Summary
低温圈中的碳通量尚待评估，但对气候变化至关重要。在这里，我们展示了一种新型原型设备，它基于激光诱导荧光发射（L.I.F.E.）技术，在超高空环境中捕获光动电位，在原位条件下提供高光谱和空间分辨率数据。
Abstract
全球变暖影响各种生态系统中的微生物群落，特别是低温层生境。然而，在极端环境中，对微生物介导的碳通量知之甚少。因此，在很少的研究中描述的样品采集方法意味着两个主要问题：A） 高分辨率数据需要大量的样本，这在偏远地区很难获得;b） 高分辨率数据需要大量的样本。（b） 高分辨率数据需要大量的样本，这在偏远地区是很难获得的;B） 不可避免的样品操作，如切割、锯切和冰芯熔化，导致对原地条件的误解。在这项研究中，提出了一种既不需要样品制备，也不需要样品销毁的原型装置。该装置可用于地面和冰生态系统中具有高光谱和空间分辨率的原位测量，并基于Laser-I-F-F.E.技术。 光自营养化前体群落可以通过检测光色素中的L.I.F.E.特征来识别。演示了用于叶绿素衍生素a （chla） （405 nm 激光激发） 和 B-phycorrin （B-PE） （532 nm 激光激发） 的 L.I.F.E. 仪器校准。为了验证这种方法，L.I.F.E. 数据通过涉及颜料提取和随后的吸收光谱的定量的常规方法获得批准。原型在野外的适用性在极端极地环境中得到了验证。在摩洛哥甜点和奥地利岩石冰川的火星模拟模拟期间，对陆地生境进行了进一步测试。L.I.F.E. 仪器支持对具有可接受操作物流的大片区域进行高分辨率扫描，并有助于更好地了解全球变化背景下的上冰川社区的生态潜力。
Introduction
冰层蕴藏着海冰、冰川、高山湖泊、雪区、湖冰、融水流和永久冻土。这些区域覆盖了地球大约11%的陆地1，2，被大气层作为公认的低温层环境所覆盖。最近的研究表明，巨大的低温圈正在迅速退缩3，4。南极5、6、阿尔卑斯山7、北极8、其他地区出现负冰质量平衡。冰盖和冰川的退缩导致我们地球上最大的淡水水库枯竭。在一些地区，冰川退缩势不可挡。
长期以来，冰生态系统被认为是无菌环境。然而，尽管条件恶劣，地球低温圈中活跃生命的存在是显而易见的9，10，11，12，13，14，15.由于冰的融化导致冰层大量流失，冰层正在经历生物活动的变化，影响到邻近的生境。为了理解这些部分不可逆转的变化，我们需要方法，以高空间和时间分辨率在原位条件下研究冰中的生物活动。
在上冰川环境中，可以在低温石洞、雪盖、融化的水、溪流和裸露的冰面中找到生命。然而，最明显的上冰川栖息地是低温石洞。它们出现在全球的冰川环境中，最初由瑞典探险家阿道夫·埃里克·诺登斯克约尔德在1870年16、17年对格陵兰岛的探险中描述。这个名字源自希腊语单词"kryos"（冷）和"科尼亚"（灰尘）。Aeolian衍生的深色有机和无机碎屑附着在冰面上，并局部减少反光。太阳辐射促进碎片融化成更深的冰层，在9号底部形成圆柱形盆地，形成沉积物（低温石）。冷冻层孔覆盖0.1-10%的冰川消融区11。
冷冻生物群落由病毒、真菌、细菌、蓝藻、微藻和原生动物组成。根据地区的不同，还可以发现元类生物，如轮虫、线虫、食虫、龙舌兰和昆虫幼虫。爱德华兹等人18人将低温洞描述为"冰冷的热点"。他们还追踪了低温光酸孔中负责N、Fe、S和P循环的功能基因。迷你湖生态系统以温暖和营养丰富的栖息地11的速度呼吸和光合。这些发现强调了微生物固存在上拉环境中的重要作用。除了低温洞中的生活社区外，裸露的冰面上还栖息着冰藻。他们的生理学研究得很好，但他们的空间分布还没有被评估20。它们在上拉环境中的存在减少了反时率，从而促进融化，导致营养物质的外露和营养输入到下游生境9。温度升高，因此液态水供应增加，影响了这些冰冻生态系统的净生态系统生产力。
