Summary
저온권의 탄소 플럭스는 아직 거의 평가되지 않지만 기후 변화와 관련하여 매우 중요합니다. 여기서 우리는 레이저 유도 형광 방출 (L.I.F.E.) 기술에서 높은 스펙트럼 및 공간 해상도 데이터를 제공하는 초위 환경에서 광영양 잠재력을 포착하는 새로운 프로토 타입 장치를 보여줍니다.
Abstract
지구 온난화는 다양한 생태계, 특히 극저온 서식지의 미생물 공동체에 영향을 미칩니다. 그러나, 극한 환경에서 미생물 매개 탄소 플럭스에 대해서는 거의 알려져 있지 않습니다. 따라서, 사용 가능한 극소수의 연구에서 설명된 샘플 수집 방법론은 두 가지 주요 문제를 의미합니다: A) 고해상도 데이터는 원격 지역에서 얻기 어려운 많은 수의 샘플을 필요로 합니다. B) 얼음 코어의 절단, 톱짐 및 용융과 같은 피할 수 없는 시료 조작은 그 결과 의상으로 이어진다. 이 연구에서는 시료 전처리나 시료 파괴가 필요하지 않은 프로토타입 장치가 제공됩니다. 이 장치는 육상 및 얼음 생태계에서 높은 스펙트럼 및 공간 해상도를 가진 시투 측정에 사용될 수 있으며 Laser-I nduced Fluorescence E미션(L.I.F.E.)기술을 기반으로 합니다. 광사성 상구체 커뮤니티는 광안소에서 L.I.F.E. 시그니처를 검출하여 식별할 수 있습니다. 포르피린 유도체에 대한 L.I.F.E. 계측기 교정은 엽록소a(chl a)(405 nm 레이저 여기) 및 B-피코에리트린(B-PE) (532 nm 레이저 여기)을 입증하였다. 이 방법론의 검증을 위해, L.I.F.E. 데이터는 안료 추출 및 후속 흡수 분광법을 수반하는 정량화를 chl에 대한 기존의 방법에 의해 비준되었다. 현장에서프로토타입의 적용성은 극한의 극지 환경에서 입증되었습니다. 모로코 디저트와 오스트리아 바위 빙하에서 화성 아날로그 시뮬레이션을 통해 육상 서식지에 대한 추가 테스트가 진행되었습니다. L.I.F.E. 계측기는 허용 가능한 운영 물류를 통해 넓은 지역의 고해상도 스캔을 가능하게 하며, 글로벌 변화의 맥락에서 상류 층 공동체의 생태적 잠재력을 더 잘 이해하는 데 기여합니다.
Introduction
저온 구는 바다 얼음, 빙하, 높은 산악 호수, 눈 지역, 호수 얼음, 용융 물 스트림 및 퍼머 프로스트를 항구. 이 지역은 지구의 대지1,2의 약 11 %를 커버하고 인식 극저온 환경으로 대기에 의해 중압된다. 최근 연구에 따르면 극저온의 거대한 지역이3,4. 남극5,6,알프스7,북극8및 기타 지역은 마이너스 얼음 질량 균형을 보여줍니다. 얼음 모자와 빙하의 후퇴는 지구상에서 가장 큰 담수 저수지의 고갈로 이어집니다. 일부 지역에서는 빙하 휴양지가 멈출 수 없는5.
오랫동안 얼음 생태계는 멸균 환경으로 간주되었습니다. 그러나 가혹한 조건에도 불구하고 지구의 극저온권에서 활동적인 생명체의 존재는 분명9,10, 11,12,13,14,15 . 용융에 의한 얼음의 엄청난 손실로 인해, 저온구는 인접 한 서식지에 영향을 미치는 생물학적 활동의 변화를 겪고있다. 부분적으로 돌이킬 수없는 변화를 이해하려면 높은 공간 및 시간적 해상도로 상태 조건 하에서 얼음의 생물학적 활동을 조사하는 방법이 필요합니다.
