotonik entegre devrelerin ana bileşeni olarak 2B entegre dalga kılavuzları geliştirmek için büyük çaba gösterilmiştir. Teknoloji, düşük kayıplı nano-yapılandırılmış optik dalga kılavuzları imalatı rutin 5yapılabilirbir noktaya ilerlemiştir. Bugün, dünya çapında çeşitli dökümhaneler fotonik entegre devreler geliştirmek için kullanılabilir. Dalga kılavuzları, ışığı toplam iç yansımada da yüzeyde bir evanescent alanı sergileyen kılavuzolarak yönlendirir. Dalga kılavuzu yapısının dikkatli tasarımı ile, evanescent alanında yüksek yoğunlukelde edilebilir. Böylece dalga kılavuzu yüzeyinin üzerine doğrudan yerleştirilen bir örnek, görüntüleme uygulamaları için evanescent alanı ile de aydınlatılabilir. Evanescent alan dalga kılavuzunun tüm uzunluğu ve genişliği boyunca oluşturulacak, ve böylece keyfi büyük yapılabilir6.
Biz tirf dSTORM için keyfi geniş bir görüş alanı sunan yeni bir yaklaşım sıyoruz. Hem uyarma hem de koleksiyon için TIRF lens kullanmak yerine optik dalga kılavuzlarındaki evanescent alanını kullanarak heyecanlandırıyoruz. Bu, uyarma ve toplama ışık yolunu ayırarak, dalga kılavuzu yongası aydınlatması tarafından sağlanan belirli bir dalga boyu için optik kesitten ödün vermeden toplama ışık yolu boyunca toplam özgürlüğe olanak sağlar. Düşük büyütme lensler böylece TIRF modunda çok büyük bölgeleri görüntü için kullanılabilir, daha küçük bir NA yanal çözünürlüğü azaltacak olsa da. Ayrıca, çok renkli görüntüleme de büyük ölçüde dalga kılavuzları kullanılarak basitleştirilmiş7, çeşitli dalga boyları yönlendirilebilir ve sistem yeniden düzene olmadan tespit edilebilir. Düşük dalga boyları florofon yanıp sönme geliştirmek ve çok renkli görüntüleme için kullanılabilir gibi bu dSTORM için avantajlıdır. Görüntüleme işleminin nasıl gerçekleştirildiğini etkilemese de, evanescent alanının penetrasyon derinliğinin dalga boyu fonksiyonu olarak değişeceğini belirtmekte yarar vardır. Çip canlı hücre görüntüleme8 ile uyumludur ve mikroakışkanların entegrasyonu gibi uygulamalar için idealdir. Her çip, kullanıcının farklı koşullar altında görüntü veya optik bindirme9 ve Raman spektroskopi10 uygulayabilirsiniz dalga kılavuzları, onlarca içerebilir.
Çip tabanlı sistem hem kırınım sınırlı hem de süper çözünürlüklü görüntüleme için eşit derecede iyi çalışır. Benzer bir yaklaşım 2005 yılında evanescent alan uyarma oluşturmak için bir prizma kullanılarak tanıtıldı4. Fotonik çip de evanescent alan aracılığıyla heyecanlandırır, ancak modern dalga kılavuzu üretim teknikleri ile, bir dalga kılavuzları ile egzotik ışık desenleri üretebilir. Mevcut çip tabanlı nanoscopy uygulaması sadece 2D görüntüleme ile sınırlıdır, uyarma alanı dalga kılavuzu yüzeyinin içinde kilitli olduğundan. Gelecekteki geliştirme 3D uygulamaları hedefleyecek. Ayrıca, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu gibi diğer süper çözünürlüklü teknikler aynı çip tabanlı mikroskop11kullanılarak geliştirilmektedir.
Protocol
1. Polidimethylsiloxane (PDMS) tabakasının hazırlanması
- Sylgard 184 monomer ve kür ajan bir 10:1 karışımı hazırlayın.
- Hava kabarcıkları gidene kadar karışımı bir vakum odasına yerleştirin.
- 3,5 inç (çap) Petri kabının ortasına 1,7 g PDMS karışımı dökün.
