Summary
CAL-1 plazmasitoid dendritik hücre hattında endojen interferon düzenleyici faktör 5 dimerizasyon analizi için bir yerli Batı leke yöntemi tanımlanmıştır. Bu protokol diğer hücre satırlarına da uygulanabilir.
Abstract
İnterferon düzenleyici faktör 5 (IRF5) bağışıklık yanıtını düzenleyen önemli bir transkripsiyon faktörüdür. Toll benzeri reseptör miyeloid diferansiyasyon primer yanıt geni 88 (TLR-MyD88) sinyal yolu aşağı aktive edilir. IRF5 aktivasyonu fosforilasyon içerir, dimerizasyon, ve çekirdek içine sitoplazma sonraki translokasyon, hangi sırayla çeşitli pro-inflamatuar sitokinlerin gen ekspresyonuna neden olur. IRF5 aktivasyonu için bir algılama tayini IRF5 fonksiyonları ve ilgili yolları incelemek için gereklidir. Bu makalede, CAL-1 insan plazmasitoid dendritik hücre (pDC) hattında endojen IRF5 aktivasyonunu saptamak için sağlam bir teşp açıklanmaktadır. Protokol, IRF5'i monomer ve dimer formlarında ayırt edebilen modifiye nondenaturing elektroforez testinden oluşur ve böylece IRF5 aktivasyonunu analiz etmek için uygun maliyetli ve hassas bir yaklaşım sağlar.
Introduction
İnterferon düzenleyici faktör 5 (IRF5) bağışıklık yanıtının düzenlenmesinde önemli bir rol oynayan önemli bir transkripsiyon düzenleyicisidir, özellikle pro-inflamatuar sitokinlerin ve tip I interferansların (IFNs) 1,2 ,3. IRF5'in yanlış regülasyonu, sistemik lupus eritematozus, multipl skleroz, romatoid artrit,vb.ile ilişkili IRF5 lokusundaki çeşitli polimorfizmler ile belirgin olarak, çok sayıda otoimmün hastalıkta katkıda bulunan birfaktördür. 5,6,7,8,9,10. Bu nedenle, endojen IRF5 aktivasyon durumu için sağlam bir algılama analizi fizyolojik olarak ilgili hücresel bağlamda IRF5 düzenleyici yolları ve downstream etkilerini anlamak için çok önemlidir.
IRF5, monositler, dendritik hücreler (DC), B hücreleri ve makrofajlar 1,11ile ifade edilir. Diğer IRF aile transkripsiyon faktörlerinde olduğu gibi, IRF5 gizli durumunda sitoplazmada bulunur. Aktivasyon üzerine, IRF5 fosforile edilir ve homodimerler oluşturur, bu da daha sonra çekirdeğe dönüşür ve tip I IFN'leri ve pro-inflamatuar sitokinleri kodlayan genlerin belirli düzenleyici unsurlarına bağlanır ve sonunda bu genlerin ekspresyonunu indükler1 ,2,11,12,13. IRF5 çeşitli Toll benzeri reseptörlerin (TLR), TLR 7, TLR 8 ve TLR 9, endozos lokalize ve sinyal 1 için MyD88 kullanın gibi doğuştan gelen bağışıklık yanıtları düzenler1 ,11,14. Bu TLR öncelikle tek iplikçikli RNA (ssRNA) ve bir enfeksiyon15, 16,17,18semptomatik olan metillenmemiş CpG DNA gibi yabancı nükleik asit türlerini tanımak . IRF5 bakteriyel karşı bağışıklık yanıtlarını düzenleyen gösterilmiştir, viral, ve mantar enfeksiyonları19,20,21. Bağışıklık sisteminde IRF5 etkili ve çeşitli rolü göz önüne alındığında, artırılması veya IRF5 aktivitesi nemlendirici terapötik ajanların gelişimi için yeni bir cadde olarak hizmet verebilir22. Bu nedenle, farklı hücre tiplerinde IRF5 aktivitesini düzenleyen yolların ve mekanizmaların ayrıntılı araştırılmasına olanak sağlamak için endojen IRF5'in aktivasyon durumunu izlemek için bir protokol geliştirmek önemlidir.