초월적 환경에서는 극저온 구멍, 눈 덮개, 녹은 물, 개울, 맨 얼음 표면에서 생명을 찾을 수 있습니다. 그러나, 가장 명백한 상분 서식지는 극저온 구멍입니다. 그들은 빙하 환경에서 전 세계적으로 나타나며 1870 년대16,17에서그린란드로 의 원정 중에 스웨덴 탐험가 아돌프 에릭 노르덴스크요드 (Adolf Erik Nordenskjold)에 의해 처음 묘사되었습니다. 이름은 그리스어 단어 "kryos"(차가운)와 "코니아"(먼지)에서 유래했습니다. Aeolian 유래 의 어두운 유기 및 무기 파편은 얼음 표면에 부착하고 알베도국부적으로 감소시다. 태양 복사는 파편이 더 깊은 얼음 층으로 녹는 것을 촉진하여 바닥9에퇴적물 (극저온)으로 원통형 분지를 형성합니다. 극저온 구멍은 빙하 절제 구역11의0.1-10 %를 커버합니다.
Cryoconite 지역 사회는 바이러스, 곰팡이, 박테리아, 시아노박테리아, 미세 조류 및 원생 동물로 구성됩니다. 지역에 따라 로테이퍼, 선충, 코포드, 타디그레이드 및 곤충 유충과 같은 메타조안 생물도 발견할 수 있습니다. 에드워즈와 다른18 "얼음 차가운 핫스팟"으로 극저온 구멍을 설명합니다. 그(것)들은 또한 N, Fe, S 및 P 사이클링에 책임 있는 극저온 구멍에 있는 기능적인 유전자를 추적했습니다. 미니 호수 생태계는 훨씬 더 따뜻하고 영양이 풍부한 서식지11에서발견되는 속도로 호흡하고 photoynthesize. 이 사실 인정은 상분 환경에서 미생물 격리의 중요한 역할을 강조합니다. 극저온 구멍에 있는 살아있는 공동체 외에도 얼음 표면은 얼음 조류가 살고 있습니다. 그들의 생리학은 잘 공부19 그러나 그들의 공간 분포는 평가되지 않았습니다20. 상복부 환경에서의 그들의 존재는 알베도를 감소시키고 따라서 하류 서식지로 영양 과다 세척 및 영양 입력으로 이어지는 용융을 촉진9. 온도가 증가하면 액체 물의 가용성이 높아지므로 이러한 얼음 생태계의 순 생태계 생산성에 영향을 미칩니다.
초상적 환경에서, 광합성 활성 유기체는 무기 탄소와 질소를 유기로 변환, 미생물 식품 웹에 사용할 수있는 소스21,22. 지금까지 는 상피 탄소 플럭스를 추정하는 몇 가지 연구가 있다11,20,23. 탄소 플럭스의 제안된 비율의 불일치는 낮은 공간 및 시간적 데이터 분해능으로 인해 발생합니다. 또한, 극저온 구멍 외부의 상분 공동체의 공간 분포는 거의 평가되지 않습니다. 쿡과 다른20명은 그들의 모델에서 상복부 조류 공동체가 큰 표면 커버리지로 인해 현대의 극저온 구멍보다 최대 11배 더 많은 탄소를 고칠 것이라고 예측했다. 시료 무결성을 확보하는 상구 조류 커뮤니티의 검출은 여전히 내부 검출 및 정량화를 위한 도구가 누락되어 방해받고 있습니다.
물류의 어려움에 대응하여, 온대 지역의 서식지보다 얼음 생태계가 덜 자주 연구됩니다. 데이터 해상도는 평가된 샘플 수에 따라 다르며 연구 사이트의 접근성에 따라 달라집니다. 톱질, 코어링 및 후속 용융과 같은 표준 샘플링 방법은 미생물 커뮤니티의 조작을 포함합니다. 예를 들어, 고체 얼음 시료에서의 엽록소 a(chla)평가는 실질적인 간섭 없이 표준 방법으로는 불가능하다. 따라서, 조사된 미생물 군내의 용융 유도 온도 변화는 피할 수 없다. 심령혈증22의포토 시스템 II 및 기타 세포 구조의 열가능성에 대한 응답으로, 용융 된 얼음 샘플의 실험실 분석은 항상 상태 조건의 위조로 이어질 것입니다.
비파괴적 인 비파괴는 신뢰할 수있는 데이터를 얻을 수있는 유일한 합리적인 방법입니다. 이 목표는 형광 기반 방법을 사용하여 달성 될 수있다. 그들의 빛 수확 기능으로 인해, chla와 B-phycoerythrin (B-PE)는 Anesio 및 기타11에의해 입증 된 바와 같이, 초월 환경에서 탄소 주기에 기여하는 유기체에 존재한다. 따라서, 이러한 형광 분자는 얼음 생태계에서 미생물 매개 탄소 플럭스의 정량화를 위한 적합한 바이오마커이다.