- Petri kabını bir spin kaplamanın vakum lu aynasının üzerine yerleştirin.
- Spin kat Petri çanak 20 s için 900 rpm, 75 rpm / s bir ivme ile.
- Yemeği en az 2 saat boyunca 50 °C'de bir ocakta pişirin.
2. Örnek hazırlama
-
Dalga kılavuzu temizliği
- Deiyonize (DI) suda temizleme deterjanı konsantresinin(Malzeme Tablosu)%1 seyreltilmesinin 100 mL'sini hazırlayın.
- Çipi gofret tweezer kullanarak cam bir Petri kabına yerleştirin ve deterjan solüsyonuyla tamamen kapatın.
- Petri kabını 70 °C'de 10 dk sıcak bir tabağa yerleştirin.
- Hala sıcak plaka üzerinde iken, bir temiz oda doku bezi ile yüzey ovmak.
- Petri kabından çipi çıkarın. En az 100 mL DI su ile durulayın.
- En az 100 mL isopropanol ile durulayın, buharlaşma lekelerini önlemek için çözücünün yüzeyde kurumamasına dikkat edin.
- En az 100 mL DI su ile durulayın. Çipi azot tabancasıyla kurutun.
-
Oda hazırlığı
- Petri kabında (bölüm 1) 150 m polidimetilsiloksane (PDMS) bir tabaka hazırlayın.
- PDMS katmanından 1,5 cm x 1,5 cm'lik bir çerçeveyi kesmek için neşter kullanın.
- Çerçeveyi Petri kabından bir cızırdayarak kaldırın. Temiz ve cilalı bir çip üzerine düz yatırın. Örnek şimdi hücre tohumlama için hazırdır.
-
Floresan etiketleme
- Aşağıdaki kimyasalları hazırlayın: fosfat tamponlu tuzlu çözelti, boya çözeltisi(ler), dSTORM görüntüleme tamponu.
- Hücre tohumlamasonra, ortamdan çip çıkarın.
- PDMS odasının dışındaki fazla sıvıyı çıkarmak için bir pipet kullanın.
- Aynı anda yaklaşık 60 μL temiz PBS eklerken pdms haznesinin içinden bir pipetle akım sıvısını çıkarın.
NOT: Odaya eklenen miktarın oda büyüklüğüne göre değiştirilmesi gerekecektir. Tüm ortamları hücre yüzeyinden çıkarmamaya dikkat edin. - PBS'yi 60 μL temiz PBS ile değiştirin ve 1 dakika kuluçkaya yatırın.
- Bir önceki adımı tekrarlayın, bu kez 5 dakika kuluçkaya yatın.
- PBS'yi çıkarın ve boya çözeltisinin 60 0L'lik kısmıyla değiştirin. Numuneyi yaklaşık 15 dakika kuluçkaya yatırın ve ışıktan koruyun.
NOT: Bu adım, kullanılan floresan boya bağlı olarak önemli ölçüde değiştirmek zorunda kalabilirsiniz. Bu deney için hücre zarını etiketlemek için CellMask Deep Red kullanıyoruz - 2.3.3-2.3.5 adımlarında olduğu gibi numuneyi PBS ile yıkayın.
- PBS'yi çıkarın ve aynı anda görüntüleme arabelleği 40 μL ile değiştirin.
NOT: Farklı floresan boyalar için birkaç farklı görüntüleme tamponları vardır. - Hava kabarcıklarının altında oluşmasını önleyerek üzerine bir kapak kaydırın. Fazla ortamları kaldırmak için kapak kapağını görüntüleme odasına hafifçe bastırın.
- Coverslip dışında herhangi bir fazla ortam kaldırmak için bir pipet kullanın. Kurutulmuş daldırma ortam artıkları oluşan kristalleri önlemek için bir su nemli bezi ile kapak dışında alanı temizleyin.
3. Görüntüleme prosedürü
- Bileşen kurulumu
NOT: Kurulumun bu sürümü üç ana bileşenden oluşur: mikroskop, bağlantı aşaması ve örnek aşaması. Malzeme Tablosunabakın.- Filtre tutucu, beyaz ışık kaynağı, kamera ve objektif tabanca içeren bir mikroskop kullanın.
