Chip-baserade super-resolution optisk mikroskopi är en ny metod för fluorescens mikroskopi och erbjuder fördelar i kostnadseffektivitet och genomströmning. Här, protokollen för chip beredning och Imaging visas för TIRF mikroskopi och lokalisering-baserad super-resolution mikroskopi.
Total intern reflektions fluorescens (TIRF) används ofta i enkel molekyl lokalisering baserad super-resolution mikroskopi eftersom det ger förbättrad kontrast på grund av optisk snittning. Den konventionella metoden är att använda hög numerisk bländare Mikroskop TIRF mål för både excitation och insamling, allvarligt begränsa synfält och genomströmning. Vi presenterar en ny metod för att generera TIRF excitation för avbildning med optiska vågledare, kallad chip-baserad nanoskopi. Syftet med detta protokoll är att demonstrera hur chip-baserad avbildning utförs i en redan byggd installation. Den största fördelen med chip-baserad nanoskopi är att excitation och insamlings vägar är frikopplade. Imaging kan sedan göras med en låg förstoringslins, vilket resulterar i stora synfält TIRF bilder, till priset av en liten minskning i upplösning. Lever sinusoidala endotelceller (LSECs) var avbildas med hjälp av direkt stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi (dStorm), visar en upplösning jämförbar med traditionella super-resolution Mikroskop. Dessutom visar vi de höga kapacitet genom att avbilda en 500 μm x 500 μm region med en låg förstoringslins, vilket ger en upplösning på 76 nm. Genom sin kompakta karaktär kan chip-baserad avbildning eftermonteras i de flesta vanliga Mikroskop och kan kombineras med andra optiska on-chip tekniker, såsom on-chip avkänning, spektroskopi, optisk fångst, etc. Tekniken är därför idealisk för hög genomströmning 2D super-upplösning Imaging, men erbjuder också stora möjligheter för multimodala analyser.
Sedan den första demonstrationen av enkel molekyl lokalisering mikroskopi, många varianter har utvecklats för att lösa olika utmaningar1,2,3. En utmaning som har förblivit är dock stort synfält dSTORM Imaging. Många dStorm uppställningar använder samma objektiv för att både excitera provet och att avbilda den. För att öka synfältet behövs en låg förstoringslins. Objektiv med låg förstoring och låg numerisk bländare (NA) har vanligtvis ett stort skärpedjup, vilket ger en ökad out-of-Plane-signal som minskar lokaliserings precisionen. TIRF mål används ofta för att öka bildens kontrast genom att minska out-of-Plane fluorescens. Till och med tirf, magnetiseringen begränsas till en optisk tjocklek av ungefärligt 150 Nm från ytbehandla med hjälp av ett försvinnande sätter in4. TIRF objektiv kräver en stor NA resulterar i en liten synfält (FOV) (t. ex. 50 x 50 μm2), vilket begränsar dataflödet avsevärt. Det finns dock alternativa sätt att generera ett försvinnande fält.
En optisk vågledare är en struktur som kommer att begränsa och vägleda ljus om den är kopplad till strukturen. Oftast används vågledare i fiberbaserad telekommunikation. Stora ansträngningar har gjorts för att utveckla 2D integrerade vågledare som en huvudkomponent i fotoniska integrerade kretsar. Tekniken har avancerat till en punkt där fabricera låg förlust nano-strukturerade optiska vågledningar kan rutinmässigt göras5. Idag kan flera gjuterier runt om i världen användas för att utveckla fotoniska integrerade kretsar. Waveguides vägleda ljus genom total inre reflektans också uppvisar en försvinnande fält på ytan. Genom noggrann utformning av vågledar strukturen kan en hög intensitet uppnås i det försvinnande fältet. Ett prov placerat direkt ovanpå vågledar ytan kan därmed också belysas av det försvinnande fältet för bild applikationer. Det försvinnande sätter in ska genereras längs den hela längden och bredden av waveguideen, och thus kan det göras godtyckligt stort6.
