Summary
Viene descritto un metodo nativo western blot per l'analisi del fattore regolatore dell'interferone endogeno 5 nella linea cellulare dendritica plasmacitoide CAL-1. Questo protocollo può essere applicato anche ad altre linee cellulari.
Abstract
Il fattore regolatore dell'interferone 5 (IRF5) è un fattore chiave di trascrizione per la regolazione della risposta immunitaria. Viene attivato a valle del percorso di segnalazione del gene di segnalazione del gene di segnalazione 88 (TLR-MyD88) del recettore toll-like mieloide. L'attivazione dell'IRF5 comporta fosfororylazione, dimerizzazione e successiva traslocazione dal citoplasma al nucleo, che a sua volta induce l'espressione genica di varie citochine pro-infiammatorie. Un risultato di rilevamento per l'attivazione IRF5 è essenziale per studiare le funzioni IRF5 e i relativi percorsi. Questo articolo descrive un robusto analisi per rilevare l'attivazione endogena IRF5 nella linea di cellule dendriche (pDC) plasmacitoide umane CAL-1. Il protocollo consiste in un saggio di elettroforesi non denatura modificato in grado di distinguere IRF5 nelle sue forme monomeriche e dimeiche, fornendo così un approccio conveniente e sensibile per analizzare l'attivazione IRF5.
Introduction
Il fattore regolatore dell'interferone 5 (IRF5) è un importante regolatore di trascrizione che svolge un ruolo di primo piano nella regolazione della risposta immunitaria, in particolare nel rilascio di citochine pro-infiammatorie e interferissi di tipo Ioni (IFN)1,2 ,3. La miscisazione della IRF5 è un fattore che contribuisce a numerose malattie autoimmuni, come evidente da vari polimorfismi nel locus IRF5 che sono associati con lupus erithematosos sistemico, sclerosi multipla, artrite reumatoide,ecc. 4, 5,6,7,8,9,10. Pertanto, un robusto test di rilevamento per lo stato di attivazione Endogeno IRF5 è fondamentale per comprendere i percorsi normativi e gli effetti a valle dell'IRF5 in un contesto cellulare fisiologicamente rilevante.
IRF5 è esclusivamente espresso in monociti, cellule dendritiche (DC), cellule B e macrofagi1,11. Come per altri fattori di trascrizione familiare IRF, l'IRF5 risiede nel citoplasma nel suo stato latente. Al momento dell'attivazione, IRF5 viene fosfolato e forma omodimeri, che poi si traslocano nel nucleo e si legano a specifici elementi regolatori di geni che codificano gli IFN di tipo I e le citochine pro-infiammatorie, inducendo infine l'espressione di questi geni1 ,2,11,12,13. IRF5 regola le risposte immunitarie innate a valle di vari recettori simili a pedoni (TLR), come TLR7, TLR 8 e TLR 9, che sono localizzati in endosomi e utilizzano MyD88 per la segnalazione1,11,14. Questi TLR riconoscono principalmente specie di acido nucleico estraneo come l'RNA a filamento (ssRNA) e il DNA CpG non metilato che sono sintomatici di un'infezione15,16,17,18. IRF5 ha dimostrato di regolare le risposte immunitarie contro le infezioni batteriche, virali e fungine19,20,21. Considerando il ruolo influente e diversificato della IRF5 nel sistema immunitario, migliorare o smorzare l'attività dell'IRF5 potrebbe servire come nuova strada per lo sviluppo di agenti terapeutici22. Pertanto, è fondamentale sviluppare un protocollo per monitorare lo stato di attivazione dell'IRF5 endogeno per consentire un'indagine approfondita dei percorsi e dei meccanismi che regolano l'attività IRF5 in diversi tipi di cellule.