- Bir fiber-coupled lazer ve kaplin lens ile 3 eksenli piezo kaplin sahne kullanın.
- Uç ve eğim ve vakum tutuculu tek eksenli manuel numune aşaması kullanın.
- Örnek çeviri için hem kaplini hem de örnek sahneyi 2 eksenli motorlu bir sahneye monte edin.
- Dalga kılavuzu bağlantı
- Bağlantı hedefine doğru kaplin fati ile vakum chuck üzerinde çip yerleştirin. Çipin bağlantı hedefinden yaklaşık bir odak uzaklığı olduğundan emin olun.
- Vakum pompasını aç.
- Lazeri 1 mW'a açın. Kabaca, kirişin kenarına çarpması için talaş yüksekliğini ayarlayın. Lazeri kapat.
- Beyaz ışık kaynağını açın. Düşük büyütme nesnel lens (örn. 10x) seçin. Mikroskobu bir dalga kılavuzuna odakla.
- Mikroskobu dalga kılavuzu boyunca çevirin ve optik yol ile uyumlu olup olmadığını görün. Mikroskobu kaplin kenarına taşıyın.
- Lazeri 1 mW veya daha az açık layın. Lazer ışığını bulmak için mikroskobu kaplin kenarı boyunca çevirin. Kirişi çip kenarına odakla.
- Optik yol boyunca bağlantı aşamasını, kaybolana kadar lazer ışını nokta boyutunu küçülten yönde ayarlayın. Işın şimdi çip yüzeyinin üstünde veya altında.
- Kiriş noktası yeniden belirip en üst düzeye çıkana kadar bağlantı aşaması yüksekliğini ayarlayın.
- Lazer odaklanmış bir nokta oluşturana kadar önceki iki adımı tekrarlayın.
- Odaklanmış noktayı ilgi nin dalga kılavuzuna taşıyın.
- Mikroskobu kenardan kısa bir mesafe uzağa çevirin, böylece odaklanmış ışın noktası artık görünmez. Beyaz ışığı kapat.
- Kontrastı ayarlayın. Dalga kılavuzu yol gösteriyorsa, dalga kılavuzu boyunca dağınık ışık açıkça görülebilmelidir.
- Dağınık ışık yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak için bağlantı aşamasının eksenlerini ayarlayın. Lazeri kapat.
- Beyaz ışığı aç. Gerekirse kontrastı ayarlayın.
- Görüntüleme bölgesine gidin.
- Kırınım sınırlı görüntüleme
- İstenilen görüntüleme hedefine odaklanın. Beyaz ışığı kapat.
- Floresan filtresini takın ve lazer gücünü 1 mW'a çevirin.
- Kameranın pozlama süresini yaklaşık 100 ms olarak ayarlayın. Bağlantının hala optimize edilmiş olduğundan emin olun.
- Görüntüleme için ilgi çekici bir bölge bulun. Ortalama dışarı modları için piezo sahne döngü açın.
NOT: Adım boyutu 50 nm olan 20 μm'lik tazyik aralığı çoğu dalga kılavuzu yapıları için uygundur. - En az 300 görüntü yakalayın.
- Yakalanan görüntü yığınını sanal bir yığın kullanarak Fiji'ye yükleyin. Fiji'deki resim menüsünden Yığınlar ve z-project'iseçin.
- Projeksiyon türü ortalama yoğunluğunuseçerek TIRF görüntüsünü hesaplayın.
- d FIRTINA görüntüleme
- Lazeri 1 mW'a açın ve kameranın pozlama süresini 30 ms'e ayarlayın.
- Kontrastı ve odağı ayarlayın.
- Yanıp sönene kadar lazer gücünü artırın.
NOT: Bu durum, alan yoğunluğuna bağlı olarak biraz zaman alabilir. - Örneğin küçük bir bölgesini yakınlaştırın.
- Kontrastı ayarlayın.
- Göz kırpmaların iyi ayrılıp ayrılmadınlarını görmek için birkaç görüntü yakalayın.
- En iyi yanıp sönme için kameranın pozlama süresini ayarlayın.