Vi presenterar en ny strategi för TIRF dstorm som erbjuder ett godtyckligt stort synfält. Istället för att använda en tirf lins för både excitation och insamling, excitera vi med hjälp av den försvinnande fältet från optiska vågledare. Detta frikopplar excitation och insamling ljus vägen, vilket möjliggör total frihet längs insamling ljus bana utan att äventyra den optiska snittning för en given våglängd som den vågledare chip belysning. Låg förstoring linser kan således användas för att bilden mycket stora regioner i TIRF läge, även om en mindre NA kommer att minska den laterala upplösningen. Dessutom är Multicolor Imaging också kraftigt förenklad med hjälp av vågledare7, eftersom flera våglängder kan styras och detekteras utan att justera systemet. Detta är fördelaktigt för dStorm, eftersom låga våglängder kan användas för att förbättra fluorophore blinkande och för Multicolor Imaging. Det är värt att notera att penetrationsdjupet av den försvinnande fältet kommer att ändras som en funktion av våglängd, även om det inte påverkar hur Imaging förfarandet utförs. Chippet är kompatibelt med Live cell Imaging8 och är idealiskt för tillämpningar som integrering av mikrofluidik. Varje chip kan innehålla tiotals vågledare, som kan tillåta användaren att bilden under olika förhållanden eller tillämpa optisk svällning9 och Raman spektroskopi10.
Det chip-baserade systemet fungerar lika bra för både diffraktions-begränsad och super-upplösning Imaging. Ett liknande tillvägagångssätt infördes i 2005 med hjälp av ett prisma för att generera försvinnande fält excitation4. Den fotoniska chip också Exciter genom den försvinnande fältet, men med moderna vågledare Fabrication tekniker, kan man generera exotiska ljusmönster med vågbrytare. Den nuvarande chip-baserade nanoskopi genomförandet är begränsad till 2D-avbildning endast, som excitation fältet är låst inuti vågledar ytan. Framtida utveckling kommer att syfta till 3D-applikationer. Dessutom, andra super-resolution tekniker såsom strukturerade belysningsmikroskopi utvecklas med hjälp av samma chip-baserade Mikroskop11.
Chip-baserad avbildning liknar konventionell dStorm Imaging. Bildkvaliteten kan därför mätas med samma metoder som för traditionell d-Storm-avbildning. Den största skillnaden för användaren är att den genomskinliga glas bilden byts ut mot en ogenomskinlig si-wafer. Även om de verkar mycket olika, är provhanteringen praktiskt taget jämförbar med en glas bild. Spånorna är ganska robusta och kan enkelt hanteras med hjälp av en wafer-pincett. Avbildnings proceduren och bild rekonstruktion är densamma som i ett vanligt dStorm experiment. Att inrätta ett funktionellt chip-baserat Mikroskop kräver inga speciella komponenter, med undantag för fotoniska chips. Mer information om uppställ finns i tidigare arbeten6,7. De marker som används i detta arbete har tillverkats med hjälp av standard Photolithography8.
Provberedningen omfattar beredning av provkammaren. När du fäster PDMS ram till chip, är det viktigt att undvika alla små veck eller rippar där luft kan komma in. Om PDMS veck när fästa den, enkelt flytta den försiktig med en pincett och sätta igen den. När provet är färdigt i PDMS-kammaren måste täckglaset pressas mot det, vilket tätar området. Det är viktigt att undvika eventuella luftbubblor som kan bildas när täckglaset fästs. Om en luftbubbla bildas, ta försiktigt bort täckglaset och tillsätt PBS till provkammaren för att säkerställa att provet täcks. Preparering och infästning av täckslip kan sedan helt enkelt redone.