Bilgimiz dahilinde, bu protokolün geliştirilmesinden önce endojen IRF5 aktivasyonu için biyokimyasal veya jel elektroforetik test yayınlanmamıştır. Fosforilasyon IRF5 aktivasyonunun önemli bir ilk adımı olarak gösterilmiştir ve IRF5 aktivitesi için önemli olan serin kalıntısının keşfi ve onayına yol açan fosfospesifik IRF5 antikor geliştirilmiştir13. Ancak, antikor immünoppresipitated veya overexpressed23fosforilize IRF5 açıkça algılarken, elimizde bütün bir hücre lysate IRF5 fosforilasyon tespit etmek için başarısız (veri gösterilmez). Dimerization IRF5 aktivasyonunun bir sonraki adımıdır ve bu adımı araştıran bugüne kadar yapılan birçok önemli çalışma, genellikle normalde IRF511,12 ifade etmeyen alakasız hücre tiplerinde, epitop etiketli IRF5'in aşırı ekspresyonuna dayanıyordu. ,24,25. Önceki çalışmalar, dimerized IRF5 her zaman çekirdek içine translocate olmayabilir ve bu nedenle mutlaka tam olarak aktif olmadığını göstermiştir25,26. Endojen IRF5 nükleer lokalizasyonu için bir tizin görüntüleme akışı sitometri27ile IRF5 aktivasyonunu değerlendirmek için geliştirilmiştir. Bu test, özellikle primer veya nadir hücre tiplerinde28,29 ve bu alandaki bilgiyi büyük ölçüde ilerleten IRF5 aktivitesini anlamak için çok önemli olan çalışmalarda uygulanmıştır. Ancak, bu test araştırmacılar için yaygın olarak mevcut olmayan özel bir alete dayanır. Ayrıca, IRF5 düzenleyici yollarını incelerken ve yukarı akım düzenleyicileri ve yol bileşenlerini tanımlarken aktivasyonun ilk adımlarını araştırmak genellikle gereklidir. Bu çalışma, IRF5'in moleküler biyoloji araçları ile donatılmış laboratuvarlarda yapAbilen erken aktivasyon olayları için sağlam ve güvenilir bir biyokimyasal tahlil sağlamaktadır. Burada açıklanan protokol, özellikle IRF5 nükleer lokalizasyonun görüntüleme akışı sitometrik analizi gibi ortogonal tahlillerle birleştirildiğinde, IRF5 eylemlerinin yollarını ve mekanizmalarını araştırmada çok yararlı olacaktır23, 27,28,30.
Yerli poliakrilamid jel elektroforez (yerli PAGE) protein kompleksleri analiz etmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir31,32. Sodyum dodecylsülfat poliakrilamid jel elektroforezinin (SDS-PAGE) aksine, yerli PAGE proteinleri şekil, boyut ve yük bazında ayırır. Ayrıca denatürasyon olmadan doğal protein yapısını korur31,33,34,35. Sunulan protokol, yerel PAGE'in bu özelliklerinden yararlanır ve IRF5'in hem monomerik hem de dimerik formlarını algılar. Endojen fosforlu IRF5'i algılayabilen uygun bir ticari antikor bulunmadığından, bu yöntem erken aktivasyon olaylarını saptayabında özellikle önemlidir. Daha önce, yayınlanan çeşitli çalışmalari IRF5 dimerization değerlendirmek için yerli PAGE kullanılır. Ancak, bu çalışmaların çoğunluğu aktivasyon durumu2,13,24,36,37 analiz etmek için ekzojen epitop etiketli IRF5 aşırı ekspresyonu bağlı . Bu çalışma, iRF5 aktivitesinin işlevi için çok önemli olduğu gösterilmiştir bir insan plazmasittoid dendritik hücre (pDC) hattında değiştirilmiş bir yerli PAGE tekniği ile endojen IRF5 dimerization analiz etmek için adım adım protokol sunar1, 38,39,40. Aynı teknik diğer hücrehatları23uygulanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Burada açıklanan protokol, TLR7/8 için bir agonist olan resiquimod (R848) ile tedavi edilen CAL-1 pDC hücre hattını kullanır. Bu protokol RAW 264.7 (murine makrofaj hattı), THP-1 (insan monositik hücre hattı), BJAB (insan B hücre hattı), Ramos (insan B hücre hattı) ve MUTZ-3 (insan dendritik hücre hattı)23dahil olmak üzere diğer insan ve murine hücre tipleri, uygulanmıştır.
1. CAL-1 Hücrelerinin Uyarılması
- %5 fetal sığır serumu (FBS), 25 mM HEPES ve 1x mercaptoetanol (yani tam RPMI 1640 orta) içeren 20−25 mL RPMI 1640 orta ile steril koşullarda 37 °C ve %5 CO2'de Bir T75 şişesinde CAL-1 hücre kültürlerini koruyun.