NOT: Yanıp sönme optimize etmek karmaşık bir iştir, ancak çok sayıda uygun literatür mevcuttur12. - Piezo sahne halkasını açın.
- Yanıp sönen yoğunluğa bağlı olarak en az 30.000 karelik bir görüntü yığınını kaydedin.
- d STORM görüntü rekonstrüksiyonu
- Fiji'yi açın ve dSTORM yığınını sanal görüntüler olarak yükleyin.
- Gerekirse kontrastı ayarlayın.
- Yeniden oluşturmak için alanı seçmek için dikdörtgen aracını kullanın.
- Fiji'deki Thunderstorm13 eklentisinde Açık Koşu analizi.
- Cihaza karşılık gelen Thunderstorm'daki temel kamera ayarlarını ayarlayın. Kalan varsayılan parametreler genellikle tatmin edicidir.
- Yeniden yapılanmaya başla.
NOT: Tam görüş alanı için, büyük dosya boyutu nedeniyle verilerin alt yığınlara bölünmesi gerekebilir. - Belirli olmayan yerelleştirmeleri kaldırmak için yeniden yapılandırma yazılımı tarafından sağlanan yerelleştirme listesini filtreleyin. Apple gerekirse ek bir sürüklenme düzeltme.
Representative Results
TIRF mikroskobu, uçak dışı floresanları ortadan kaldırdığı, kontrastı artırdığı ve böylece görüntü kalitesini artırdığı ve diğer floresan bazlı mikroskopi tekniklerine göre daha az fototoksik olduğu için popüler bir tekniktir. Geleneksel nesnel tabanlı yaklaşımla karşılaştırıldığında, talaş bazlı mikroskopi, genellikle TIRF lensle birlikte gelen sınırlı iş bilgili olmadan TIRF uyarma sağlar. Sunulan kuruluma genel bir bakış Şekil 1 A'dabulunabilir. Farelerden çıkarılan karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin (LSEC) kırınım sınırlı yanı sıra dSTORM görüntüleri siffractions. Mikrotübulin etiketli LSEC'lerin geniş bir görüş alanı da sunularak yüksek iş elde görüntüleme nin yeteneklerini gösterir. Bir yağ daldırma TIRF lens (ya 60x veya 100x büyütme) kullanarak geleneksel bir dSTORM kurulum genellikle 50μm x 50 μm bir alan görüntüler, Şekil 2 çip tabanlı görüntü 100 kat daha küçük , 25x ile görüntülenmiş, 0.8 NA hedefi.
Bu yöntemde uyarma için çok modlu Si3N4 dalga kılavuzları kullanıyoruz. Kullanılan yongalar, silikon çipin 2 μm okside tabakası üzerine biriken 150 nm Si3N4 şeritli kılavuz tabakasından oluşur. Çipin şeması Şekil 1B'debulunabilir. Dalga kılavuzu genişlikleri 200 ile 1000 m arasında değişebilir. Yayılma modları arasındaki parazit sayesinde uyarma ışığı homojen bir yoğunluk dağılımına değil, mekansal olarak değişen bir desene sahip olacaktır. Şekil 2A, açıkça görülebilen mod desenli bir görüntü sunar. Bu girişim deseni, dalga kılavuzunun kenarındaki lazer ışınının konumu yla değişecektir. Son görüntülerde homojen uyarma elde etmek için, birleştiğinde faset boyunca salınım yapmak için bir piezo sahne kullanın. Görüntüleme prosedürü boyunca, görüntüdeki yoğunluk dalgalanmalarını ortadan kaldırarak, ortalamaya kadar girişim desenlerinin yeterli varyasyonu vardır. Görüntü yığını, şekil 2A'dakigibi çeşitli görüntülerden oluşacak, ancak farklı desenlere sahip olsa da, ortalama olarak, yığın Şekil 2Bgibi homojen uyarma ile bir görüntü verecektir. Alternatif bir yaklaşım geniş elde etmek için adiyabatik bantlama kullanmaktır, tek moded waveguides8,14, hangi modu ortalama gerekliliğini kaldırır. Ancak, 100 μm dalga kılavuzu genişliği elde etmek için tek modlu koşulu korumak için birkaç milimetre bant uzunluğu gereklidir. Çok modlu dalga kılavuzları bu bantgerekliliğini aşmak ve yapı genişliği üzerinde herhangi bir sınırlama bırakmaz. Aydınlatma deseni ötesinde, modların son derece etkili kırılma indisi yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu11 ve dalgalanma mikroskobu yöntemleri7doğru benzeri görülmemiş olanaklar sağlar.
