Die chipbasierte optische Superauflösungsmikroskopie ist ein neuartiger Ansatz in der Fluoreszenzmikroskopie und bietet Vorteile in Bezug auf Wirtschaftlichkeit und Durchsatz. Hier werden die Protokolle für die Chipvorbereitung und -bildgebung gezeigt für die TIRF-Mikroskopie und die lokalisierungsbasierte Superauflösungsmikroskopie.
Die gesamte interne Reflexionsfluoreszenz (TIRF) wird häufig in der auf einer lokalisierungsbasierten Mikromikroskopie mit einer einzigen Moleküllokalisation verwendet, da sie durch optische Schnitte einen verbesserten Kontrast bietet. Der herkömmliche Ansatz besteht darin, tirF-Objektive mit hohem numerischen Blendemikroskop sowohl für die Anregung als auch für die Erfassung zu verwenden, wodurch das Sichtfeld und der Durchsatz stark eingeschränkt werden. Wir präsentieren einen neuartigen Ansatz zur Erzeugung von TIRF-Erregung für die Bildgebung mit optischen Wellenleitern, der sogenannten chipbasierten Nanoskopie. Ziel dieses Protokolls ist es, zu demonstrieren, wie die chipbasierte Bildgebung in einem bereits erstellten Setup durchgeführt wird. Der Hauptvorteil der chipbasierten Nanoskopie besteht darin, dass die Anregungs- und Sammelwege entkoppelt sind. Die Bildgebung kann dann mit einer Linse mit geringer Vergrößerung durchgeführt werden, was zu einem großen Sichtfeld von TIRF-Bildern führt, zum Preis einer geringen Reduzierung der Auflösung. Lebersinus-Endothelzellen (LSECs) wurden mit der direkten stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie(dSTORM) abgebildet, die eine Auflösung zeigt, die mit herkömmlichen Superauflösungsmikroskopen vergleichbar ist. Darüber hinaus demonstrieren wir die Hochdurchsatz-Fähigkeiten, indem wir einen Bereich mit einer niedrigen Vergrößerungslinse mit einer Auflösung von 76 nm abbilden. Durch seinen kompakten Charakter lässt sich die chipbasierte Bildgebung in die gängigsten Mikroskope umrüsten und mit anderen optischen On-Chip-Techniken wie On-Chip-Sensing, Spektroskopie, optisches Trapping usw. kombinieren. Die Technik eignet sich somit ideal für hochauflösende Bildgebung mit hohem Durchsatz, bietet aber auch große Möglichkeiten für multimodale Analysen.
Seit der ersten Demonstration der Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie wurden viele Variationen entwickelt, um verschiedene Herausforderungen zu lösen1,2,3. Eine Herausforderung, die geblieben ist, ist jedoch großes Sichtfeld dSTORM Bildgebung. Viele dSTORM-Setups verwenden das gleiche Objektiv, um die Probe zu begeistern und zu bebildern. Um das Sichtfeld zu vergrößern, ist eine Linse mit geringer Vergrößerung erforderlich. Objektivlinsen mit geringer Vergrößerung und niedriger numerischer Blende (NA) haben in der Regel eine große Schärfentiefe, was zu einem erhöhten Signal a-of-plane führt, das die Lokalisierungsgenauigkeit verringert. TIRF-Objektive werden häufig verwendet, um den Bildkontrast zu erhöhen, indem die Fluoreszenz a-ebenereduziert wird. Durch TIRF wird die Anregung mittels eines evaneszenten Feldes4auf eine optische Dicke von ca. 150 nm von der Oberfläche begrenzt. TIRF-Objektive benötigen eine große NA, was zu einem kleinen Sichtfeld (FOV) (z.B. 50 x 50‘m2) führt, was den Durchsatz deutlich begrenzt. Es gibt jedoch alternative Möglichkeiten, ein evaneszierendes Feld zu generieren.
Ein optischer Wellenleiter ist eine Struktur, die Licht einschränkt und leitet, wenn es in die Struktur gekoppelt ist. Am häufigsten werden Wellenleiter in der faserbasierten Telekommunikation verwendet. Es wurden große Anstrengungen unternommen, um 2D-integrierte Wellenleiter als Hauptbestandteil photonischer integrierter Schaltungen zu entwickeln. Die Technologie hat sich so weit entwickelt, dass die Herstellung von verlustarmen nanostrukturierten optischen Wellenleitern routinemäßig durchgeführt werden kann5. Heute können mehrere Gießereien auf der ganzen Welt verwendet werden, um photonische integrierte Schaltungen zu entwickeln. Wellenleiter leiten Licht durch die gesamte innere Reflexion, die auch ein evaneszierendes Feld an der Oberfläche aufweist. Durch sorgfältiges Design der Wellenleiterstruktur kann eine hohe Intensität im evaneszenten Bereich erreicht werden. Eine direkt auf der Wellenleiteroberfläche platzierte Probe kann somit auch durch das evaneszente Feld für bildgebende Anwendungen beleuchtet werden. Das evanescent Feld wird über die gesamte Länge und Breite des Wellenleiters erzeugt und kann somit beliebig groß gemacht werden6.