Per quanto ne sappiamo, non è stato pubblicato alcun saggio biochimico o gel elettroforetico per l'attivazione endogena iRF5 prima dello sviluppo di questo protocollo. Il phosphorylation è stato dimostrato come un primo passo importante dell'attivazione IRF5, ed è stato sviluppato un anticorpo IRF5 fosforo specifico che ha portato alla scoperta e alla conferma di un residuo di serino importante per l'attività IRF513. Tuttavia, mentre l'anticorpo rileva chiaramente l'IRF5 fosforelare quando è immunoprecipitato o sovraespresso23, non riesce a rilevare la fosforilazione IRF5 in un'intera lisata cellulare nelle nostre mani (dati non mostrati). La dimerizzazione è il prossimo passo dell'attivazione IRF5, e molti studi importanti fino ad oggi studiando questo passo si basavano sulla sovraespressione dell'IRF5 con tag epitopi, spesso in tipi di cellule irrilevanti che normalmente non esprimono IRF511,12 ,24,25. Studi precedenti hanno dimostrato che l'IRF5 dimerizzato non sempre può traslocare nel nucleo e quindi non è necessariamente completamente attivato25,26. È stato sviluppato un saggio per la localizzazione nucleare IRFa Endogena per valutare l'attivazione di IRF5 mediante citometria del flusso di imaging27. Questo saggio è stato applicato in studi che sono stati cruciali per comprendere l'attività IRF5, soprattutto nei tipi di cellule primarie o rare28,29 e notevolmente avanzato la conoscenza nel campo. Tuttavia, questo saggio si basa su uno strumento specializzato che non è ampiamente disponibile per i ricercatori. Inoltre, è spesso necessario studiare le fasi iniziali dell'attivazione, sezionando i percorsi normativi IRF5 e identificando i regolatori a monte e i componenti del percorso. Questo studio fornisce un saggio biochimico robusto e affidabile per i primi eventi di attivazione dell'IRF5 che può essere eseguito in laboratori dotati di strumenti di biologia molecolare. Il protocollo qui descritto sarà molto utile per studiare i percorsi e i meccanismi delle azioni IRF5, soprattutto se combinato con saggi ortogonali come l'analisi citometrica del flusso di immagini della localizzazione nucleare IRF523, 27,28,30.
L'elettroforesi nativa del gel di poliacrilammide (nativa PAGE) è un metodo ampiamente utilizzato per analizzare i complessi proteici31,32. A differenza dell'elettroforesi gel in gel di sodio dodecylsulfate (SDS-PAGE), PAGE nativo separa le proteine in base alla loro forma, dimensione e carica. Mantiene anche la struttura originaria delle proteine senza denaturazione31,33,34,35. Il protocollo presentato sfrutta queste caratteristiche della PAGE nativa e rileva sia forme monomeriche che dimericiche di IRF5. Questo metodo è particolarmente importante per rilevare gli eventi di attivazione precoce perché non esiste un anticorpo disponibile in commercio adatto in grado di rilevare l'IRF5 fosforogeno endogeno. In precedenza, diversi studi pubblicati hanno usato PAGE nativo per valutare la dimerizzazione IRF5. Tuttavia, la maggior parte di questi studi dipendeva dalla sovraespressione dell'IRF5 con tag epitope esogeni per analizzare lo stato di attivazione2,13,24,36,37 . Questo lavoro presenta un protocollo passo-passo per l'analisi della dimerizzazione iRFosa endogena tramite una tecnica PAGE nativa modificata in una linea di cellule dendritiche plasmacitoidi umane (pDC), dove l'attività IRF5 ha dimostrato di essere cruciale per la sua funzione1, 38,39,40. Questa stessa tecnica è stata applicata ad altre linee cellulari23.
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Protocol
NOT: Il protocollo qui descritto utilizza la linea cellulare CAL-1 pDC trattata con resiquimod (R848), un agonista per TLR7/8. Questo protocollo è stato applicato ad altri tipi di cellule umane e murine, tra cui RAW 264.7 (linea di macrofagio murina), THP-1 (linea cellulare monocitica umana), BJAB (linea di cellule B umana), Ramos (linea di cellule B umane) e MUT-3 (linea di cellule dendritiche umane)23.
1. Stimolazione delle cellule CAL-1
- Mantenere le colture cellulari CAL-1 in un flacone T75 a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2 in condizioni sterili con un mezzo di 20-25 mL di RPMI 1640 contenente il siero bovino fetale 5% (FBS), 25 mHE HEPES e 11 mercaptoetanolo (cioè, RPMI 1640 medio).
- Trasferire le cellule in un tubo conico da 50 mL.
NOT: Le cellule CAL-1 non sono aderenti. Per i tipi di cellule aderenti, la prova standard può essere eseguita per raccogliere le cellule. - Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente (RT). Rimuovere supernatante e risospendere il pellet cellulare in 8 mL del mezzo RPMI 1640 completo per ottenere una sospensione omogenea a cella singola.