在上拉冰川环境中，光合活性生物将无机碳和氮转化为有机的微生物食物网21、22的可用来源。到目前为止，很少有研究可以估计上拉的碳通量11，20，23。拟议碳通量率的差异源于较低的空间和时间数据分辨率。此外，在低温石洞外，对上拉面社区的空间分布几乎没有评估。库克等人20日在他们的模型中预测，由于表面覆盖面积大，高升藻群落的碳含量比当代低温石洞多11倍。由于缺少现场检测和定量工具，确保样品完整性的上藻群落的检测仍然受到阻碍。
为了应对后勤方面的困难，对冰生态系统的研究频率低于温带地区的生境。数据分辨率取决于评估的样本数量，并取决于研究地点的可访问性。标准取样方法，如锯、腐蚀和随后熔化，涉及微生物群落的操纵。例如，在无实质性干扰的情况下，使用标准方法，在固体冰样品中进行叶绿素a（chl a）评估是不可能的。因此，被调查的微生物群落内因熔融引起的温度变化是不可避免的。针对22号中光系统II和其他细胞结构的热度，实验室对融化的冰样品的分析总是会导致原位条件的伪造。
无损原位测量是获得可靠数据的唯一合理方法。这一目标可以通过基于荧光的方法来实现。由于其光收集功能，chla和B-b-b-PE存在于生物体中，这些生物体在超冰川环境中促进碳循环，阿内西奥等人已经证明了这一点。因此，这些荧光分子是冰生态系统中微生物介导碳通量定量的合适生物标志物。
在这项研究中，我们介绍了一种新型非侵入性工具在陆地和冰生态系统中就地定量chla和B-PE分子的开发、校准和应用。原型装置基于激光诱导的荧光发射，也称为L.I.F.E。光学仪器 （图 1） 捕获激光诱导荧光激发后的荧光生物标志物特征.该过程是非破坏性的，可以在研究现场或实验室进行。
图1：L.I.F.E.原型。左图：没有保护盖的仪器照片。右图：仪器的示意图。总质量 = 5.4 千克（激光和光学设备 = 4.025 千克，笔记本电脑 = 1.37 千克）。铝制框架 = 32.5 厘米 x 20.3 厘米 x 6.5 厘米光学管：18.4 厘米 x 4 厘米（直径）。CCD：蓝狐mv220g传感器;F：伺服式长通滤波器（450 nm 和 550 nm）;L：光学透镜;M1：镜子;M2：二色镜;MC：微控制器;P：棱镜;PBS：偏振光束分割器;S： 由可调节剃须刀刀片制成的狭缝孔径。比例尺 = 70 毫米。请点击此处查看此图的较大版本。
便携式双波长套件重 4.5 千克，与外部计算机结合使用三脚架。现场设置快速简便。仪器连接到三脚架，镜头管与 USB 电缆和相机电缆一起连接到设备。外部计算机使用 USB 电缆连接到仪器。三脚架腿的调整方式使透镜管朝向并覆盖试样。然后，5 mW 绿色激光在通过偏振波束分离器后击中样品，该分离器将偏振光重定向到光谱仪的光轴。标本显示荧光灯，如图1所示为红色。一半的准直光通过偏振光束分割器，并通过伺服式长通滤波器聚焦，从而去除激光信号。接下来，信号击中由两个可调节剃须刀刀片组成的孔径狭缝。在传感器捕获信号之前，棱镜光谱将正交的光线与狭缝孔径分离。使用蓝色激光重复该过程。原始数据会自动传输到也用于软件操作的便携式计算机。
该仪器由外部计算机使用 LabVIEW 环境进行控制，该环境可与 CCD 摄像机同步拍照、打开/关闭激光器以及旋转长通滤光轮。图形用户界面 （GUI） 分为三个主要部分。曝光调整是手动完成的。尽管暴露时间和信号强度之间的校正是线性的（图2B），但最大暴露时间被限制在10s，因为较长的积分时间会导致信噪比的显著降低。注释字段用于示例描述 （图 2A）。在右侧部分，测量完成后，就会显示原始图像。此功能对于现场的即时数据评估至关重要（图 2C+E）。红色区域表示过度曝光的像素，可以通过减少曝光时间来避免。
后续的原始数据缩减过程与图像采集过程分离，可在图像采集后随时完成。