- Hücreleri 50 mL konik bir tüpe aktarın.
NOT: CAL-1 hücreleri yapışık değildir. Yapışık hücre tipleri için, standart tripsinizasyon hücreleri hasat yapılabilir. - Hücreleri 200 x g'de 5 dk oda sıcaklığında (RT) santrifüj edin. Homojen tek hücreli süspansiyon elde etmek için tam RPMI 1640 ortamının 8 mL'sinde süpernatantı çıkarın ve hücre peletini yeniden askıya alın.
- Hemositometre kullanarak hücreleri say. Her kuyuda 4 mL önceden ısıtılmış komple RPMI 1640 orta ile 6 kuyu plakası iyi başına 1 x 106 hücre yoğunluğunda hücreleri tohumlayın. 37 °C'de 20−24 saat ve %5 CO2'de inkübün le biraraya gelmesi %90−95'e (yaklaşık 1,5 x 106 hücreye karşılık gelen) ulaşabilirsiniz.
- 6 kuyu plakasının (1 μg/mL nihai konsantrasyonu) her biri için 4 μL 1 mg/mL R848 ekleyerek hücreleri uyarın. Ayrıca R848 tedavisi olmadan hücreler ile iyi bir uyarılmamış kontrol kurmak.
- R848'in plakayı yan yana hafifçe sallayarak eşit şekilde dağıldığından emin olun. Daha sonra, 37 °C ve% 5 CO2kuvözde 2−16 saat için hücreleri kuluçkaya yatırın.
2. Hücresel Proteinlerin Çıkarılması
- Hücre süspansiyonlarını 6 kuyu plakasından 5 mL santrifüj tüpe aktarın.
- Sentrifüj 200 x g için 5 dk RT. Süpernatant çıkarın ve homojen tek hücreli süspansiyon elde etmek için fosfat tamponlu salin (PBS) 1 mL hücre pelet yeniden askıya.
- Hücre süspansiyonuna 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
- 4 °C'de 0,5−1 dk için 12.000 x g'de kısa bir süre aşağı doğru döndürün ve süpernatantı dikkatlice çıkarın.
- 6,25 mL 1 M Tris-HCl pH 7,4 (25 mM nihai konsantrasyonu), 5 M NaCl 7,5 mL (150 mM nihai konsantrasyon), 0,5 mL 0,5 mL 0,5 MED (1 mM nihai konsantrasyon), 2,5 mL NP-40 (son konsantrasyon% 1) içeren lysis tamponunu hazırlayın ve 7.5 mL gliserol (%5 nihai konsantrasyon) deiyonize su (ddH2O) 250 mL içinde. Kullanmadan hemen önce lysis tamponuna 1x'lik son konsantrasyona 100x proteaz inhibitörü tek kullanımlık kokteyl ekleyin. Hazırlanan lysis tamponu buz üzerinde saklayın.
NOT: Proteaz olmadan lysis tampon 4 °C'de saklanabilir. - Hücre peletini 30 μL buz gibi lisis tamponunda yeniden askıya alın ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın.
- 15−20 dk boyunca buz üzerinde kuluçka.
- 4 °C'de 15−20 dk için 12.000 x g'de santrifüj ile lysate'yi netleştirin. Supernatant'ı yeni bir önceden soğutulmuş 1,5 mL santrifüj tüpe aktarın. Özleri her zaman buzda saklayın.
NOT: Hücre lisatları -20 °C veya -80 °C'de saklanabilir. Örnekleri kaynatmayın. - Bradford reaktifini kullanarak protein konsantrasyonu ölçün.
3. IRF5 Dimerization Analizi Yerli SAYFA
- Üst (-) ve alt (+) oda elektroforez tamponlarını hazırlayın. Üst oda tampon 1x yerli PAGE çalışan tampon% 0.3 sodyum deoksikolat (NaDOC) oluşur ve alt oda tampon çalışan sadece 1x yerli PAGE oluşur.
NOT: Her yeni çalışma için taze bir üst oda tampon hazırlayın. - Kuyuları bozmadan %3−%12 yerli PAGE jelini suyla iyice durulayın. Jeli mini jel tankına ayarlayın ve tarak çıkarın. Jeli 4 °C'lik soğuk bir odada veya 150 V'de 30 dk boyunca buz üzerinde pişirin.
NOT: Prerunning jel çalışmasını engelleyebilir aşırı amoni ve persülfat iyonları kaldırır. - Prerun sırasında, 4x yerli örnek tampon ile buz üzerinde tutulan hücresel proteinlerkarıştırarak yükleme için örnekleri hazırlamak.