- Contare le cellule usando un emocitometro. Semina le cellule ad una densità di 1 x 106 cellule per pozzo in una piastra 6 pozzetti con 4 mL di preriscaldato RPMI 1640 medio in ogni pozzo. Incubare per 20,24 h a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2 per consentire alla confluenza di raggiungere il 90%-95% (corrispondente a circa 1,5 x 106 cellule).
- Stimolare le cellule aggiungendo 4 luna di 1 mg/mL R848 per pozzo della piastra 6 (concentrazione finale di 1 g/mL). Impostare anche un controllo non stimolato bene con le cellule senza il trattamento R848.
- Assicurarsi che l'R848 sia disperso uniformemente dondolando delicatamente la piastra da un lato all'altro. Quindi, incubare le cellule per 2-16 h nell'incubatrice a 37 e 5% DI CO2.
2. Estrazione di proteine cellulari
- Trasferire le sospensioni cellulari dalla piastra 6 del pozzo in tubi di centrifuga 5 mL.
- Centrifuga a 200 x g per 5 min a RT. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di salina con buffer fosfato (PBS) per ottenere una sospensione omogenea a cella singola.
- Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga di 1,5 mL.
- Girare brevemente verso il basso a 12.000 x g per 0,5,5 min a 4 gradi centigradi e rimuovere con cura il sovrillante.
- Preparare il buffer di lisi contenente 6,25 mL di 1 M Tris-HCl pH 7.4 (concentrazione finale di 25 mM), 7,5 mL di 5 M NaCl (concentrazione finale di 150 mM), 0,5 mL di 0,5 M EDTA (concentrazione finale di 1 mM), 2,5 mL di NP-40 (concentrazione finale di 1%) e 7,5 mL di glicerolo (concentrazione finale del 5%) in 250 mL di acqua deionizzata (ddH2O). Aggiungere 100x proteasi inibitore monouso cocktail ad una concentrazione finale di 1x al buffer di lisi poco prima dell'uso. Tenere il buffer di lisi preparato sul ghiaccio.
NOT: Il buffer di lisi senza proteasi può essere conservato a 4 gradi centigradi. - Risospendere il pellet cellulare a 30 gradi di lisi ghiacciata e mescolare con il pipeting su e giù.
- Incuba sul ghiaccio per 15-20 min.
- Chiarire il lisato centrifugando a 12.000 x g per 15-20 min a 4 gradi centigradi. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga prechilled da 1,5 mL. Tenere gli estratti sul ghiaccio in ogni momento.
NOT: I listinelladi cellulari possono essere immagazzinati a -20 o -80 gradi centigradi. Non far bollire i campioni. - Misurare la concentrazione di proteine utilizzando il reagente Bradford.
3. Analisi della dimerizzazione IRF5 da parte di Native PAGE
- Preparare i buffer di elettroforesi della camera superiore (-) e inferiore. Il buffer della camera superiore è costituito da 0,3% deossicolato di sodio (NaDOC) in 1x buffer in esecuzione PAGE nativo, e la camera inferiore è costituito solo da 1x nativo PAGE buffer in esecuzione.
NOT: Preparare un nuovo buffer camera superiore per ogni nuova corsa. - Sciacquare accuratamente un gel PAGE nativo del 3%-12% con acqua senza distorcere i pozzi. Mettere il gel nel serbatoio mini gel e rimuovere il pettine. Prerun il gel in una stanza fredda di 4 gradi centigradi o sul ghiaccio a 150 V per 30 min.
NOT: La pre-esecuzione rimuove l'eccessiva ammoniaca e gli ioni persofato che possono interferire con il funzionamento del gel. - Durante la preesecuzione, preparare i campioni per il caricamento mescolando le proteine cellulari tenute sul ghiaccio con buffer di campione nativo 4x.
- Dopo la preesecuzione, caricate 10-15 g di proteine con un volume finale di 10-15 l per campione.
NOT: Il sovraccarico di proteine può causare smearing. - Eseguire gel a 85 V per 30 min, quindi 150 V per 2 h.