이 연구에서는, 우리는 지구와 얼음 생태계에 있는 chla 및 B-PE 분자의 계량 정량화에 있는 새로운 비침범성 공구의 개발, 보정 및 적용성을 제시합니다. 프로토타입 장치는 L.I.F.E라고도 하는 레이저 유도 형광 방출을 기반으로 합니다. 광학기기(그림 1)는레이저 유도 형광 여기 후에 형광 바이오마커 서명을 캡처합니다. 절차는 비파괴적이며 연구 현장이나 실험실에서 수행 할 수 있습니다.
그림 1: L.I.F.E. 프로토타입. 왼쪽: 보호 뚜껑이없는 기기의 사진. 오른쪽: 악기의 개략적 그림. 총 질량 = 5.4 kg (레이저 및 광학 = 4.025 kg, 노트북 = 1.37 kg). 알루미늄 프레임 = 32.5 cm x 20.3 cm x 6.5 cm. 광학 튜브 : 18.4 cm x 4cm (직경). CCD : 블루 폭스 mv220g 센서; F: 서보 스티어링 롱 패스 필터 (450 nm 및 550 nm); L: 광학 렌즈; M1: 거울; M2: 이색 거울; MC: 마이크로 컨트롤러; P: 프리즘; PBS: 편광 빔 스플리터; S: 조절 가능한 면도날로 만든 슬릿 조리개. 배율 표시줄 = 70mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
휴대용 듀얼 파장 키트의 무게는 4.5kg이며 외부 컴퓨터와 함께 삼각대에 사용됩니다. 필드 설정은 빠르고 쉽습니다. 계측기는 삼각대에 부착되고 렌즈 튜브는 USB 케이블 및 카메라 케이블과 함께 장치에 부착됩니다. 외부 컴퓨터는 USB 케이블을 사용하여 기기에 연결됩니다. 삼각대 다리는 렌즈 튜브가 시편을 향하고 덮는 방식으로 조정됩니다. 그런 다음 5mW 녹색 레이저가 편광 빔 스플리터를 통과한 후 분광계의 광축을 향해 편광광을 전달한 후 시료에 충돌합니다. 시편은 그림 1에빨간색으로 표시된 형광등을 나타낸다. 시준된 빛의 절반은 편광 빔 스플리터를 통과하며 레이저 신호를 제거하는 서보 스티어링 롱 패스 필터를 통해 초점을 맞습니다. 다음으로, 신호는 두 개의 조정 가능한 면도날로 구성된 조리개 슬릿에 부딪힙습니다. 프리즘은 센서에 의해 신호가 포착되기 전에 빛 직교의 미세 한 선을 슬릿 조리개로 분광합니다. 절차는 파란색 레이저로 반복됩니다. 원시 데이터는 소프트웨어 작업에도 사용되는 휴대용 컴퓨터로 자동으로 전송됩니다.
이 계측기는 CCD 카메라와 사진 촬영, 레이저 켜기/끄기 전환 및 긴 패스 필터 휠 회전을 동기화하는 LabVIEW 환경을 사용하여 외부 컴퓨터에 의해 제어됩니다. 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)는 세 가지 주요 섹션으로 나뉩니다. 노출 조정은 수동으로 수행됩니다. 노출 시간과 신호 강도 사이의 보정은선형(도 2B)이지만,최대 노출 시간은 통합 시간이 길어신호 대 잡음 비의 현저한 감소를 초래하기 때문에 10s로 제한된다. 주석 필드는 샘플의 설명에 사용됩니다(그림2A). 오른쪽 섹션에서는 측정이 완료되는 즉시 원시 이미지가 표시됩니다. 이 기능은 현장에서 즉각적인 데이터 평가에 매우중요합니다(그림 2C-E). 빨간색 영역은 노출 시간을 줄여 피할 수 있는 과다 노출 픽셀을 나타냅니다.
후속 원시 데이터 감소 프로세스는 이미지 수집 절차에서 분리되며 이미지 수집 후 언제든지 수행할 수 있습니다.