图2：用于数据采集和原始数据评估的L.I.F.E.图形用户界面。（A） 该软件支持手动输入示例说明的文本。（B） 在测量前可以调整曝光时间。（C+E）原始图像显示在界面的右侧。（E） 红色表示传感器饱和。（F）激活"运行测量"按钮会触发数据采集过程。在数组 （G） 中，将显示数据采集期间自动执行的所有命令。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3：原始图像的示例。左图：丙酮溶液中标准chl的原始数据，用L.I.F.E仪器记录。由于器件的光学特性，信号显示为扭曲线。右图：每像素 （px） 的原始图像的解释。光谱轴（5 nm/px 分辨率）根据空间轴（30 μm/px 分辨率）绘制。请点击此处查看此图的较大版本。
12 位灰度原始图像显示了由于一维孔径狭缝引起的空间分量，以及由于 CCD 前面的棱镜而导致的光谱分量（图 3）。响应光学约束，原始图像被扭曲。因此，需要通过应用识别失真程度的代码来裁剪和扭曲它们。这是用软件向导完成的 （图 4）。接下来，使用 532 nm 激光完成波长校准。1，064 nm 红外激光器的频率翻倍，产生绿光。CCD 可以检测到这两种波长，因此，每个像素的光谱位置可以自动在变形图像中计算（图 4）。
然后，将图片裁剪到给定的波长范围（绿色激光测量为 550–1，000 nm，蓝色激光测量为 400–1，000）。对选定像素行中每个像素的灰色值进行计数和汇总。灰色值的范围为 0~255。之后，每个像素行都占一个数字。此外，屏幕软件指令还会导致生成一个绘图，显示根据空间坐标绘制的每个像素线的灰色值计数。这允许在样本中同时对 chla和 B-PE 进行定量空间区分。此外，可以从选定的像素线自动绘制样本的光谱属性。
图 4：去扭曲原始图像。左图：使用绿色激光捕获的原始图像。未使用筛选器。信号以 532 nm 和 1，064 nm 显示。曝光时间 = 0.015 s.中心：裁剪的 532 nm 信号用作用于变形一组图像的参考线。右图：从原始图像源中变形的图像。请点击此处查看此图的较大版本。
Protocol
1. 校准和验证
注：对于颜料校准，准备从 chla和 B-PE 的库存溶液中稀释行。用丙酮稀释原料溶液，用蒸馏无菌水稀释B-PE。稍后，需要每个稀释步骤的 15 mL。用铝箔包装颜料，防止光线照射。将 chla存放在冰箱中，将 B-PE 存放在冰箱中，直到进一步使用。在 chla的第 1.1 节和 B-PE 的 1.2 节中，详细介绍了稀释行。下面介绍了用于颜料检测和定量的 chla和 B-PE 实验室校准。以前的校准24是用与本研究相同的颜料进行的。
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叶绿素稀释行
- 在50 mL样品管中用丙酮溶解1mga（从A.尼杜兰藻中纯化），用丙酮稀释此chl，将丙酮稀释至以下最终浓度：1，000;800;640;320;160;80;40;20;10;5;1;和 0.5 纳克/千米
- 将每个稀释15 mL转移到 50 mL 样品管中，并由于光敏性将其覆盖在铝箔中。将管子存放在-20°C冷冻室中，直到进行校准测量。
注： 协议可以在此处中断。 - 测量双光束分光光度计中每个稀释的吸收特性，作为三倍，并计算Lorenzen25所描述的chl含量，将在第2.2.2节中详细描述。
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PE 稀释行
- 用无菌过滤水（pH = 7）稀释4mg/mL B-PE库存溶液至以下最终浓度：1，000;800;640;320;160;80;40;20;10;和 5 纳克/mL B-PE。在 50 mL 样品管中传输每个稀释 15 mL 的稀释剂，然后用铝箔覆盖。储存在4°C，直到进一步使用。
注： 协议可以在此处中断。
