Summary

Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis Immunoblot Analyse de la dimérisation Endogenous IRF5

Published: October 06, 2019
doi:

Summary

Une méthode occidentale indigène de tache pour analyser le facteur réglementaire endogène d’interféron 5 dimerization dans la ligne de cellules dendritiques plasmacytoid de CAL-1 est décrite. Ce protocole peut également être appliqué à d’autres lignées cellulaires.

Abstract

Le facteur de régulation de l’interféron 5 (IRF5) est un facteur de transcription clé pour réguler la réponse immunitaire. Il est activé en aval de la voie de signalisation de la différence myéloïde de récepteur de péage 88 (TLR-MyD88). L’activation d’IRF5 implique la phosphorylation, la dimerisation, et la translocation suivante du cytoplasme dans le noyau, qui à son tour induit l’expression de gène de diverses cytokines pro-inflammatoires. Un test de détection pour l’activation iRF5 est essentiel à l’étude des fonctions IRF5 et de ses voies pertinentes. Cet article décrit un analyse robuste pour détecter l’activation endogène d’IRF5 dans la ligne humaine de cellules dendritiques deplasmacytoid de CAL-1. Le protocole consiste en un analyse d’électrophorèse non dénaturante modifiée qui permet de distinguer IRF5 dans ses formes monomères et dimères, offrant ainsi une approche abordable et sensible pour analyser l’activation de l’IRF5.

Introduction

Le facteur de régulation de l’interféron 5 (IRF5) est un important régulateur de transcription qui joue un rôle de premier plan dans la régulation de la réponse immunitaire, en particulier dans la libération de cytokines pro-inflammatoires et d’interférons de type I (IFN)1,2 ,3. La mauvaise régulation de l’IRF5 est un facteur contribuant à de nombreuses maladies auto-immunes, comme en témoignent les divers polymorphismes dans le locus IRF5 qui sont associés au lupus érythémateux systémique, à la sclérose en plaques, à la polyarthrite rhumatoïde, etc.4, 5,6,7,8,9,10. Par conséquent, un essai de détection robuste pour l’état d’activation endogène iRF5 est crucial pour comprendre les voies réglementaires et les effets en aval de l’IRF5 dans un contexte cellulaire physiologiquement pertinent.

IRF5 est constitutivement exprimé dans les monocytes, les cellules dendritiques (DC), les cellules B, et les macrophages1,11. Comme avec d’autres facteurs de transcription de famille d’IRF, IRF5 réside dans le cytoplasme dans son état latent. Lors de l’activation, IRF5 est phosphorylé et forme des homodimères, qui se translocalisent ensuite dans le noyau et se lient à des éléments réglementaires spécifiques des gènes codant les IFN de type I et les cytokines pro-inflammatoires, induisant éventuellement l’expression de ces gènes1 ,2,11,12,13. IRF5 régule les réponses immunitaires innées en aval de divers récepteurs de type Toll (TLR), tels que TLR7, TLR 8, et TLR 9, qui sont localisés en endosomes et utilisent MyD88 pour signaler1,11,14. Ces TLR reconnaissent principalement les espèces étrangères d’acide nucléique telles que l’ARN à brin unique (arDR) et l’ADN CPG non méthylé qui sont symptomatiques d’une infection15,16,17,18. IRF5 a été montré pour réguler les réponses immunitaires contre les infections bactériennes, virales et fongiques19,20,21. Compte tenu du rôle influent et diversifié de l’IRF5 dans le système immunitaire, l’amélioration ou l’amortissement de l’activité IRF5 pourrait servir de nouvelle voie pour le développement d’agents thérapeutiques22. Par conséquent, il est essentiel de développer un protocole pour surveiller l’état d’activation de l’IRF5 endogène pour permettre une étude approfondie des voies et des mécanismes régulant l’activité IRF5 dans différents types de cellules.

Au meilleur de notre connaissance, aucun analyse biochimique ou électrophoretic de gel pour l’activation endogène d’IRF5 n’a été édité avant le développement de ce protocole. La phosphorylation s’est avérée être une première étape importante de l’activation de l’IRF5, et un anticorps IRF5 phosphospecific a été développé qui a mené à la découverte et à la confirmation d’un résidu de sérine important pour l’activitéIRF5 13. Cependant, alors que l’anticorps détecte clairement iRF5 phosphorylé lorsqu’il est immunoprécipité ou surexprimé23, il ne détecte pas la phosphorylation IRF5 dans une cellule entière lysate dans nos mains (données non montrées). La dimérisation est la prochaine étape de l’activation de l’IRF5, et de nombreuses études importantes à ce jour sur lesquelles on s’est appuyée sur la surexpression de l’IRF5 étiqueté eilluant épitope, souvent dans des types de cellules non pertinentes qui n’expriment normalement pas IRF511,12 ,24,25. Des études antérieures ont montré que l’IRF5 dimérisé ne peut pas toujours se translocaliser dans le noyau et n’est donc pas nécessairement pleinement activé25,26. Un essai pour la localisation nucléaire endogène D’IRF5 a été développé pour évaluer l’activation d’IRF5 par la cytométrie de flux d’imagerie27. Cet essai a été appliqué dans des études qui ont été cruciales pour comprendre l’activité IRF5, en particulier dans les types de cellules primaires ou rares28,29 et a grandement avancé les connaissances dans le domaine. Cependant, cet exemple repose sur un instrument spécialisé qui n’est pas largement disponible pour les chercheurs. En outre, il est souvent nécessaire d’étudier les premières étapes de l’activation tout en disséquant les voies réglementaires IRF5 et en identifiant les régulateurs en amont et les composantes de la voie. Cette étude fournit un analyse biochimique robuste et fiable pour les événements d’activation précoce de l’IRF5 qui peut être effectuée dans des laboratoires équipés d’outils de biologie moléculaire. Le protocole décrit ici sera très utile dans l’étude des voies et des mécanismes des actions IRF5, en particulier lorsqu’il est combiné avec des essais orthogonaux tels que l’analyse cytométrique flux d’imagerie de la localisation nucléaire IRF523, 27,28,30.