Wir präsentieren einen neuartigen Ansatz zu TIRF dSTORM, der ein beliebig großes Sichtfeld bietet. Anstatt eine TIRF-Linse sowohl für Dieregung als auch für die Sammlung zu verwenden, begeistern wir das evanescent-Feld von optischen Wellenleitern. Dadurch entkoppelt sich der Anregungs- und Sammellichtweg und ermöglicht so eine völlige Freiheit entlang des Sammlungslichtwegs, ohne die optische Nip. für eine bestimmte Wellenlänge zu beeinträchtigen, die durch die Wellenleiter-Chip-Beleuchtung bereitgestellt wird. Objektive mit geringer Vergrößerung können somit verwendet werden, um sehr große Regionen im TIRF-Modus abzubilden, obwohl eine kleinere NA die seitliche Auflösung reduziert. Darüber hinaus wird die mehrfarbige Bildgebung mit Wellenleitern7stark vereinfacht, da mehrere Wellenlängen geführt und erfasst werden können, ohne das System neu justieren zu müssen. Dies ist vorteilhaft für dSTORM, da niedrige Wellenlängen verwendet werden können, um Fluorophor-Blinken zu verbessern und für mehrfarbige Bildgebung. Es ist erwähnenswert, dass sich die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes als Funktion der Wellenlänge ändert, obwohl sie keinen Einfluss darauf hat, wie das bildgebende Verfahren durchgeführt wird. Der Chip ist kompatibel mit Live-Zell-Bildgebung8 und eignet sich ideal für Anwendungen wie die Integration von Mikrofluidik. Jeder Chip kann Dutzende von Wellenleitern enthalten, die es dem Benutzer ermöglichen können, unter verschiedenen Bedingungen abzubilden oder optische Stolpermittel9 und Raman-Spektroskopie10anzuwenden.
Das Chip-basierte System funktioniert gleichermaßen gut für beugungsbegrenzte und super-Auflösung-Bildgebung. Ein ähnlicher Ansatz wurde 2005 mit einem Prisma eingeführt, um eine evaneszente Felderregung zu erzeugen4. Der photonische Chip begeistert auch durch das evanescent Feld, aber mit modernen Waveguide-Fertigungstechniken kann man exotische Lichtmuster mit Wellenleitern erzeugen. Die derzeitige Chip-basierte Nanoskopie-Implementierung ist auf 2D-Bildgebung beschränkt, da das Anregungsfeld innerhalb der Wellenleiteroberfläche gesperrt ist. Die zukünftige Entwicklung wird auf 3D-Anwendungen abzielen. Darüber hinaus werden weitere Super-Resolution-Techniken wie die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie mit dem gleichen Chip-basierten Mikroskop11entwickelt.
Chipbasierte Bildgebung ähnelt der herkömmlichen dSTORM-Bildgebung. Die Bildqualität kann somit mit den gleichen Ansätzen wie bei der herkömmlichen dSTORM-Bildgebung gemessen werden. Der Hauptunterschied für den Anwender ist, dass die transparente Glasrutsche mit einem opaken Si-Wafer ausgetauscht wird. Obwohl sie sehr unterschiedlich erscheinen, ist die Probenhandhabung praktisch analog zu einer Glasrutsche. Die Chips sind recht robust und können leicht mit einer Wafer-Pinzette gehandhabt werden. Das bildgebende Verfahren und die Bildrekonstruktion sind die gleichen wie bei einem regulären dSTORM-Experiment. Die Einrichtung eines funktionellen Chip-basierten Mikroskops erfordert keine speziellen Komponenten, außer den photonischen Chips. Weitere Einzelheiten zum Aufbau finden Sie in früheren Arbeiten6,7. Die in dieser Arbeit verwendeten Chips wurden mit Standard-Photolithographie8hergestellt.
Die Probenvorbereitung umfasst die Vorbereitung der Probenkammer. Beim Anbringen des PDMS-Rahmens am Chip ist es wichtig, kleine Falten oder Risse zu vermeiden, bei denen Luft eindringen könnte. Wenn das PDMS beim Anbringen faltet, entfernen Sie es einfach vorsichtig mit einer Pinzette und befestigen Sie es wieder. Wenn die Probe in der PDMS-Kammer fertig ist, muss das Deckglas dagegen gedrückt werden, um den Bereich zu versiegeln. Es ist wichtig, Luftblasen zu vermeiden, die sich beim Anbringen des Deckglases bilden könnten. Wenn eine Luftblase gebildet wird, entfernen Sie vorsichtig das Deckglas und fügen Sie PBS in die Probenkammer, um sicherzustellen, dass die Probe abgedeckt ist. Die Vorbereitung und Befestigung des Deckelbelegs kann dann einfach wieder aufbereitet werden.