- 用无菌过滤水（pH = 7）稀释4mg/mL B-PE库存溶液至以下最终浓度：1，000;800;640;320;160;80;40;20;10;和 5 纳克/mL B-PE。在 50 mL 样品管中传输每个稀释 15 mL 的稀释剂，然后用铝箔覆盖。储存在4°C，直到进一步使用。
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校准设置
- 如图5所示，构建一个机架以建立三个测量平台，每个平台比下一个平台高 1.5 厘米。
注：机架和柱高在测量中起着重要作用，因为液体的表面应保持在L.I.F.E.仪器的焦点处，如图5所示。 - 在多晶塑料小瓶中加入5 mL的最高浓缩稀释剂，并将其放在机架的最高点上。测量荧光强度。
- 将小瓶放在机架的中间位置，再添加 5 mL（总体积为 10 mL）。测量荧光强度。在机架上的最低位置重复此过程，再重复 5 mL（总体积为 15 mL;柱高总计为 45 mm）。
注：调整每个稀释步骤的曝光时间，以防止探测器饱和（12 位图像中的灰值超过 255），并实现弱荧光信号的足够信噪比。 - 重复步骤 1.3.2 和 1.3.3，重复 chla和 B-PE 的所有稀释（步骤 1.1.1 和 1.2.1）。
- 将生成的数据文件加载到数据缩减向导中，以自动计数和汇总沿 Y 轴（空间分布）的每个像素线的灰色值。
注：通过将荧光强度标准化为1s的积分时间自动补偿不同的暴露时间。 - 使用稀释序列的已知浓度和计算的标准化荧光强度，使用泊成回归分析计算颜料面积密度。然后，通过将每个柱高度的计数与因子（因子 1、0.5 和 0.33，分别为 5 mL、10 mL 和 15 mL 浓度溶液）相乘，将荧光计数从三个不同的柱高度标准化到 1.5 厘米（5 mL）。
- 如图5所示，构建一个机架以建立三个测量平台，每个平台比下一个平台高 1.5 厘米。
图 5：实验室条件下使用 chla和 B-PE 校准的 L.I.F.E. 校准设置。
（A） 仪器的透镜管.（B） 用于 B-PE 激发的绿色激光。（C） 蓝色激光用于激发。（D） 闪烁小瓶.（E） L.I.F.E. 仪器的聚焦点.（F） B-PE/水或chl5 mL、10 mL 和 15 mL 的 /丙酮溶液。（G） 将每个溶液的表面保持在三个不同体积的焦平面上的垫板。请点击此处查看此图的较大版本。
2. 取样和样品处理
- 雪和冰的集合
- 将雪和上拉冰从冰川收集到无菌聚乙烯袋中，并冷冻起来，直到进一步加工。
注：在这项研究中，这些样本是在米特尔·洛文布林（MLB）收集的，这是一个多热冰川，靠近北极群岛高海拔群岛的Ny-@lesund（北78°53'，东12°03'）。 - 将冰川前场的细菌垫样品放入无菌聚乙烯袋中，并将所有样品运送到实验室进行进一步加工。
- 在4°C下在黑暗中缓慢熔化冷冻材料。在 GF/F 过滤器（直径 47 mm）上过滤液体样品，并记下过滤的体积。保持过滤器冻结，直到进一步处理。
- 将雪和上拉冰从冰川收集到无菌聚乙烯袋中，并冷冻起来，直到进一步加工。
- 叶绿素测量
- 使用 L.I.F.E. 仪器测量四个随机区域的滤波器，每个区域使用绿色和蓝色激光进行三次测量。通过将面积密度与过滤面积和过滤体积相乘来计算颜料总浓度。将颜料浓度（μg/L）标准化至1 L的体积。
- 根据Lorenzen25的协议，用实验室标准对GF/F过滤器的内容进行评估。为此，将每个过滤器放入装有13 mL丙酮的瓶中，并将其储存在黑暗中，在4°C处过夜。接下来，在连续模式下以 50% 的功率在声波之前，取一个小瓶并将其放在冰上，然后声波 2 分钟。挤压过滤器并将其从小瓶中取出。
- 将 tygon 管连接到注射器，并从小瓶中取出提取丙酮混合物。用 GF-5 滤嘴座更换泰贡管。将溶液转移到石英比色皿中。