그림 2: 데이터 수집 및 원시 데이터 평가를 위한 L.I.F.E. 그래픽 사용자 인터페이스. (A)샘플 설명에 대한 수동 텍스트 입력을 가능하게 하는 소프트웨어입니다. (B)측정 전에 노출 시간을 조정할 수 있습니다. (C-E) 원시 이미지는 인터페이스의 오른쪽에 표시됩니다. (E)빨간색은 센서의 채도를 나타냅니다. (F) RUN MEASUREMENT 버튼의 활성화는 데이터 수집 프로세스를 트리거합니다. 배열(G)에서데이터 수집 중에 자동으로 실행되는 모든 명령이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 원시 이미지의 예입니다. 왼쪽: L.I.F.E 계측기와 함께 기록된 아세톤 용액의 표준chl의 원시 데이터. 장치의 광학적 특성으로 인해 신호가 뒤틀린 선으로 표시됩니다. 오른쪽: 픽셀당 원시 이미지 해석(px). 스펙트럼 축(5nm/px 해상도)은 공간 축(30 μm/px 해상도)에 대해 플롯됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
12비트 그레이 스케일 원시 이미지는 CCD 앞의 프리즘으로 인한 1차원 조리개 슬릿 및 스펙트럼 성분으로 인한 공간 구성 요소를보여줍니다(그림 3). 광학적 제약조건에 대응하여 원시 이미지가 왜곡됩니다. 따라서 왜곡 정도를 인식하는 코드를 적용하여 잘라내고 왜곡해야 합니다. 이 작업은 소프트웨어마법사(그림 4)로수행됩니다. 다음으로, 파장 교정은 532 nm 레이저로 수행된다. 녹색 광은 1,064 nm 적외선 레이저의 주파수 두 배에 의해 생성됩니다. 두 파장 모두 CCD에 의해 검출될 수 있으므로, 각 픽셀의 스펙트럼 위치는 왜곡된 이미지에서 자동으로 계산될 수있다(도 4).
그런 다음 그림은 지정된 파장 범위(녹색 레이저 측정의 경우 550-1,000nm, 청색 레이저 측정의 경우 400-1,000nm)로 자른다. 선택한 픽셀 선의 각 픽셀의 회색 값이 계산되고 합산됩니다. 회색 값의 범위는 0-255입니다. 그 후 모든 픽셀 선은 하나의 숫자를 차지합니다. 또한 화면상의 소프트웨어 지침에 따라 공간 좌표에 대해 플롯된 각 픽셀 선의 회색 값 개수를 표시하는 플롯이 생성됩니다. 이를 통해 샘플에서 chla 및 B-PE의 정량적 공간 적 판적 판적 판별이 가능합니다. 또한 선택한 픽셀 선에서 샘플의 스펙트럼 속성을 자동으로 플롯할 수 있습니다.
그림 4: 원시 이미지를 왜곡합니다. 왼쪽: 녹색 레이저로 캡처한 원시 이미지입니다. 필터가 사용되지 않았습니다. 신호는 532 nm 및 1,064 nm에 표시됩니다. 노출 시간 = 0.015 s. 센터: 자른 532 nm 신호는 이미지 세트를 탈문하기 위한 기준선으로 사용됩니다. 오른쪽: 원시 이미지 소스에서 왜곡된 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
1. 교정 및 검증
참고: 안료 교정을 위해 chla 및 B-PE의 재고 용액에서 희석 행을 준비하십시오. chl 스톡 용액은 아세톤으로 희석되고 B-PE는 증류수로 희석됩니다. 나중에 각 희석 단계의 15 mL이 필요합니다. 알루미늄 호일로 싸서 빛으로부터 안료를 보호하십시오. 더 많이 사용할 때까지 chla를 냉동고와 B-PE에 냉장고에 보관하십시오. 희석 행에 대한 자세한 프로토콜은 chla에 대한 섹션 1.1 및 B-PE에 대한 1.2에 따릅니다. L.I.F.E. 기기를 사용하여 안료 검출 및 정량화를 위한 chla 및 B-PE 실험실 교정은 모두 아래에 설명되어 있습니다. 이전캘리브레이션(24)은 본 연구에서와 동일한 안료로 만들어졌다.
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희석 행 엽록소
- 50 mL 샘플 튜브에 아세톤으로 chla (A. nidulans 조류로부터 정제)의 1 mg을 용해하고 다음과 같은 최종 농도에 아세톤이chl 주식 용액을 희석 : 1,000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10; 5; 1; 및 0.5 ng/mL.