Kopplings ljuset i vågledaren förenklas med hjälp av det protokoll som föreslås i detta dokument. Det finns dock några vanliga utmaningar som kan begränsa kopplingen. För det första, om chippet inte rengjorts ordentligt och alla kvarvarande PBS avlägsnas helt, kan det finnas smuts eller kristalliserad PBS på vågledaren. Detta kan medföra stora förluster, vilket resulterar i mycket lite ström i bild regionen. Att använda en fuktig pinne för att rengöra regionen utanför täckglaset kan förbättra kraften avsevärt. För det andra, om kopplings aspekten av vågledaren är skadad (t. ex. genom felaktig hantering) kan kopplings förlusten öka drastiskt. Optisk inspektion av kanten kommer vanligtvis avslöja eventuella skador lätt. Hela kopplingen aspekt av chip kan poleras försiktigt, ungefär som en optisk fiber, och kommer att ge en smidig koppling aspekt, som sedan ökar den kopplade makten.
Efter att ljuset kopplats ihop är avbildnings proceduren densamma som i alla konventionella dStorm-inställningar. Om bilden har inhomogena excitation, vilket visas i figur 2A, då troligen läge medelvärdes inte fungerade bra. De två vanligaste orsakerna till detta är: 1) för få bilder tagna för att skapa en genomsnittlig stapel och 2) för kort för en svängning avstånd/för stor av en steg storlek. Samla för få bilder kan utelämna vissa excitation mönster och genomsnittet kommer således att vara inhomogena. Detta kan enkelt lösas genom att öka antalet bilder i den genomsnittliga stacken. För kort av en svängning avstånd kan också resultera i en inhomogen bild, eftersom inte tillräckligt läge mönster är upphetsad. Detta kan också lätt lösas genom att öka svängning avstånd och/eller minska stegstorleken. I detta arbete har vi använt en piezo skede för att skanna in laserstrålen över 20 μm och förvärva minst 300 bilder. En annan metod kan vara att använda höghastighets galvo-speglar för att skanna ljuset över ingången vågledare aspekten inom en enda förvärvs tid, såsom 10-30 ms. detta alternativ är lämplig för levande cell tirf Imaging, där sub-cellulära organeller är i ständig rörelse.
Chip-baserade dStorm erbjuder en oöverträffad stor yta tirf excitation, vilket gör det idealiskt för hög genomströmning Imaging. Den kompakta karaktären möjliggör eftermontering till kommersiella system, där chippet kan placeras upp och ner för inverterade uppställningar eller genomskinliga substrat kan utvecklas. Spånorna är massfabricerade och kan modifieras för att passa många behov. För närvarande är den viktigaste begränsningen att den är begränsad till 2D. Den försvinnande fältet är endast tillgänglig ca 200 nm bort från vågledare ytan, så endast fluoroforer inom denna region kommer att vara upphetsad. Sammantaget erbjuder området integrerad optik många möjligheter till chip-baserad mikroskopi inom en snar framtid, genom att ta itu med nya avbildnings frågor samt ge nya möjligheter till befintliga.
The authors have nothing to disclose.
Författarna skulle vilja erkänna Europeiska forskningsrådet (Grant nr 336716 till B.S.A.). Författarna vill också tacka Irati Lagfragua för hennes ovärderliga hjälp med att spela in och redigera videon.
1-axis sample stage | Standa | 7T173-20 | |
2-axis sample translation stage | Mad City Labs | Custom order | |
3-axis NanoMax stage | Thorlabs | MAX311D | |
BXFM microscope body | Olympus | OLY-LSM-037018 | |
CellMask Deep Red, Life technologies | ThermoFisher | C10046 | |
Cleanroom grade swabs | MRC Technology | MFS-758 | |
Fiber-coupled laser | Cobolt | Flamenco | |
Filter Holder | Homemade | ||
Hellmanex III, Hellma Gmbh | Sigma-Aldrich | Z805939 | Cleaning detergent concentrate |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935-1L | |
KL 1600 LED | Olympus | OLY-LSM-E0433314 | |
Olympus Coupling lens | Olympus | LMPLFLN 50x/0.5 | |
Orca Flash 4.0 V2 | Hamamatsu | ||
PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Mix according to descriptions |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer 1.1 kg kit | Dow | 1673921 | |
Tip-tilt stage | Thorlabs | APR001 | |
Vacuum holder | Thorlabs | HWV001 | |
Wafer Tweezers Type 2W | Agar scientific | AGT5051 |