- 校准丙酮的吸光光谱仪后，将样品放入色光仪中，并测量 400–750 nm 之间的吸光特性。接下来，从光谱仪中取出比色皿，并将 2M HCl 的 200 μL 添加到样品中。然后，重复吸光度测量以测量样品中的氟素含量。
- 通过放射性标记标记测量微生物活性以及激光强度和暴露时间对生产率的影响
注意：注意标记放射性（β-辐射）。使用实验室外套、手套和护目镜，并在有执照的同位素实验室的烟罩下工作。- 对于细菌生产，将五个等分的细菌垫转移到无菌聚乙烯袋中。将甲醛抑制到4%的最终浓度。
注： 三个等分用于3个 H 标记的亮氨酸吸收，两个等分用于控制。 - 用蓝色激光（405 nm，5 mW）和绿色激光（532 nm，5 mW）照射垫子，每片10s和30s。使用 50 mW 激光重复此过程。然后，使未用甲醛处理的样品灭活。
注：一个垫子仅用于一次激光照射。使用非暴露的微生物垫作为对照。 - 激光处理后，分别采用3种H-亮氨酸和NaH14CO3，估计细菌和初级生产。对于细菌生产测量，每个样品使用五个等分（20 mL），并将形式（4%最终浓度）添加到两个平行体中，作为标记非生物结合的控制。在各种处理的所有样品中加入3个H-亮氨酸（40 nM），并在原位条件下（0.1 °C）孵育4小时。通过在剩余的活样中加入形式，终止反应。
- 对于细菌生产的细菌垫，将标记的样品转移到冷冻液中。根据Kirchman26和Bell27的协议，提取含有5%三氯乙酸和离心机在10，000 x g的细胞5分钟。加入闪烁液体，将冷冻液放入多晶泡小瓶中。使用液体闪烁计数器分析样品并计算取用率。
注： 三个等分用于3个 H 标记的亮氨酸吸收，两个等分用于控件。 - 对于初级生产，准备五个复制的各种处理（100 mL），包装其中两个铝箔模仿暗样品，并添加NaH14CO3 （1 μCi）到所有。在环境光和原位温度（0.1 °C）内孵育4小时。通过将其余三个复制变暗并过滤到 GF/F 过滤器（25 mm 直径）上，终止反应。
- 将 100 μL 的 2 N HCl 添加到过滤器中，以清除所有多余的碳，并在烟罩下排出空气。在加热板上以 80°C 干燥样品，并将样品放入多闪烁小瓶中。
- 为了测量初级和细菌生产的所有处理方法每分钟 （dpm） 的放射性分解，将冷冻液放入多晶片小瓶中，并加入 5 mL 的闪烁鸡尾酒。使用液体闪烁计数器测量 dpm 并计算接受率。
- 对于细菌生产，将五个等分的细菌垫转移到无菌聚乙烯袋中。将甲醛抑制到4%的最终浓度。
Representative Results
B-PE 实验室校准
B-PE稀释行的响应信号在20°C的暗室中用L.I.F.E.仪器测量（图6）。计数速率取决于所测样品的浓度和柱高度。与相同浓度和较高柱高的样品相比，低浓度和低柱高B-PE样品荧光更强。
图6：B-PE实验室校准。显示了 B-PE 含量和列密度校准。对1.5厘米的柱高度计算了标准化的计数率。使用权限28重印。请点击此处查看此图的较大版本。
泊森回归用于最终校准线拟合。面积密度与像素灰值计数之间存在线性相关。曲线的函数为 y = 81.04x（图 7），这意味着 1 s 外露样本中的灰值计数速率为 8，104 等于 100 纳克/cm2 B-PE 的区域密度。以模拟方式设置校准。函数为 y = 8.94x。
图7：B-PE的最终校准曲线。灰色值计数归一化为 1 s 的曝光时间，并针对区域密度绘制。以权限28重新打印 。请点击此处查看此图的较大版本。
斯瓦尔巴特的低温瓷样品应用和实验室数据验证
图8说明了L.I.F.E.测量的平均值和从使用丙酮进行常规提取得出的相同样品的单个测量值以及随后使用分光光度计的分析。