- 각 희석액의 15mL를 50mL 샘플 튜브로 옮기고 빛 민감성으로 인해 알루미늄 호일에 덮습니다. 교정 측정이 수행될 때까지 튜브를 -20°C 냉동고에 보관하십시오.
참고: 프로토콜은 여기에서 중단될 수 있습니다. - 이중 빔 분광광도계에서 각 희석으로부터의chl 흡수 특징을 삼중광으로 측정하고 로렌젠25에의해 설명된 바와 같이 chl함량을 계산하며, 이는 섹션 2.2.2에서 자세히 설명될 것이다.
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PE 희석 행
- 멸균 여과수(pH =7)로 4 mg/mL B-PE 스톡 용액을 다음 최종 농도로 희석: 1,000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10; 및 5 ng / mL B-PE. 50 mL 샘플 튜브에 각 희석의 15 mL을 전송하고 알루미늄 호일로 덮습니다. 추가 사용이 될 때까지 4°C에서 보관하십시오.
참고: 프로토콜은 여기에서 중단될 수 있습니다.
- 멸균 여과수(pH =7)로 4 mg/mL B-PE 스톡 용액을 다음 최종 농도로 희석: 1,000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10; 및 5 ng / mL B-PE. 50 mL 샘플 튜브에 각 희석의 15 mL을 전송하고 알루미늄 호일로 덮습니다. 추가 사용이 될 때까지 4°C에서 보관하십시오.
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교정을 위한 설정
- 그림 5와 같이 랙을 구축하여 각각 다음 측정 플랫폼보다 1.5cm 더 높은 세 개의 측정 플랫폼을 구축합니다.
참고: 랙 및 컬럼 높이는 그림 5에표시된 대로 액체 표면이 L.I.F.E. 계측기의 초점에 남아 있어야 하기 때문에 측정에 중요한 역할을 합니다. - 다각형 플라스틱 바이알에 가장 높은 농축 희석제 5mL를 넣고 랙의 가장 높은 지점에 놓습니다. 형광 강도를 측정합니다.
- 바이알을 랙의 중간 위치에 놓고 5mL(총 부피 10mL)를 추가합니다. 형광 강도를 측정합니다. 다른 5mL(총 부피 15mL, 컬럼 높이 총 45mm)로 랙에서 가장 낮은 위치에서 절차를 반복합니다.
참고: 각 희석 단계의 노출 시간을 조정하여 검출기 포화(12비트 이미지에서 255개 이상의 회색 값)를 방지하고 약한 형광 신호의 충분한 신호 대 잡음 비를 위해 조정합니다. - 1.3.2 단계와 1.3.3단계를 chla 및 B-PE의 모든 희석(단계 1.1.1 및 1.2.1단계)으로 반복합니다.
- 생성된 데이터 파일을 데이터 감소 마법사에 로드하여 Y축(공간 분포)을 따라 각 픽셀 선의 회색 값을 자동으로 계산하고 합산합니다.
참고: 다양한 노출 시간은 형광 강도를 1초의 통합 시간으로 정규화하여 자동으로 보정됩니다. - 희석 계열의 공지된 농도와 계산된 정규화된 형광 강도를 사용하여 푸아송 회귀 분석을 사용하여 안료 영역 밀도를 계산합니다. 그런 다음 각 컬럼 높이의 카운트를 요인(5 mL, 10 mL 및 15 mL 농도 용액에 대해 각각 1, 0.5 및 0.33)으로 곱하여 세 개의 서로 다른 컬럼 높이에서 형광 수를 1.5 cm(5mL)로 정규화합니다.
- 그림 5와 같이 랙을 구축하여 각각 다음 측정 플랫폼보다 1.5cm 더 높은 세 개의 측정 플랫폼을 구축합니다.
그림 5: 실험실 조건에서 chla 및 B-PE를 통한 L.I.F.E. 교정을 위한 설정.
(A)기기의 렌즈 튜브. (B)B-PE 여기를 위한 녹색 레이저. (C)청색 레이저로여기를 합니다. (D)신틸레이션 바이알. (E)L.I.F.E. 계측기의 초점. (F)B-PE/물 또는 5 mL, 10 mL 및 15 mL의/아세톤 용액을 chl. (G)세 가지 다른 볼륨에 대한 초점 평면에 각 솔루션의 표면을 유지하는 스페이서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 샘플링 및 샘플 처리
- 눈과 얼음의 컬렉션
- 빙하에서 눈과 초월 얼음을 멸균 폴리에틸렌 백에 넣고 추가 가공이 될 때까지 냉동 보관하십시오.