- Prerun'dan sonra, numune başına son hacmi 10−15 μL olan 10−15 μg protein yükleyin.
NOT: Proteinin aşırı yüklenmesi bulaşmaya neden olabilir. - 30 dk için 85 V jel çalıştırın, sonra 2 saat için 150 V.
NOT: Farklı laboratuvarlar tarafından kullanılan ekipman ve hücre hatlarındaki farklılıklar göz önünde bulundurularak, bu protokolü optimize etmek için protein numunelerinin konsantrasyonu, voltaj ve çalışma süresinde küçük değişiklikler yapılabilir. Çalışma süresini artırırken ön çalıştırma ve çalışma gerilimini düşürmek dimer çözünürlüğünü ve sonuç tutarlılığını artırmaya yardımcı olabilir. - Jeli RT'de 30 dakika boyunca SDS çalışan tampon (25 m Tris pH 8.3, 250 mM Glisin, %0.1 SDS) ile ıslatın.
NOT: Ajitasyon gerekmez. Bazen, bandın yoğunluğu esas olarak IRF5 monomerik formunu etkileyen deoksikolat (DOC) varlığında verimsiz transferi nedeniyle yüklenen protein miktarı ile orantılı olmayabilir. Aktarımdan önce sds çalışan tampon jel ıslatma bu sorunu çözer. Jel kırılgan. Jelin alt kısmından (yani, daha yüksek yüzde) aşırı özenle işlayın.
4. IRF5 İmmünoblot Analizi
- Yaklaşık 5 dakika boyunca metanol içinde ıslatarak poliviniliden diflorür (PDVF) membran etkinleştirin.
- Yönünü belirtmek için membranın bir köşesinde bir kesim yapın. Transfer sandviçini, içinde hava kabarcıklarının sıkışmadığından emin olmak için üretici protokolünde belirtilen sıralı sıraya göre ekstra özenle monte edin.
- Transfer kasetini tanka yerleştirin ve 20 V'de 1 saat buzüzerinde aktarın.
NOT: Sallanan bir çalkalama ile sonraki adımlarda tüm kuluçka ve yıkıntıgerçekleştirin. - Aktarım tamamlandıktan sonra membranı plastik pratisyen lerle kasetten çıkarın. RT'de 45 dakika boyunca membranı bloke eden tampon (TBS) bloğunu kapatın.
NOT: %5 BSA içeren TBS arabelleği engelleme tamponu olarak da kullanılabilir. - Membranı Tablo 1'delistelenen primer antikorile inkübe edin. Membranı 1x TBST yıkama tamponu (20 mM Tris, pH 7.0, 150 mM NaCl ve %0.1 Ara 20) ile 3 dakika boyunca yıkayın. Yıkama 2x tekrarlayın.
| Dillüasyon | Dillüasyon arabelleği | Kuluçka | Yorum | |
| Primer antikor (Anti-IRF5) | 1/1,000 | TBS engelleme arabelleği | Rt'de 4 °C veya 2 saat gece | Seyreltilmiş antikorlar % 0.02 sodyum azit varlığında 4 °C'de depolanırsa birkaç kez tekrar kullanılabilir. |
| Sekonder antikor (Anti-tavşan) | 1/10,000 | TBS engelleme arabelleği | RT'de 45 dk | Seyreltilmiş antikorlar % 0.02 sodyum azit varlığında 4 °C'de depolanırsa birkaç kez tekrar kullanılabilir. |
| NOT: Üreticiler arasında değiştiği için seyreltmenin optimize edilmesi gerekir. | ||||
Tablo 1: İmmünoblotlama işleminde kullanılan antikorların özellikleri.
- Membranı Tablo 1'delistelenen ikincil antikorla kuluçkaya yatırın. Membranları 1x TBST yıkama tamponunda 3 dk yıkayın. Yıkama 2x tekrarlayın.
- Uygun bir jel dokümantasyon sistemi kullanarak lekeyi tazyik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anti-IRF5 antikorlu immünoblot (IB) CAL-1 hücrelerinde uyarılmamış veya 1 μg/mL R848 ile uyarılmamış olarak 2 saat(Şekil 1)uygulandı. Hücre lisatları hazırlandı ve ana SAYFA yapıldı. Uyarılmamış CAL-1 hücrelerinde, IRF5 yerel SAYFADA monomerik formuna karşılık gelen tek bir bant olarak algılandı. CAL-1 hücrelerinin R848 ile 2 saat tedavi edilmesi üzerine, IRF5 monomer seviyesi, IRF5'in dimerik formuna karşılık gelen yavaş göç eden bir bandın birikiminde eşzamanlı bir artışla azaldı.