L’électrophoresis de gel de polyacrylamide indigène (PAGE indigène) est une méthode largement utilisée pour analyser des complexes de protéine31,32. Contrairement à l’électrophorèse de gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE), PAGE indigène sépare les protéines en fonction de leur forme, de leur taille et de leur charge. Il conserve également la structure indigène de protéine sans dénaturation31,33,34,35. Le protocole présenté tire parti de ces caractéristiques de page native et détecte les formes monomériques et dimériques de l’IRF5. Cette méthode est particulièrement importante pour détecter les événements d’activation précoce parce qu’il n’existe aucun anticorps disponible dans le commerce qui puisse détecter l’IRF5 phosphorylé endogène. Auparavant, plusieurs études publiées utilisaient page native pour évaluer la dimerisation IRF5. Cependant, la majorité de ces études dépendaient de la surexpression de l’IRF5 exogène étiqueté eépitore pour analyser le statut d’activation2,13,24,36,37 . Ce travail présente un protocole étape par étape pour l’analyse de la dimérisation iRF5 endogène via une technique PAGE indigène modifiée dans une lignée de cellules dendritiques plasmacytoïdes humaines (pDC), où l’activité IRF5 s’est avérée cruciale pour sa fonction1, 38,39,40. Cette même technique a été appliquée à d’autres lignéescellulaires 23.

Protocol

REMARQUE: Le protocole décrit ici utilise la lignée cellulaire CAL-1 pDC traitée avec resiquimod (R848), un agoniste pour TLR7/8. Ce protocole a été appliqué à d’autres types de cellules humaines et murine, y compris RAW 264.7 (ligne de macrophage murine), THP-1 (ligne cellulaire monocytique humaine), BJAB (ligne humaine de cellules B), Ramos (ligne humaine de cellules B), et MUTZ-3 (ligne de cellules dendritiques humaines)23. 1. Stimulation des ce…

Representative Results

L’immunoblot (IB) avec un anticorps anti-IRF5 a été réalisé sur des cellules CAL-1 non stimulées ou stimulées avec 1 g/mL R848 pour 2 h (Figure 1). Des lysates de cellules ont été préparés, et le PAGE indigène a été exécuté. Dans les cellules CAL-1 non stimulées, IRF5 a été détecté comme une seule bande sur la PAGE native, correspondant à sa forme monomérique. Sur le traitement des cellules CAL-1 avec R848 pendant 2 h, le niveau de monomère d’IRF5 a diminué avec une a…

Discussion

Le protocole décrit ici est un PAGE indigène modifié qui distingue les formes monomeric et dimériques de l’IRF5 endogène. Il y a eu peu d’études rapportant la détection de l’activation endogène d’IRF5 utilisant la technique spécialisée de cytométrie de flux d’imagerie23,27,28,30. Ce protocole utilise une technique commune et des réactifs et des outils communs pour évaluer l’état d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les travaux ont été soutenus par des fonds de la Fondation Croucher et des fonds de démarrage de l’Université de la Ville. Nous remercions tous les membres du laboratoire Chow pour leur aide dans l’expérience et la lecture critique du manuscrit.

Materials

2-Mercaptoethanol Life Technologies, HK 21985023
300 W/250 V power supply 230 V AC Life Technologies, HK PS0301
Anti-IRF5 antibody Bethyl Laboratories, USA A303-385
BIOSAN Rocker Shaker (cold room safe) EcoLife, HK MR-12
EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4 X 100 mL Life Technologies 15575020
Glycerol 500 mL Life Technologies 15514011
Glycine Life Technologies, HK 15527013
Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody LAB-A-PORTER/Rockland, HK 610-145-002-0.5
Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody LAB-A-PORTER/Rockland, HK 611-145-002-0.5
Halt protease inhibitor cocktail (100x) Thermo Fisher Scientific, HK 78430
HEPES Life Technologies, HK 15630080
LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) Gene Company, HK 927-50000
Mini Tank blot module combo; Transfer module, accessories Life Technologies, HK NW2000
NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit Life Technologies, HK BN1001BOX
NativePAGE Running Buffer 20x Life Technologies, HK BN2001
NativePAGE Sample Buffer 4x Life Technologies, HK BN2003
NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol Tin Hang/Calbiochem, HK #492016-100ML
PBS 7.4 Life Technologies, HK 10010023
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Bio-gene/Merck Millipore, HK IPFL00010
Protein assay kit II (BSA) Bio-Rad, HK 5000002
R848 Invivogen, HK tlrl-r848
RPMI 1640 Life Technologies, HK 61870127
Sodium Chloride ThermoFisher BP358-1
Sodium deoxycholate ≥97% (titration) Tin Hang/Sigma, HK D6750-100G
Tris Life Technologies, HK 15504020
TWEEN 20 Tin Hang/Sigma, HK #P9416-100ML

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Cite This Article
Wang, M., Hoo Lim, K., Chow, K. T. Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis Immunoblot Analysis of Endogenous IRF5 Dimerization. J. Vis. Exp. (152), e60393, doi:10.3791/60393 (2019).

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