Görüntülemede ilk adım, sınırlı bir kırınım görüntüsü toplamaktır. Deneme yaklaşık 300 görüntü yığını ile sonuçlanır ve son görüntü yığının ortalaması alınarak yapılır. Şekil 2'de,CellMask Deep Red ile etiketlenmiş LSEC'lerin 60x, 1.2 NA su daldırma amacı kullanılarak sınırlı ve dSTORM görüntülemesini saklı atıyoruz. Şekil 2A, ortalama modunun yetersiz liği nedeniyle homojen bir aydınlatma gösterir. Başarılı mod ortalaması Şekil 2B'degörüntülenir. Şekil 2C, şekil 2D'degösterilen işaretli bölge ile aynı bölgenin dSTORM görüntüsüdür. Karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri plazma zarında nano boyutlu gözenekleri var15, burada görülebilir. Fourier Halka Korelasyon analizi 46 nm çözünürlük sağladı.
Şekil 3, tekniğin yüksek üretim yeteneklerini gösteren 500 μm x 500 m'lik bir bölgenin dSTORM görüntüsünü sunar. Şekil 3A'nınyakınlaştırılmış bir görüntüsü , tipik bir dSTORM alanına karşılık gelen görünüm, Şekil 3B'dekikırınım sınırlı görüntü ile birlikte sunulur. Çözünürlüğü tahmin etmek için fourier halka korelasyon yapıldı, 76 nm değerinde.
Şekil 1: Görüntüleme sistemi ve dalga kılavuzu. (A) Görüntüleme sisteminin fotoğrafı. Örnek, dalga kılavuzunun bağlantı amacına doğru kaplin lektüsü ile örnek aşamasında bir vakum chuck üzerine yerleştirilir. Bir fiber birleştirilmiş lazer ve bir kaplin hedefi bir 3D piezo sahne üstüne yerleştirilir. Görüntüleme mercekli bir lens tareti görüntüyü yukarıdan yakalar ve kameraya aktarAr. (B) Bağlantı ve görüntüleme merceği ile dalga kılavuzu şeması. Kaplin lens çiftler dalga kılavuzu içine ışık. Örnekler (turuncu boncuklar) kapalı bir PDMS odasında saklanır. Dalga kılavuzu boyunca evanescent alan örnek heyecanlandırmak ve görüntüleme amacı yayılan floresan yakalayacak. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kırınım sınırlı ve dSTORM görüntüleri. (A) Karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin görüntü yetersiz modu ortalama ile, açıkça görülebilir uyarma deseni ile sonuçlanan. (B)(A)ile aynı bölge , ancak yeterli mod ortalaması ile, homojen uyarma ile sonuçlanan. (C) (B)inset sınırlı görüntü kırınım ; (D) dAynı bölgenin STORM görüntüsü. (E) Inset of (D), açıkça hücreplazma zarında fenestrations gösteren. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: sıçan LSECs dSTORM görüntü. (A) Sıçan LSECs alexa 647 lekeli tubulin görüş dSTORM görüntü büyük alan. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) Kırınım sınırlı (sol altta) ve dSTORM görüntüsünü (sağ üst) karşılaştıran (A)daha büyük işaretli bölge. (C) Daha küçük işaretli bölge (A). Ölçek çubuğu = 1 μm. Görüntü 76 nm çözünürlüğe sahiptir. Helle ve ark. 20196izni ile uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Çip tabanlı görüntüleme geleneksel dSTORM görüntüleme benzer. Böylece görüntü kalitesi geleneksel dSTORM görüntülemeile aynı yaklaşımlar kullanılarak ölçülebilir. Kullanıcı için temel fark şeffaf cam slayt opak bir Si-gofret ile değiştirilir olmasıdır. Çok farklı görünseler de, örnek işleme neredeyse cam bir slayta benzer. Cips oldukça sağlam ve kolayca gofret cımbız kullanılarak ele alınabilir. Görüntüleme prosedürü ve görüntü rekonstrüksiyonu normal bir dSTORM deneyinde olduğu gibi aynıdır. İşlevsel çip tabanlı bir mikroskop kurmak, fotonik yongalar dışında özel bileşenler gerektirmez. Kurulum daha fazla bilgi önceki çalışmada bulunabilir6,7. Bu çalışmada kullanılan yongalar standart fotolitografi8kullanılarak imal edilmiştir.