Şekil 1: TLR7/8 agonist ile uyarıldığında CAL-1 hücrelerinde dimerized Endojen IRF5. CAL-1 hücreleri belirtilen süre boyunca R848 ile tedavi edilmedi veya tedavi edildi. Protein örnekleri yerli PAGE ile çözüldü ve ardından anti-IRF5 antikor kullanılarak IB alındı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Anti-IRF5 antikorlu immünoblot, Çeşitli yapılarla transfeced ve transfected 293T hücreleri üzerinde IRF5-overexpressing yapıldı. Hücre lisatları hazırlandı ve yerli PAGE yapıldı (Şekil 2). Transfektasyonsuz 293T hücrelerinde anti-IRF5 antikor özgüllüğünü gösteren IRF5 saptanmadı. Monomerik IRF5'e karşılık gelen tek bir bant sadece IRF5'i aşırı ifade eden 293T hücrelerinde tespit edildi. NRIG (constitutively active RIG-I), MAVS ve IKKβ gibi IRF5 aktive edici proteinleri kodlayan yapılar cotransfected olduğunda, IRF5'in dimerik formuna karşılık gelen yavaş bir göç bandı ortaya çıktı. Ancak RIG-I ile ilgili bir protein olan NMDA5 (institutively aktif MDA5), cotransfected olduğunda IRF5 dimerizasyonunu tetiklememiştir.
Şekil 2: IRF5 aktive edici faktörlerin 293T hücrelerinde IRF5 dimerizasyonuna neden olan kotransfeksiyonu. 293T hücreleri transfekslenmemiş (şerit 1) veya çeşitli IRF5 regülatörleri (şerit 3−6) ile birlikte IRF5 (şerit 2) ile transfected edildi. Protein örnekleri yerli PAGE ile çözüldü ve ardından anti-IRF5 antikor kullanılarak IB alındı. NRIG = RIG-I'nin N-terminali; NMDA5 = MDA5'in N-terminali. (Başlangıçta Journal of Immunologyyayınlandı . KT Chow, C Wilkins, M Narita, R Green, M Knoll, YM Loo ve M Gale Jr. 2018. Plazmasittoid Dendritik Hücrelerde IRF3 ve IRF5 tarafından düzenlenen Diferansiyel ve Örtüşen Bağışıklık Programları. J. İmmünl. 201 (10) 3036-3050. Telif Hakkı © 2018 Amerikan İmmünolojiciler Derneği,Inc. 23). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol, endojen IRF5'in hem monomerik hem de dimerik formlarını birbirinden ayıran değiştirilmiş bir yerel SAYFAdır. Özel görüntüleme akış sitometri tekniği23,27,28,30kullanarak endojen IRF5 aktivasyonu tespiti raporlama birkaç çalışma olmuştur. Bu protokol, aktivasyonun ilk olayları sırasında endojen IRF5 etkinleştirme durumunu değerlendirmek için yaygın bir teknik ve olağan reaktifler ve araçlar kullanır. Protokol, IRF5'in monomerik ve dimeric formları arasında ayrım sağlamak için standart bir yerel PAGE protokolünde basit değişiklikler gerektirir. Kolayca diğer hücre hatları23kullanarak çalışmalara adapte edilebilir. Bu değiştirilmiş yerel SAYFA protokolü endojen IRF5'i spesifik olmayan protein girişimleri olmaksızın iki şekilde net bir şekilde çözebilir(Şekil 2). Uyarılmamış hücrelerden endojen IRF5 bu jel sisteminde açık tek bant olarak saptanırken, R848 ile 2 saat tedavi, IRF5 dimers'a karşılık gelen bir bandın görünümüyle sonuçlandı (Şekil 1).
IRF3 için bir yerli SAYFA dimerization tsay, aynı ailede IRF5 benzer bir transkripsiyon faktörü, geliştirilmiş ve yaygın olarak son yirmi yıl içinde kullanılmıştır32. Kapsamlı test ve sorun giderme rağmen, Biz IRF5 monomer ve dimer çözmek için Laemmli Tris-glisin sistemi kullanan aynı protokolü uygulamak mümkün değildi. Bu makalede açıklanan protokol, IRF3 protokolünde kullanılan Tris-glisin tek yüzdeli jellerden çok farklı bir kimyaya sahip Olan Bis-Tris gradyan jelleri kullanır. Jel elektroforetik sistemlerinin farklı pH ve kimyasal bileşimi IRF3 ve IRF5'in çeşitli formlarını ayırt etmede çok önemli olabilir. Nitekim, IRF3 ve IRF5, benzer iken, farklı özelliklere sahip (örneğin, izoelektrik noktaları ve modifikasyon siteleri) muhtemelen farklı jel sistemlerinde ayrılırken farklı davranış ile sonuçlanan.