NOT: Considerando le differenze nelle attrezzature e nelle linee cellulari utilizzate da diversi laboratori, piccole modifiche alla concentrazione di campioni di proteine, tensione e tempo di funzionamento possono essere appropriate per ottimizzare questo protocollo. Abbassare la tensione pre-esecuzione e in esecuzione aumentando il tempo di funzionamento può contribuire a migliorare la risoluzione dei dimeri e la coerenza dei risultati. - Immergere il gel nel buffer di esecuzione SDS (25 mM Tris pH 8.3, 250 mM Glycine, 0.1% SDS) per 30 min a RT.
NOT: Non è richiesta alcuna agitazione. Occasionalmente, l'intensità della banda potrebbe non essere proporzionale alla quantità di proteine caricate a causa di un trasferimento inefficiente in presenza di deossicolato (DOC), che colpisce principalmente la forma monomerica di IRF5. Ammollo il gel in SDS tampone in esecuzione prima del trasferimento risolve questo problema. Il gel è fragile. Manico con estrema cura dal basso (cioè una percentuale più alta) dell'estremità del gel.
4. Analisi Immunoblot di IRF5
- Attivare la membrana di flufluoruro di polivinylidene (PDVF) immergendola nel metanolo per circa 5 min.
- Fare un taglio su un angolo della membrana per indicare il suo orientamento. Assemblare il panino di trasferimento in base all'ordine sequenziale dettagliato nel protocollo del produttore con particolare attenzione per garantire che all'interno non siano intrappolate bolle d'aria.
- Collocare la cassetta di trasferimento nel serbatoio e trasferirla a 20 V per 1 h sul ghiaccio.
NOT: Eseguire tutte le incubazioni e lava nei passaggi successivi con uno shaker a dondolo. - Rimuovere la membrana dalla cassetta con pinze di plastica dopo il trasferimento è completato. Bloccare la membrana nel buffer di blocco (TBS) per 45 min a RT.
NOT: Buffer TBS con 5% BSA può essere utilizzato anche come buffer di blocco. - Incubare la membrana con l'anticorpo primario elencato nella Tabella 1. Lavare la membrana con 1x TBST buffer di lavaggio (20 mM Tris, pH 7.0, 150 mM NaCl e 0.1% Tween 20) per 3 min mentre dondola. Ripetere il lavaggio 2x.
| Dillutazione | Buffer di diluvio | Incubazione | Commenti | |
| Anticorpi primari (Anti-IRF5) | 1/1,000 | Buffer di blocco TBS | Pernottamento a 4 o 2 h a RT | Gli anticorpi diluiti possono essere riutilizzati più volte se conservati a 4 gradi centigradi in presenza di azie di sodio dello 0,02%. |
| Anticorpi secondari (Anti-rabbit) | 1/10,000 | Buffer di blocco TBS | 45 min presso RT | Gli anticorpi diluiti possono essere riutilizzati più volte se conservati a 4 gradi centigradi in presenza di azie di sodio dello 0,02%. |
| NOT: La diluizione deve essere ottimizzata in quanto varia da costruttore a altro. | ||||
Tabella 1: Specifiche degli anticorpi utilizzati nella procedura di immunoblotting.
- Incubare la membrana con l'anticorpo secondario elencato nella Tabella 1. Lavare le membrane per 3 min in 1x TBST buffer di lavaggio. Ripetere il lavaggio 2x.
- Eseguire la scansione della macchia utilizzando un sistema di documentazione gel appropriato.
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Representative Results
L'immunoblot (IB) con anticorpo anti-IRF5 è stato eseguito su cellule CAL-1 non stimolate o stimolate con 1 g/mL R848 per 2 h (Figura 1). Sono stati preparati glisati cellulari e la PAGE nativa è stata eseguita. Nelle cellule CAL-1 non stimolate, IRF5 è stato rilevato come una singola banda nella PAGE nativa, corrispondente alla sua forma monomerica. Dopo il trattamento delle cellule CAL-1 con R848 per 2 h, il livello di monomero IRF5 è diminuito con un aumento simultaneo dell'accumulo di una banda che migra lentamente che corrispondeva alla forma dimeric di IRF5.