图 8：使用自然样本进行数据验证。样品 （MLB） 根据实验室分光光度计（单值）的结果，按chl含量进行排名，并与每个滤波器在四个随机区域测量的荧光数据进行比较。误差条表示 L.I.F.E. 测量值的标准偏差。请点击此处查看此图的较大版本。
48 μg/L=67 μg/L的含量被低估，L.I.F.E. 原型高估了 0.7 μg/L=7 μg/L 的含量。与L.I.F.E.测量值的标准偏差较低。
现场测量的光谱数据与实验室标准的比较
Chla光谱在低温石样品和从A. nidulans藻类中纯化的样品之间具有可比性。所有样品的荧光峰位于700nm-710nm。然而，从低温石样品中提取的光谱显示，与chl颜料标准光谱相比，400纳米-650nm和800纳米至1，000nm之间的噪声信号较高（图9）。
图 9：光谱数据解释。使用 405 nm 激光激发后测量四个低温石颗粒（蓝色）和一个标准颜料溶液（红色） 。光谱在样品收集后1年记录。样品被冷冻，在测量前没有暴露在光线下。针对波长校准问题，荧光峰值位于 700 nm-710 nm，而不是 680 nm。请点击此处查看此图的较大版本。
自动低温颗粒分析
在低温光碱孔的自动分析实例中（图10），在像素线50处观察到最高的颜料面积密度。532 nm 激光激发后的样本光谱显示，由于传感器的过饱和，在灰值为 255 时，出现了一个切口的峰值。此峰值来自绿色激光，而不是来自荧光信号。
图10：直径为1毫米的单微球石颗粒的自动数据分析。样品是在韦斯特雷·布吕格布林（VBB）采集的，在Ny-@lesund北极站（GB）设施的一个黑暗的实验室取样后，在4小时内进行测量。左列显示 B-PE 测量值，右列表示数据。原始图像显示在顶部。激光引起的荧光反应以灰色显示。红色区域表示标准颜料的响应。中间部分说明了目标颜料的空间分布。荧光信号的光谱特性显示在较低的图像中。请点击此处查看此图的较大版本。
激光激发对细菌垫生产力的影响
增加激光的功率和/或暴露时间时，初级或细菌的生产力均不受影响（图11）。在功率增大的激光处理下未发现显著差异。
图11：斯瓦尔巴群岛样品的生产率测量。细菌垫用不同激光强度和曝光时间的绿色和蓝色激光照射。数据根据激光波长源（绿色和蓝色）进行着色。请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
校准
将光子计数归化为1s的暴露时间后，颜料浓度和荧光强度之间存在线性相关性。 低柱高和低颜料浓度的样品导致对目标颜料的高估，与具有相同颜料浓度的柱高相比。此外，弱荧光信号需要长时间的曝光时间，才能在传感器上计算足够的光子。然而，长时间的集成时间也增加了传感器上的杂散光量，导致信噪比降低。在当前版本中，软件无法在数据缩减过程中区分噪声和信号。因此，低荧光强度测量导致颜料高估，因为噪声被计为来自目标颜料的信号。此外，较浓缩的颜料溶液的荧光强度比低浓度溶液具有更大的变异性。这种效应可以通过用于校准曲线的颜料溶液中的吸收过程来解释。
叶绿素定量的数据验证
过滤冰雪样品后，三维样品几乎作为二维样本出现在过滤器上。这证明L.I.F.E（面积密度）和分光光度数据（体积测量）之间的直接比较是合理的。
数据集（图8）表明，高颜料浓度导致低估，而低颜料浓度导致高估实际价值。这种效果可以通过滤饼的厚度以及样品的体积特性来解释。激光穿透深度取决于试样的光密度和厚度。由于激光不能在更深的层中诱导颜料荧光，因此低估了高颜料含量。然而，在薄滤饼中，由于颜料的面积密度低，低荧光信号被捕获。显然，滤波器本身在通过450nm长通滤波器后显示激光感应信号（图12）。该信号被误导性地计为从 chla派生的荧光信号。因此，薄和太厚的滤饼很难用L.I.F.E.仪器测量。
图12：来自GF/F滤波器上的厚（A）和薄（B）滤波器蛋糕的荧光信号。（A） 自着色可防止激光引起的较深层荧光，导致实际颜料浓度低估。（B） 滤饼的荧光发射，通过滤光反射覆盖。（C） 原始数据显示滤波器反射（灰色）。实验室衍生的荧光模式的光谱特性以红色表示。比例尺 = 45 mm。请点击此处查看此图的较大版本。