Numune hazırlama, numune haznesinin hazırlanmasını kapsar. PDMS çerçevesini çipe takarken, havanın girebileceği küçük kıvrımlardan veya yırtıklardan kaçınmak çok önemlidir. PDMS takarken katlanırsa, bir cızırdaya dikkatlice çıkarın ve yeniden takın. Numune PDMS odası içinde hazır olduğunda, kapak camı ona bastırılmalı ve bölgeyi mühürlemelidir. Bu coverglass takArak oluşabilir herhangi bir hava kabarcıkları önlemek için önemlidir. Bir hava kabarcığı oluşursa, kapak camı nazikçe çıkarın ve numunenin kapalı olduğundan emin olmak için örnek haznesine PBS ekleyin. Kapak fişinin hazırlanması ve eki daha sonra yeniden yapılabilir.
Bu kağıtta önerilen protokol kullanılarak dalga kılavuzuna ışık bağlama basitleştirilir. Ancak, bağlantı sınırlandırabilecek birkaç ortak sorun vardır. İlk olarak, çip düzgün bir şekilde temizlenmemişse ve arta kalan Herhangi bir PBS tamamen çıkarılmışsa, dalga kılavuzunda kir veya kristalize PBS olabilir. Bu görüntüleme bölgesinde çok az güç ile sonuçlanan, büyük kayıplara neden olabilir. Kapak camı dışında bölgeyi temizlemek için nemli bir bez kullanarak önemli ölçüde güç artırabilir. İkinci olarak, dalga kılavuzunun bağlantı yönü zarar görürse (örneğin, yanlış kullanım la), bağlantı kaybı büyük ölçüde artabilir. Kenarın optik muayenesi genellikle kolayca herhangi bir zarar ortaya çıkaracaktır. Çipin tüm bağlantı falı dikkatle parlatılmış olabilir, optik fiber gibi, ve pürüzsüz bir kaplin falı verecek, daha sonra birleştiğinde güç artar.
Işık birleştiğinde, görüntüleme prosedürü herhangi bir geleneksel dSTORM kurulum aynıdır. Şekil 2A'dagösterildiği gibi görüntüde homojen uyarma varsa, büyük olasılıkla ortalama mod iyi çalışmamıştır. Bunun en yaygın iki nedeni şunlardır: 1) ortalama bir yığın oluşturmak için yakalanan çok az görüntü ve 2) bir salınım mesafesi çok kısa / çok büyük bir adım boyutu. Çok az görüntü toplama bazı uyarma desenleri dışarı bırakabilirsiniz ve ortalama böylece homojen olacaktır. Bu, ortalama yığındaki görüntü sayısını artırarak kolayca çözülebilir. Salınım mesafesinin çok kısa lığı da homojen olmayan bir görüntüye neden olabilir, çünkü yeterli mod deleği heyecanlı değildir. Bu da kolayca salınım mesafesi artırarak ve / veya adım boyutu azaltarak çözülebilir. Bu çalışmada 20 μm üzerinde giriş lazer ışını tarayabilir ve en az 300 görüntü elde piezo sahne kullandık. Başka bir yaklaşım, 10-30 ms. Bu seçenek, hücre altı organellerin sürekli hareket halinde olduğu canlı hücre TIRF görüntülemesi için uygundur.