Figura 1: Endogeno IRF5 sierograizzato nelle cellule CAL-1 quando stimolato con l'agonista TLR7/8. Le cellule CAL-1 non sono state trattate o trattate con R848 per il tempo indicato. I campioni di proteine sono stati risolti dalla PAGE nativa e seguiti da IB utilizzando l'anticorpo anti-IRF5. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
L'immunoblot con anticorpo anti-IRF5 è stato eseguito su cellule IRF5 sovraesprimenti 293T non transinfettate e trascate con vari costrutti. Sono stati preparati lysati cellulari ed è stata eseguita la PAGE nativa (Figura 2). Non è stato rilevato alcun IRF5 nelle cellule 293T non trascurate, dimostrando la specificità dell'anticorpo anti-IRF5. Una singola banda corrispondente all'IRF5 monomerico è stata rilevata solo nelle cellule 293T sovraesprimenti IRF5. Durante la codifica delle proteine che attivano IRF5, tra cui NRIG (RIG-I, attivato in modo stitua, sono stati cotransigrati, è apparsa una banda che migra lentamente corrispondente alla forma dimeric di IRF5. Tuttavia, NMDA5 (stitutively active MDA5), una proteina correlata a RIG-I, non ha indotto la dimerizzazione IRF5 quando cotransiziona.
Figura 2: La cotrafezione dei fattori di attivazione IRF5 ha indotto la dimerizzazione IRF5 nelle cellule 293T. Le 293T cellule sono state non transinfettate (corsia 1) o trascate con IRF5 (corsia 2) insieme a vari regolatori IRF5 (lane s. 3-6). I campioni di proteine sono stati risolti dalla PAGE nativa e seguiti da IB utilizzando l'anticorpo anti-IRF5. NRIG - N-terminale di RIG-I; NMDA5 - N-terminale di MDA5. (Originariamente pubblicato su The Journal of Immunology. KT Chow, C Wilkins, M Narita, R Green, M Knoll, YM Loo e M Gale Jr. 2018. Programmi immunitari differenziali e sovrapposti regolati da IRF3 e IRF5 nelle cellule dendritiche plasmacitoidi. J. Immunol. 201 (10) 3036-3050. Copyright © 2018 L'American Association ofImmunologists, Inc. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo qui descritto è una PAGE nativa modificata che distingue sia le forme monomeriche che dimericiche di IRF5 endogeno. Ci sono stati pochi studi che riportano il rilevamento dell'attivazione endogena IRF5 utilizzando la tecnica specializzata della citometria del flusso di immagini23,27,28,30. Questo protocollo utilizza una tecnica comune e reagenti e strumenti comuni per valutare lo stato di attivazione IRF5 endogeno durante i primi eventi di attivazione. Il protocollo comporta semplici modifiche a un protocollo PAGE nativo standard per consentire la distinzione tra le forme monnomeiche e dimericiche di IRF5. Può essere facilmente adattato agli studi utilizzando altre linee cellulari23. Questo protocollo nativo PAGE modificato può risolvere l'IRF5 endogeno nelle sue due forme chiaramente senza interferenze proteiche non specifiche (Figura 2). EndogenoUs IRF5 da cellule non stimolate è stato rilevato come una chiara banda singola in questo sistema di gel, mentre il trattamento con R848 per 2 h ha provocato la comparsa di una banda corrispondente ai dimeri IRF5 (Figura 1).
Un saggio di dimerizzazione di PAGE nativo per IRF3, un fattore di trascrizione simile a IRF5 nella stessa famiglia, è stato sviluppato e ampiamente utilizzato negli ultimi due decenni32. Nonostante i test approfonditi e la risoluzione dei problemi, non siamo stati in grado di applicare lo stesso protocollo che impiega il sistema Laemmli Tris-glicina per risolvere il monomero e il dimero IRF5. Il protocollo descritto in questo articolo utilizza gel a gradiente Bis-Tris, che hanno una chimica molto diversa dai gel a percentuale singola Tris-glicina utilizzati nel protocollo IRF3. Il pH e la composizione chimica dei sistemi elettroforetici del gel possono essere cruciali per distinguere le varie forme di IRF3 e IRF5. Infatti, IRF3 e IRF5, sebbene simili, hanno proprietà diverse (ad esempio, punti isoelettrici e siti di modifica) che probabilmente conseguenti comportamenti diversi mentre vengono separati su diversi sistemi di gel.