L.I.F.E. 原型的局限性
在数据缩减期间，MATLAB 编码软件通过对给定波长范围内的像素线进行求和来解释原始图像。该软件的当前版本没有区分有机信号和无机源信号。存在多个信号可能会导致对实际颜料含量的高估。低荧光强度导致长时间暴露，导致信噪比降低，促进上述效果（见图8和图12）。
图 13所示的大地岩石在以绿色和蓝光照射时呈现红色荧光灯。目前，目前尚不清楚荧光是矿物还是基于紫金素的分子。因此，生物和非生物信号的叠加可能会限制这种方法的应用，需要建立专门为L.I.F.E.原型制作的荧光数据库。
图13：在Ny-@lesund发现的地陆岩矿物荧光。岩石被532nm 50 mW激光（A） 和 405 nm 50 mW 激光 （B） 激发。两张照片都用偏振滤镜在镜头上拍摄，导致实际荧光颜色的伪造。（C） 真彩色图像，在白天条件下不使用偏振滤镜。比例尺 = 40 毫米。请点击此处查看此图的较大版本。
Beutler等人29日得出结论，海洋生态系统中蓝藻的特性发射光谱取决于环境条件。此外，代谢状态对光营养生物的荧光特性有影响30。L.I.F.E 仪器可以使用包含与环境条件相关的样本光谱信息的生物指纹库来区分藻类和蓝藻荧光模式。
在暗适应的chl分子中，所有反应中心都完全氧化，可用于光化学，没有荧光产量被淬火31。使用 L.I.F.E. 程序，标本首先由 532 nm 激光（绿色）激发，然后使用 405 nm 激光（蓝色）激发。在蓝色激光的第二次激发过程中，chla可能由于绿色激光先前激发而显示荧光响应降低。Chla吸收532nm波长的能量，尽管它与吸收最大波长32的距离。在 405 nm 处进行实际chl测量之前，绿色激光可能会导致光化学反应，激活目标颜料中的淬火机制。此外，海洋光营养生物的预照明没有导致450nm-600nm之间的光谱规范曲线发生变化，而荧光强度的标准偏差增加了25%29。根据不同的物种，荧光强度甚至随着先前激发而增加。本主题需要进一步调查。
适用性
我们在各种栖息地测试了L.I.F.E.仪器，重点是低温孔。由于测量过程中没有环境光，激光成功地应用于土壤和生物膜栖息地。当沉积物层阻挡孔底光时，可以测量低温颗粒（图14A，C）。薄沉积物低温岩孔可渗透从下方的杂散光（图14B）。杂散光干扰测量。因此，光秃秃的冰面中的颜料浓度在白天条件下还无法测量。信号处理工作目前正在进行中，以便在高环境光条件下运行系统。
图14：顶部有液态水的低温孔。（A） 冰川上的低温光酸与L.I.F.E.透镜管有关.刻度条 = 70 mm . （B） 沉积物层（红色）非常薄.杂光通过低温光层出血。（C） 沉积物层足够厚，足以阻挡下面的杂散光.这种类型的低温孔是可测量的L.I.F.E.仪器。请点击此处查看此图的较大版本。
最后，我们的L.I.F.E.仪器在陆地生境（如土壤、细菌垫、生物膜和冰川表面的低温石孔）中检测到光自营养生物。目标分子为chla和B-PE。空间分辨率为30μm/px。chla的检测限值为 250 pg/mL，B-PE 的检测限值为 2 纳克/mL。经过实验室校准，我们能够量化在北极研究地点采集的样本中的颜料含量。我们应用了自编程软件进行自动数据缩减过程。矿物的存在和测量过程中光线条件的变化的影响需要进一步调查。