Die Kopplung von Licht in den Wellenleiter wird durch das in diesem Dokument vorgeschlagene Protokoll vereinfacht. Es gibt jedoch einige gemeinsame Herausforderungen, die die Kopplung einschränken können. Erstens, wenn der Chip nicht richtig gereinigt wurde und alle übrig gebliebenen PBS vollständig entfernt wurden, kann es Schmutz oder kristallisierte PBS auf dem Wellenleiter geben. Dies kann zu großen Verlusten führen, was zu sehr wenig Leistung im Bildbereich führen kann. Die Verwendung eines feuchten Tupfers, um den Bereich außerhalb des Deckglases zu reinigen, kann die Leistung erheblich verbessern. Zweitens kann sich der Kupplungsverlust drastisch erhöhen, wenn die Kupplungsfacette des Wellenleiters beschädigt ist (z.B. durch unsachgemäße Handhabung). Optische Inspektion der Kante wird in der Regel alle Schäden leicht aufdecken. Die gesamte Kupplungsfacette des Chips kann sorgfältig poliert werden, ähnlich wie eine optische Faser, und gibt eine glatte Kupplungsfacette, die dann die gekoppelte Leistung erhöht.
Nachdem das Licht gekoppelt wurde, ist das Bildgebungsverfahren das gleiche wie bei jedem herkömmlichen dSTORM-Setup. Wenn das Bild eine inhomogene Anregung hat, wie in Abbildung 2Agezeigt, dann hat die Mittelung des Modus höchstwahrscheinlich nicht gut funktioniert. Die beiden häufigsten Gründe dafür sind: 1) zu wenige Bilder, die aufgenommen wurden, um einen durchschnittlichen Stapel zu erstellen, und 2) zu kurz vor einem Schwingungsabstand/zu groß von einer Schrittgröße. Das Sammeln von zu wenigen Bildern kann einige Erregungsmuster auslassen und der Durchschnitt wird daher inhomogen sein. Dies kann leicht gelöst werden, indem die Anzahl der Bilder im durchschnittlichen Stapel erhöht wird. Zu kurz vor einem Schwingungsabstand kann auch zu einem inhomogenen Bild führen, da nicht genügend Modusmuster angeregt werden. Dies kann auch leicht durch Erhöhung des Schwingungsabstandes und/oder Verringern der Schrittgröße gelöst werden. In dieser Arbeit haben wir eine Piezo-Stufe verwendet, um den Eingangslaserstrahl über 20 m zu scannen und mindestens 300 Bilder zu erfassen. Ein anderer Ansatz könnte darin bestehen, mit Hochgeschwindigkeits-Galvo-Spiegeln das Licht innerhalb einer einzigen Erfassungszeit über die Eingangswellenführung zu scannen, z. B. 10-30 ms. Diese Option eignet sich für die TirF-Bildgebung von Lebendenzellen, bei denen subzelluläre Organellen in konstanter Bewegung sind.
Chip-basiertes dSTORM bietet eine beispiellose großflächige TIRF-Erregung, die es ideal für die Bildgebung mit hohem Durchsatz eignet. Der kompakte Charakter ermöglicht die Nachrüstung auf kommerzielle Systeme, bei denen der Chip für invertierte Setups auf den Kopf gestellt oder transparente Substrate entwickelt werden können. Die Chips sind massengefertigt und können an viele Bedürfnisse angepasst werden. Derzeit ist die Hauptbeschränkung, dass es auf 2D beschränkt ist. Das evaneszente Feld ist nur ca. 200 nm von der Wellenleiteroberfläche entfernt verfügbar, so dass nur Fluorophore in dieser Region angeregt werden. Insgesamt bietet der Bereich der integrierten Optik in naher Zukunft viele Möglichkeiten für die chipbasierte Mikroskopie, indem neue bildgebende Fragen angegangen und bestehende Möglichkeiten eröffnet werden.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren möchten den Europäischen Forschungsrat (Zuschuss Nr. 336716 an B.S.A.) würdigen. Die Autoren danken auch Irati Lagfragua für ihre unschätzbare Unterstützung bei der Aufnahme und Bearbeitung des Videos.
1-axis sample stage | Standa | 7T173-20 | |
2-axis sample translation stage | Mad City Labs | Custom order | |
3-axis NanoMax stage | Thorlabs | MAX311D | |
BXFM microscope body | Olympus | OLY-LSM-037018 | |
CellMask Deep Red, Life technologies | ThermoFisher | C10046 | |
Cleanroom grade swabs | MRC Technology | MFS-758 | |
Fiber-coupled laser | Cobolt | Flamenco | |
Filter Holder | Homemade | ||
Hellmanex III, Hellma Gmbh | Sigma-Aldrich | Z805939 | Cleaning detergent concentrate |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935-1L | |
KL 1600 LED | Olympus | OLY-LSM-E0433314 | |
Olympus Coupling lens | Olympus | LMPLFLN 50x/0.5 | |
Orca Flash 4.0 V2 | Hamamatsu | ||
PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Mix according to descriptions |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer 1.1 kg kit | Dow | 1673921 | |
Tip-tilt stage | Thorlabs | APR001 | |
Vacuum holder | Thorlabs | HWV001 | |
Wafer Tweezers Type 2W | Agar scientific | AGT5051 |