Jel çalıştırmak için DOC içeren 1x yerel PAGE çalışan arabellek kullanılmıştır. Tampon taze hazırlanmış veya temiz ve protein içermeyen bir ortamda beyaz çökelti görünümünü önlemek için üst haznede doc spesifik olmayan proteinler çökelti sonucu çözelti bulutlu olmalıdır. Çıkarılan endojen IRF5 örneklerinin en kısa sürede, tercihen en az donma-çözülme döngüsü ile bir hafta içinde yerel SAYFAya tabi tutulması son derece tavsiye edilir. Aksi takdirde, önemli protein bozulması olabilir. Bozulma hem -80 °C hem de -20 °C'de depolanır. Buna ek olarak, SDS çalışan tampon ve TBST yıkama tampon pH RT ayarlanmalıdır.
Her kuyuya yüklenen numunenin ideal son hacmi 10−15 μL'dir, ancak farklı hücre türlerine bağlı olarak hafif ayarlamalar gerekebilir. 30 dakika boyunca 85 V'de ilk çalıştırmadan sonra, IRF5 monomer ve dimer'in farklı ayrışması ve çözünürlüğü elde etmek için jeli yaklaşık 2-3 saat boyunca 150 V'de çalıştırmaya devam etmesi önerilir. Çalışma bittikten sonra, üstte %3'ten en alttaki %12'ye doğru artan diferansiyel yoğunluk seviyeleri nedeniyle jeli alt ucundan titizlikle işlemek son derece önemlidir. Bu durumda, sürtünmeyi en aza indirmek için bir darbe yastığı görevi görür ve jelkırılmasını önlemek için plaka uzak yüzen sağlar kullanılan çalışan tampon, daldırma tarafından plaka jel kaldırmak için tercih edilir.
Bu protokolün birkaç küçük dezavantajları istenilen sonuçları elde etmek için kullanılabilir jellerin sınırlı seçim içerir. Ev yapımı jeller ve ticari olarak mevcut jeller birkaç diğer markalar başarı olmadan test edilmiştir. Ellerimizde, ticari çalışan tampon ve jel sisteminin kullanımı bu protokolün sağlamlığına ve tekrarlanabilirliğine katkıda bulunmuştur, ancak ev yapımı tamponlar üzerinde kapsamlı testler yapılmamıştır. Detaylara dikkat esastır ve deneyim, net sonuçlar elde etmede başarının anahtarıdır. Son olarak, IRF5'in çözünürlüğü monomer ve dimer'in ideal bir ayrımını elde etmek için uzun bir süre (yani 2−3 saat) gerekti. Gelecekte daha fazla geliştirme ve değişiklik verimliliği artırabilir ve bu protokolün sakıncalarını en aza indirebilirsiniz.
Sonuç olarak, bu protokol endojen IRF5 monomer ve dimer tespiti için sağlam bir testtir. Endojen IRF5'i ifade eden çeşitli insan ve rürin hücre tiplerinde uygulamalar için uygundur. Çeşitli hücre tiplerinde IRF5 düzenleyici yolları ve sinyal bileşenlerini incelemek için değerli bir araç olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Çalışma Croucher Vakfı ve City Üniversitesi başlangıç fonları fon tarafından desteklendi. Chow laboratuvarının tüm üyelerine deney ve makalenin eleştirel okuması ile ilgili yardımları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies, HK | 21985023 | |
| 300 W/250 V power supply 230 V AC | Life Technologies, HK | PS0301 | |
| Anti-IRF5 antibody | Bethyl Laboratories, USA | A303-385 | |
| BIOSAN Rocker Shaker (cold room safe) | EcoLife, HK | MR-12 | |
| EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4x 100 mL | Life Technologies | 15575020 | |
| Glycerol 500 mL | Life Technologies | 15514011 | |
| Glycine | Life Technologies, HK | 15527013 | |
| Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 610-145-002-0.5 | |
| Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 611-145-002-0.5 | |
| Halt protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fisher Scientific, HK | 78430 | |
| HEPES | Life Technologies, HK | 15630080 | |
| LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Gene Company, HK | 927-50000 | |
| Mini Tank blot module combo; Transfer module, accessories | Life Technologies, HK | NW2000 | |
| NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit | Life Technologies, HK | BN1001BOX | |
| NativePAGE Running Buffer 20x | Life Technologies, HK | BN2001 | |
| NativePAGE Sample Buffer 4x | Life Technologies, HK | BN2003 | |
| NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol | Tin Hang/Calbiochem, HK | #492016-100ML | |
| PBS 7.4 | Life Technologies, HK | 10010023 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Bio-gene/Merck Millipore, HK | IPFL00010 | |
| Protein assay kit II (BSA) | Bio-Rad, HK | 5000002 | |
| R848 | Invivogen, HK | tlrl-r848 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies, HK | 61870127 | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | BP358-1 | |
| Sodium deoxycholate ≥97% (titration) | Tin Hang/Sigma, HK | D6750-100G | |
| Tris | Life Technologies, HK | 15504020 | |
| TWEEN 20 | Tin Hang/Sigma, HK | #P9416-100ML |
References
- Takaoka, A., et al. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Nature. 434 (7030), 243-249 (2005).
- Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. IKKbeta is an IRF5 kinase that instigates inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17438-17443 (2014).
- Negishi, H., Taniguchi, T., Yanai, H. The Interferon (IFN) Class of Cytokines and the IFN Regulatory Factor (IRF) Transcription Factor Family. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 10 (11), (2018).
- Clark, D. N., et al. Four Promoters of IRF5 Respond Distinctly to Stimuli and are Affected by Autoimmune-Risk Polymorphisms. Frontiers in Immunology. 4, 360 (2013).
- Bo, M., et al. Rheumatoid arthritis patient antibodies highly recognize IL-2 in the immune response pathway involving IRF5 and EBV antigens. Scientific Reports. 8 (1), 1789 (2018).
- Duffau, P., et al. Promotion of Inflammatory Arthritis by Interferon Regulatory Factor 5 in a Mouse Model. Arthritis and Rheumatolpgy. 67 (12), 3146-3157 (2015).
- Feng, D., et al. Irf5-deficient mice are protected from pristane-induced lupus via increased Th2 cytokines and altered IgG class switching. European Journal of Immunology. 42 (6), 1477-1487 (2012).
- Richez, C., et al. IFN regulatory factor 5 is required for disease development in the FcgammaRIIB-/-Yaa and FcgammaRIIB-/- mouse models of systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 184 (2), 796-806 (2010).
- Tada, Y., et al. Interferon regulatory factor 5 is critical for the development of lupus in MRL/lpr mice. Arthritis and Rheumatology. 63 (3), 738-748 (2011).
- Weiss, M., et al. IRF5 controls both acute and chronic inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 11001-11006 (2015).
- Schoenemeyer, A., et al. The interferon regulatory factor, IRF5, is a central mediator of toll-like receptor 7 signaling. Journal of Biological Chemistry. 280 (17), 17005-17012 (2005).
- Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. Functional regulation of MyD88-activated interferon regulatory factor 5 by K63-linked polyubiquitination. Molecular and Cellular Biology. 28 (24), 7296-7308 (2008).
- Lopez-Pelaez, M., et al. Protein kinase IKKβ-catalyzed phosphorylation of IRF5 at Ser462 induces its dimerization and nuclear translocation in myeloid cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17432-17437 (2014).
- McGettrick, A. F., O'Neill, L. A. Localisation and trafficking of Toll-like receptors: an important mode of regulation. Current Opinion Immunology. 22 (1), 20-27 (2010).
- Baccala, R., Hoebe, K., Kono, D. H., Beutler, B., Theofilopoulos, A. N. TLR-dependent and TLR-independent pathways of type I interferon induction in systemic autoimmunity. Nature Medicine. 13 (5), 543-551 (2007).
- Gilliet, M., Cao, W., Liu, Y. J. Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleic acids in viral infection and autoimmune diseases. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 594-606 (2008).
- Kawai, T., Akira, S. Toll-like Receptors and Their Crosstalk with Other Innate Receptors in Infection and Immunity. Immunity. 34 (5), 637-650 (2011).
- Liu, Z., Davidson, A. Taming lupus-a new understanding of pathogenesis is leading to clinical advances. Nature Medicine. 18 (6), 871-882 (2012).
- del Fresno, C., et al. Interferon-beta production via Dectin-1-Syk-IRF5 signaling in dendritic cells is crucial for immunity to C. albicans. Immunity. 38 (6), 1176-1186 (2013).