Per l'esecuzione del gel è stato utilizzato un buffer di esecuzione PAGE nativo 1x contenente DOC. Il tampone deve essere preparato fresco o conservato in un ambiente pulito e privo di proteine per evitare la comparsa di precipitati bianchi che offuscano la soluzione nella camera superiore a causa di proteine non specifiche che precipitano DOC. Si raccomanda vivamente che i campioni endogeni IRF5 estratti siano sottoposti al PAGE nativo il più presto possibile, preferibilmente entro una settimana con cicli minimi di congelamento-disgelo. In caso contrario, ci può essere una significativa degradazione delle proteine. La degradazione è osservata con un deposito sia a -80 gradi centigradi che a -20 gradi centigradi. Inoltre, il pH del buffer in esecuzione SDS e del buffer di lavaggio TBST deve essere regolato in RT.
Il volume finale ideale del campione caricato in ogni pozzo era di 10-15 gradi l, ma potrebbero essere necessarie lievi regolazioni a seconda dei diversi tipi di cellule. Dopo la corsa iniziale a 85 V per 30 min, si consiglia di continuare a eseguire il gel a 150 V per circa 2 a 3 h per ottenere una netta separazione e risoluzione del momomero e dimero IRF5. Dopo che la corsa è terminata, è della massima importanza per gestire il gel meticolosamente dalla sua estremità inferiore a causa dei suoi livelli differenziali di densità, che vanno dal 3% in alto e in aumento verso il 12% in basso. In questo caso, è preferibile rimuovere il gel dalla piastra immergendolo nel tampone di corsa utilizzato, che agisce come un cuscino di impatto per ridurre al minimo l'attrito e permette al gel di galleggiare lontano dalla piastra per evitare la rottura.
Alcuni piccoli inconvenienti di questo protocollo includono la limitata selezione di gel disponibili per ottenere i risultati desiderati. Gel fatti in casa e alcune altre marche di gel disponibili in commercio sono stati testati senza successo. Nelle nostre mani, l'uso di un sistema commerciale di tamponare e gel in esecuzione ha contribuito alla robustezza e riproducibilità di questo protocollo, anche se non sono stati eseguiti test approfonditi di buffer fatti in casa. L'attenzione ai dettagli è essenziale e l'esperienza è la chiave del successo nell'ottenere risultati chiari. Infine, la risoluzione dell'IRF5 ha richiesto molto tempo (ad es. 2h 3 h) per ottenere una separazione ideale del monomero e del dimero. Ulteriori miglioramenti e modifiche in futuro possono migliorare l'efficienza e ridurre al minimo gli svantaggi di questo protocollo.
In conclusione, questo protocollo è un robusto saggio per la rilevazione di monomero e dimero IRFous endogeno. È adatto per applicazioni in vari tipi di cellule umane e murine che esprimono IRF5 endogeno. Sarà uno strumento prezioso per studiare i percorsi normativi IRF5 e i componenti di segnalazione in vari tipi di cellule.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il lavoro è stato sostenuto da finanziamenti dai fondi della Fondazione Croucher e della City University. Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Chow per l'aiuto con l'esperimento e la lettura critica del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies, HK | 21985023 | |
| 300 W/250 V power supply 230 V AC | Life Technologies, HK | PS0301 | |
| Anti-IRF5 antibody | Bethyl Laboratories, USA | A303-385 | |
| BIOSAN Rocker Shaker (cold room safe) | EcoLife, HK | MR-12 | |
| EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4x 100 mL | Life Technologies | 15575020 | |
| Glycerol 500 mL | Life Technologies | 15514011 | |
| Glycine | Life Technologies, HK | 15527013 | |
| Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 610-145-002-0.5 | |
| Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 611-145-002-0.5 | |
| Halt protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fisher Scientific, HK | 78430 | |
| HEPES | Life Technologies, HK | 15630080 | |
| LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Gene Company, HK | 927-50000 | |
| Mini Tank blot module combo; Transfer module, accessories | Life Technologies, HK | NW2000 | |
| NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit | Life Technologies, HK | BN1001BOX | |
| NativePAGE Running Buffer 20x | Life Technologies, HK | BN2001 | |
| NativePAGE Sample Buffer 4x | Life Technologies, HK | BN2003 | |
| NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol | Tin Hang/Calbiochem, HK | #492016-100ML | |
| PBS 7.4 | Life Technologies, HK | 10010023 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Bio-gene/Merck Millipore, HK | IPFL00010 | |
| Protein assay kit II (BSA) | Bio-Rad, HK | 5000002 | |
| R848 | Invivogen, HK | tlrl-r848 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies, HK | 61870127 | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | BP358-1 | |
| Sodium deoxycholate ≥97% (titration) | Tin Hang/Sigma, HK | D6750-100G | |
| Tris | Life Technologies, HK | 15504020 | |
| TWEEN 20 | Tin Hang/Sigma, HK | #P9416-100ML |
References
- Takaoka, A., et al. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Nature. 434 (7030), 243-249 (2005).
- Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. IKKbeta is an IRF5 kinase that instigates inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17438-17443 (2014).
- Negishi, H., Taniguchi, T., Yanai, H. The Interferon (IFN) Class of Cytokines and the IFN Regulatory Factor (IRF) Transcription Factor Family. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 10 (11), (2018).
- Clark, D. N., et al. Four Promoters of IRF5 Respond Distinctly to Stimuli and are Affected by Autoimmune-Risk Polymorphisms. Frontiers in Immunology. 4, 360 (2013).
- Bo, M., et al. Rheumatoid arthritis patient antibodies highly recognize IL-2 in the immune response pathway involving IRF5 and EBV antigens. Scientific Reports. 8 (1), 1789 (2018).
- Duffau, P., et al. Promotion of Inflammatory Arthritis by Interferon Regulatory Factor 5 in a Mouse Model. Arthritis and Rheumatolpgy. 67 (12), 3146-3157 (2015).
- Feng, D., et al. Irf5-deficient mice are protected from pristane-induced lupus via increased Th2 cytokines and altered IgG class switching. European Journal of Immunology. 42 (6), 1477-1487 (2012).
- Richez, C., et al. IFN regulatory factor 5 is required for disease development in the FcgammaRIIB-/-Yaa and FcgammaRIIB-/- mouse models of systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 184 (2), 796-806 (2010).
- Tada, Y., et al. Interferon regulatory factor 5 is critical for the development of lupus in MRL/lpr mice. Arthritis and Rheumatology. 63 (3), 738-748 (2011).
- Weiss, M., et al. IRF5 controls both acute and chronic inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 11001-11006 (2015).
- Schoenemeyer, A., et al. The interferon regulatory factor, IRF5, is a central mediator of toll-like receptor 7 signaling. Journal of Biological Chemistry. 280 (17), 17005-17012 (2005).
- Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. Functional regulation of MyD88-activated interferon regulatory factor 5 by K63-linked polyubiquitination. Molecular and Cellular Biology. 28 (24), 7296-7308 (2008).
- Lopez-Pelaez, M., et al. Protein kinase IKKβ-catalyzed phosphorylation of IRF5 at Ser462 induces its dimerization and nuclear translocation in myeloid cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17432-17437 (2014).
- McGettrick, A. F., O'Neill, L. A. Localisation and trafficking of Toll-like receptors: an important mode of regulation. Current Opinion Immunology. 22 (1), 20-27 (2010).
- Baccala, R., Hoebe, K., Kono, D. H., Beutler, B., Theofilopoulos, A. N. TLR-dependent and TLR-independent pathways of type I interferon induction in systemic autoimmunity. Nature Medicine. 13 (5), 543-551 (2007).
- Gilliet, M., Cao, W., Liu, Y. J. Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleic acids in viral infection and autoimmune diseases. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 594-606 (2008).
- Kawai, T., Akira, S. Toll-like Receptors and Their Crosstalk with Other Innate Receptors in Infection and Immunity. Immunity. 34 (5), 637-650 (2011).
- Liu, Z., Davidson, A. Taming lupus-a new understanding of pathogenesis is leading to clinical advances. Nature Medicine. 18 (6), 871-882 (2012).
- del Fresno, C., et al. Interferon-beta production via Dectin-1-Syk-IRF5 signaling in dendritic cells is crucial for immunity to C. albicans. Immunity. 38 (6), 1176-1186 (2013).
- Wang, X., et al. Expression Levels of Interferon Regulatory Factor 5 (IRF5) and Related Inflammatory Cytokines Associated with Severity, Prognosis, and Causative Pathogen in Patients with Community-Acquired Pneumonia. Medical Science Monitor. 24, 3620-3630 (2018).