随着气候变暖，温度升高导致液态水的可得性增加，从而在自营养化和异养性性质的冰面上增加生物活性。应积极努力就地检测异养生物，以全面了解低温圈中的活跃生命。这可以用其他目标颜料和适当的激光激发波长进行测试。因此，L.I.F.E. 提供了一个合适的监测系统，为全球变化和可能的天体生物学应用背景下的上天条件提供高时空分辨率。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢上校（IL）J.N.普里茨克，塔瓦尼基金会，美国，奥地利联邦科学，研究和经济部（闪闪发光的科学SPA04_149和SPA05_201），阿尔卑斯福森斯特尔奥贝格尔（AFO），奥地利空间论坛（）[WF），罗曼·埃勒来自亨特图尔·艾斯·帕拉斯特，奥地利联邦林业和基地经理尼克·考克斯来自尼阿莱松德（斯瓦尔巴德）北极站。我们也感谢萨布丽娜·奥布韦格瑟、卡琳娜·罗夫纳和法比安·德鲁斯在拍摄过程中的帮助。最后，我们要感谢詹姆斯布拉德利给声音的伴随视频。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aceton | Merck | 67-64-1 | |
| B-Phycoerythrin | Invirtrogen | P6305 | |
| Chlorophyll a standard | Sigma-Aldrich | C6144-1MG | |
| formaline | Merck | HT501128 | 36% |
| GF/C filters | Whatman | WHA1822025 | 25mm diameter |
| HCl | Merck | H1758 | 36,5-38% |
| L.I.F.E. Prototype | University of Innsbruck | built on demand | |
| LabView | National Instruments | Software, Laboratory Virtual Instrumentation Engineering Workbench | |
| Leucine, L-[4,5-3H], 1 mCi | Perkin Elmer | NET1166001MC | radioactive |
| Liquid scintillation cocktail Beckman Ready Use | Beckman | not more available, can be compensated by Ultra Gold, Packard | |
| liquid scintillation counter | Beckman | out of stock | LSC 6000 IC |
| NaH14CO3 (4 µCi/ml) | DHI Denmark | 4 μCi/ml, 1 ml | radioactive |
| Osmonics polycarbonate filters | DHI Denmark | PCTE | 25mm diameter, 0,2µm pore size |
| Polyscintillation vials | Perkin Elmer | WHA1825047 | 20ml |
| sample tubes | Sigma Aldrich | T2318-500EA | Greiner centrifuge tubes, 50ml |
| Spectrophotometer | Hitachi | NA | Model U2001, any photometer for absorption spectroscopy measuring at 664nm and 750nm would be appropriate |
| trichloric acetic acid (TCA) | Merck | T6399 | 100% |
| ultrasonic probe | nano lab | QS1T-2 |
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