참고: 이 연구를 위해, 샘플은 스발바르의 높은 북극 군도(78°53'N, 12°03'E)의 연구 마을 Ny-Ålesund 근처의 폴리열 빙하인 미드트레 러벤브린(MLB)에서 수집되었습니다. - 빙하 전경에서 멸균 폴리에틸렌 백으로 세균 매트를 샘플링하고 모든 샘플을 실험실로 운반하여 추가 처리를 합니다.
- 4 °C에서 어둠 속에서 천천히 냉동 물질을 녹인다. GF/F 필터(직경 47mm)에서 액체 샘플을 걸러내고 여과된 부피를 기록합니다. 추가 처리가 될 때까지 필터를 고정상태로 보관하십시오.
- 빙하에서 눈과 초월 얼음을 멸균 폴리에틸렌 백에 넣고 추가 가공이 될 때까지 냉동 보관하십시오.
- 엽록소측정
- L.I.F.E. 계측기를 사용하여 녹색 및 파란색 레이저를 사용하여 각각 4개의 임의 영역에서 필터를 측정합니다. 영역 밀도에 여과된 면적 및 여과 된 부피를 곱하여 전체 안료 농도를 계산합니다. 안료 농도(μg/L)를 1L의 부피로 정상화합니다.
- 로렌젠25의프로토콜에 따라 실험실 표준으로 GF/F 필터의함량을 평가한다. 이렇게 하려면 각 필터를 13 mL의 아세톤으로 바이알에 넣고 밤새 4 °C에서 어둠 속에서 보관하십시오. 다음으로, 바이알을 가지고 연속 모드에서 50 %의 힘으로 2 분 동안 초음파 처리 전에 얼음에 놓습니다. 바이알에서 필터를 짜서 제거합니다.
- 주사기에 타이곤 튜브를 부착하고 유리병에서추출 - 아세톤 믹스를 chl을 제거합니다. 타이곤 튜브를 GF-5 필터 홀더로 교체합니다. 용액을 쿼츠 큐벳으로 옮김.
- 아세톤에 대한 흡광도 분광계를 보정한 후 샘플을 큐벳에 분광계에 넣고 400-750 nm 사이의 흡광도 특징을 측정합니다. 다음으로 분광계에서 큐벳을 제거하고 샘플에 2M HCl의 200 μL을 추가합니다. 이어서, 흡광도 측정을 반복하여 샘플내의 페오피틴 함량을 측정한다.
- 방사성 표지마커를 통한 미생물 활동 측정 및 레이저 강도 및 노출 시간이 생산성 비율에 미치는 영향
주의: 마커 방사능(β-방사선)을 조심하십시오. 실험실 코트, 장갑 및 고글을 사용하고 허가된 동위원소 실험실에서 연기 후드 아래에서 작업하십시오.- 세균 생산을 위해 세균 매트의 5 개의 알리쿼트를 멸균 폴리에틸렌 백으로 옮김을 옮김을 넣습니다. 포름알데히드와 제어를 4% 최종 농도로 비활성화합니다.
참고: 3개의 aliquots는 3개의H 표지된 류신 섭취에 사용되고 2개의 aliquots는 대조군으로 이용됩니다. - 파란색 레이저(405nm, 5mW)와 녹색 레이저(532nm, 5mW)를 각각 10s및 30s로 노출합니다. 50mW 레이저로 절차를 반복하십시오. 이어서, 포름알데히드로 처리되지 않은 샘플을 비활성화하였다.
참고: 하나의 매트는 하나의 레이저 노출에만 사용됩니다. 노출되지 않은 미생물 매트를 컨트롤로 사용합니다. - 레이저 처리 후, 각각 3H-류신 및 NaH14CO3을통합하여 세균 및 1차 생산을 추정한다. 세균 생산 측정의 경우, 샘플당 5개의 aliquots(20 mL)를 사용하고 마커의 비생물성 혼입에 대한 제어 역할을 하는 두 개의 평행선에 포르말린(4% 최종 농도)을 추가합니다. 다양한 치료법의 모든 샘플에 3H-류신 (40 nM)을 추가하고 4 시간 동안 인큐베이션하여 시류 조건 (0.1 °C)에서 배양하십시오. 나머지 라이브 샘플에 포르말린을 추가하여 반응을 종료합니다.