- Zhao, Y., et al. Microbial recognition by GEF-H1 controls IKKepsilon mediated activation of IRF5. Nature Communications. 10 (1), 1349 (2019).
- Almuttaqi, H., Udalova, I. A. Advances and challenges in targeting IRF5, a key regulator of inflammation. FEBS Journal. 286 (9), 1624-1637 (2019).
- Chow, K. T., et al. Differential and Overlapping Immune Programs Regulated by IRF3 and IRF5 in Plasmacytoid Dendritic Cells. The Journal of Immunology. 201 (10), 3036-3050 (2018).
- Cheng, T. F., et al. Differential Activation of IFN Regulatory Factor (IRF)-3 and IRF-5 Transcription Factors during Viral Infection. The Journal of Immunology. 176 (12), 7462-7470 (2006).
- Chang Foreman, H. C., Van Scoy, S., Cheng, T. F., Reich, N. C. Activation of interferon regulatory factor 5 by site specific phosphorylation. PLoS One. 7 (3), 33098 (2012).
- Lin, R., Yang, L., Arguello, M., Penafuerte, C., Hiscott, J. A CRM1-dependent nuclear export pathway is involved in the regulation of IRF-5 subcellular localization. Journal of Biological Chemistry. 280 (4), 3088-3095 (2005).
- Stone, R. C., et al. Interferon regulatory factor 5 activation in monocytes of systemic lupus erythematosus patients is triggered by circulating autoantigens independent of type I interferons. Arthritis and Rheumatology. 64 (3), 788-798 (2012).
- De, S., et al. B Cell-Intrinsic Role for IRF5 in TLR9/BCR-Induced Human B Cell Activation, Proliferation, and Plasmablast Differentiation. Frontiers in Immunology. 8, 1938 (2017).
- Fabie, A., et al. IRF-5 Promotes Cell Death in CD4 T Cells during Chronic Infection. Cell Reports. 24 (5), 1163-1175 (2018).
- Cushing, L., et al. IRAK4 kinase activity controls Toll-like receptor-induced inflammation through the transcription factor IRF5 in primary human monocytes. Journal of Biological Chemistry. 292 (45), 18689-18698 (2017).
- Li, C., Arakawa, T. Application of native polyacrylamide gel electrophoresis for protein analysis: Bovine serum albumin as a model protein. International Journal of Biological Macromolecules. 125, 566-571 (2019).
- Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
- Subhadarshanee, B., Mohanty, A., Jagdev, M. K., Vasudevan, D., Behera, R. K. Surface charge dependent separation of modified and hybrid ferritin in native PAGE: Impact of lysine 104. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1865 (10), 1267-1273 (2017).
- Reynolds, J. A., Tanford, C. Binding of Dodecyl Sulfate to Proteins at High Binding Ratios - Possible Implications for State of Proteins in Biological Membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (3), 1002 (1970).
- Manning, M., Colon, W. Structural basis of protein kinetic stability: resistance to sodium dodecyl sulfate suggests a central role for rigidity and a bias toward beta-sheet structure. Biochemistry. 43 (35), 11248-11254 (2004).
- Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. IKKalpha negatively regulates IRF-5 function in a MyD88-TRAF6 pathway. Cellular Signalling. 22 (1), 117-127 (2010).
- Paun, A., et al. Functional characterization of murine interferon regulatory factor 5 (IRF-5) and its role in the innate antiviral response. Journal of Biological Chemistry. 283 (21), 14295-14308 (2008).
- Yasuda, K., et al. Murine dendritic cell type I IFN production induced by human IgG-RNA immune complexes is IFN regulatory factor (IRF)5 and IRF7 dependent and is required for IL-6 production. The Journal of Immunology. 178 (11), 6876-6885 (2007).
- Steinhagen, F., et al. IRF-5 and NF-kappaB p50 co-regulate IFN-beta and IL-6 expression in TLR9-stimulated human plasmacytoid dendritic cells. European Journal of Immunology. 43 (7), 1896-1906 (2013).
- Gratz, N., et al. Type I interferon production induced by Streptococcus pyogenes-derived nucleic acids is required for host protection. PLoS Pathogens. 7 (5), 1001345 (2011).