- Wang, X., et al. Expression Levels of Interferon Regulatory Factor 5 (IRF5) and Related Inflammatory Cytokines Associated with Severity, Prognosis, and Causative Pathogen in Patients with Community-Acquired Pneumonia. Medical Science Monitor. 24, 3620-3630 (2018).
- Zhao, Y., et al. Microbial recognition by GEF-H1 controls IKKepsilon mediated activation of IRF5. Nature Communications. 10 (1), 1349 (2019).
- Almuttaqi, H., Udalova, I. A. Advances and challenges in targeting IRF5, a key regulator of inflammation. FEBS Journal. 286 (9), 1624-1637 (2019).
- Chow, K. T., et al. Differential and Overlapping Immune Programs Regulated by IRF3 and IRF5 in Plasmacytoid Dendritic Cells. The Journal of Immunology. 201 (10), 3036-3050 (2018).
- Cheng, T. F., et al. Differential Activation of IFN Regulatory Factor (IRF)-3 and IRF-5 Transcription Factors during Viral Infection. The Journal of Immunology. 176 (12), 7462-7470 (2006).
- Chang Foreman, H. C., Van Scoy, S., Cheng, T. F., Reich, N. C. Activation of interferon regulatory factor 5 by site specific phosphorylation. PLoS One. 7 (3), 33098 (2012).
- Lin, R., Yang, L., Arguello, M., Penafuerte, C., Hiscott, J. A CRM1-dependent nuclear export pathway is involved in the regulation of IRF-5 subcellular localization. Journal of Biological Chemistry. 280 (4), 3088-3095 (2005).
- Stone, R. C., et al. Interferon regulatory factor 5 activation in monocytes of systemic lupus erythematosus patients is triggered by circulating autoantigens independent of type I interferons. Arthritis and Rheumatology. 64 (3), 788-798 (2012).
- De, S., et al. B Cell-Intrinsic Role for IRF5 in TLR9/BCR-Induced Human B Cell Activation, Proliferation, and Plasmablast Differentiation. Frontiers in Immunology. 8, 1938 (2017).
- Fabie, A., et al. IRF-5 Promotes Cell Death in CD4 T Cells during Chronic Infection. Cell Reports. 24 (5), 1163-1175 (2018).
- Cushing, L., et al. IRAK4 kinase activity controls Toll-like receptor-induced inflammation through the transcription factor IRF5 in primary human monocytes. Journal of Biological Chemistry. 292 (45), 18689-18698 (2017).
- Li, C., Arakawa, T. Application of native polyacrylamide gel electrophoresis for protein analysis: Bovine serum albumin as a model protein. International Journal of Biological Macromolecules. 125, 566-571 (2019).
- Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
- Subhadarshanee, B., Mohanty, A., Jagdev, M. K., Vasudevan, D., Behera, R. K. Surface charge dependent separation of modified and hybrid ferritin in native PAGE: Impact of lysine 104. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1865 (10), 1267-1273 (2017).
- Reynolds, J. A., Tanford, C. Binding of Dodecyl Sulfate to Proteins at High Binding Ratios - Possible Implications for State of Proteins in Biological Membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (3), 1002 (1970).
- Manning, M., Colon, W. Structural basis of protein kinetic stability: resistance to sodium dodecyl sulfate suggests a central role for rigidity and a bias toward beta-sheet structure. Biochemistry. 43 (35), 11248-11254 (2004).
- Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. IKKalpha negatively regulates IRF-5 function in a MyD88-TRAF6 pathway. Cellular Signalling. 22 (1), 117-127 (2010).
- Paun, A., et al. Functional characterization of murine interferon regulatory factor 5 (IRF-5) and its role in the innate antiviral response. Journal of Biological Chemistry. 283 (21), 14295-14308 (2008).
- Yasuda, K., et al. Murine dendritic cell type I IFN production induced by human IgG-RNA immune complexes is IFN regulatory factor (IRF)5 and IRF7 dependent and is required for IL-6 production. The Journal of Immunology. 178 (11), 6876-6885 (2007).
- Steinhagen, F., et al. IRF-5 and NF-kappaB p50 co-regulate IFN-beta and IL-6 expression in TLR9-stimulated human plasmacytoid dendritic cells. European Journal of Immunology. 43 (7), 1896-1906 (2013).
- Gratz, N., et al. Type I interferon production induced by Streptococcus pyogenes-derived nucleic acids is required for host protection. PLoS Pathogens. 7 (5), 1001345 (2011).