Çip tabanlı dSTORM, yüksek iş elde görüntüleme için ideal hale getiren eşi görülmemiş geniş bir TIRF uyarma sunar. Kompakt karakter, ters kurulumlar için çipin baş aşağı yerleştirilebildiği veya saydam yüzeylerin geliştirilebileceği ticari sistemlere güçlendirme olanağı sağlar. Cips toplu imal ve birçok ihtiyaca uyacak şekilde değiştirilebilir. Şu anda, ana kısıtlama 2D ile sınırlı olmasıdır. Evanescent alan dalga kılavuzu yüzeyinden sadece yaklaşık 200 nm uzakta mevcuttur, bu yüzden bu bölgede sadece florofores heyecanlı olacak. Entegre optik alanı, yeni görüntüleme sorularıyla başa çıkmanın yanı sıra mevcut olanlara yeni olanaklar sunarak yakın gelecekte çip tabanlı mikroskopi için birçok fırsat sunmaktadır.
Disclosures
B.S. Ahluwalia çip tabanlı optik nanoscopy için patent GB1606268.9 için başvurdu. Diğer yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.
Acknowledgments
Yazarlar Avrupa Araştırma Konseyi'ni (B.S.A.'ya verilen 336716 sayılı bağış) kabul etmek isterler. Yazarlar ayrıca irati Lagfragua kayıt ve video düzenleme ile onu paha biçilmez yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-axis sample stage | Standa | 7T173-20 | |
| 2-axis sample translation stage | Mad City Labs | Custom order | |
| 3-axis NanoMax stage | Thorlabs | MAX311D | |
| BXFM microscope body | Olympus | OLY-LSM-037018 | |
| CellMask Deep Red, Life technologies | ThermoFisher | C10046 | |
| Cleanroom grade swabs | MRC Technology | MFS-758 | |
| Fiber-coupled laser | Cobolt | Flamenco | |
| Filter Holder | Homemade | ||
| Hellmanex III, Hellma Gmbh | Sigma-Aldrich | Z805939 | Cleaning detergent concentrate |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935-1L | |
| KL 1600 LED | Olympus | OLY-LSM-E0433314 | |
| Olympus Coupling lens | Olympus | LMPLFLN 50x/0.5 | |
| Orca Flash 4.0 V2 | Hamamatsu | ||
| PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Mix according to descriptions |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer 1.1 kg kit | Dow | 1673921 | |
| Tip-tilt stage | Thorlabs | APR001 | |
| Vacuum holder | Thorlabs | HWV001 | |
| Wafer Tweezers Type 2W | Agar scientific | AGT5051 |
References
- Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nature Methods. 5 (6), 527-529 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
- Wazawa, T., Ueda, M. Total internal reflection fluorescence microscopy in single molecule nanobioscience. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 77-106 (2005).
- Jalali, B., Fathpour, S.
- Helle, ØI., Coucheron, D. A., Tinguely, J. C., Øie, C. I., Ahluwalia, B. S. Nanoscopy on-a-chip: super-resolution imaging on the millimeter scale. Optics Express. 27 (5), 6700-6710 (2019).
- Diekmann, R., et al.
- Tinguely, J. C., Helle, ØI., Ahluwalia, B. S. Silicon nitride waveguide platform for fluorescence microscopy of living cells. Optics Express. 25 (22), 27678-27690 (2017).
- Ahluwalia, B. S., McCourt, P., Huser, T., Hellesø, O. G. Optical trapping and propulsion of red blood cells on waveguide surfaces. Optics Express. 18 (20), 21053-21061 (2010).
- Coucheron, D. A., Wadduwage, D. N., Murugan, G. S., So, P. T. C., Ahluwalia, B. S. Chip-Based Resonance Raman Spectroscopy Using Tantalum Pentoxide Waveguides. IEEE Photonics Technology Letters. 31 (14), 1127-1130 (2019).
- Helle, ØI., Dullo, F. T., Lahrberg, M., Tinguely, J. C., Ahluwalia, B. S. Structured illumination microscopy using a photonic chip. ArXiV. , https://arxiv.org/abs/1903.05512v1 (2019).
- Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Archetti, A., Glushkov, E., Sieben, C., Stroganov, A., Radenovic, A., Manley, S. Waveguide-PAINT offers an open platform for large field-of-view super-resolution imaging. Nature Communications. 10, (2019).
- Braet, F., Wisse, E. Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review. Comparative Hepatology. 1, 1 (2002).