- 세균 성 매트의 세균 성 생산을 위해, 극저온으로 라벨 샘플을 전송합니다. Kirchman26 및 Bell27에의한 프로토콜에 따라 5% 트리클로로아세트산 및 원심분리기를 10,000 x g에서 5분 동안 추출합니다. 섬광 액체를 추가하고 다각성 바이알에 저온을 넣습니다. 액체 침전 카운터로 샘플을 분석하고 섭취량을 계산합니다.
참고 : 3 개의 aliquots는 3H 라벨이 붙은 류신 섭취에 사용되며, 두 개의 aliquots가 컨트롤로 사용됩니다. - 1차 생산을 위해 다양한 처리(100 mL)의 5가지 복제본을 준비하고, 그 중 2개를 알루미늄 호일에 싸서 어두운 샘플을 모방하고 NaH14CO3(1 μCi)을 모두 추가합니다. 주변 광원 과 체염 온도 (0.1 °C)에서 4 시간 동안 배양하십시오. 나머지 3개의 복제를 어둡게 하여 반응을 종료하고 샘플을 GF/F 필터(직경 25mm)로 필터링합니다.
- 필터에 100 μL의 2 N HCl을 추가하여 여분의 탄소를 모두 제거하고 연기 후드 아래에서 공기를 배출하십시오. 80 °C에서 가열 플레이트에 샘플을 건조하고 다각형 바이알에 샘플을 배치합니다.
- 1차 및 세균 생산의 모든 치료법의 분당 방사성 분해(dpm)를 측정하려면 저온 을 다각화 바이알에 넣고 5 mL의 섬광 칵테일을 추가하십시오. 액체 침전 카운터로 dpm을 측정하고 섭취량을 계산합니다.
- 세균 생산을 위해 세균 매트의 5 개의 알리쿼트를 멸균 폴리에틸렌 백으로 옮김을 옮김을 넣습니다. 포름알데히드와 제어를 4% 최종 농도로 비활성화합니다.
Representative Results
B-PE용 실험실 교정
B-PE 희석 행의 응답 신호를 20°C에서 어두운 방에서 L.I.F.E. 계측기로 측정하였다(도6). 카운트 속도는 측정된 샘플의 농도와 컬럼 높이 모두에 따라 달라집니다. 낮은 농도와 낮은 컬럼 높이 B-PE 시편은 동일한 농도와 더 높은 컬럼 높이의 샘플에 비해 더 강하게 형광되었습니다.
그림 6: B-PE 실험실 교정. B-PE 함량 및 컬럼 밀도 교정이 도시되어 있습니다. 정규화된 개수 율은 1.5cm의 열 높이에 대해계산되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
푸아송 회귀는 최종 교정 라인 맞춤에 사용되었습니다. 영역 밀도와 픽셀 회색 값 개수 사이에 선형 상관 관계가 있었습니다. 곡선의 함수는 y = 81.04x(도7)였으며,이는 1s 노출 샘플에서 8,104의 회색 값 카운트 율이 100 ng/cm2 B-PE의 영역 밀도와 동일하다는 것을 의미한다. chl 교정은 아날로그 방식으로 설정됩니다. 함수는 y = 8.94x였습니다.
그림 7: B-PE에 대한 최종 교정 곡선. 회색 값 카운트는 노출 시간 1s로 정규화되고 영역 밀도에 대해 플롯되었습니다. 사용 권한 으로 전재28. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
스발바르의 저온염 시료 및 데이터 실험실 검증에 적용
L.I.F.E. 측정값과 아세톤을 이용한 종래의 추출에서 파생된 동일한 샘플의 단일 측정값및 분광광도계를 이용한 후속 분석이 도 8에예시되어 있다.
그림 8: 자연 샘플을 통한 데이터 유효성 검사. 샘플(MLB)은 실험실 분광광도계(단일 값)의 결과에 따라chl 함량에 의해 순위가 매겨지고 필터당 4개의 무작위 영역에서 측정된형광 데이터를 chl과 비교합니다. 오차 막대는 L.I.F.E. 측정값의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Chl48 μg/L-67 μg/L에 이르는 함량은 과소 평가되었고, L.I.F.E. 프로토타입에 의해 0.7 μg/L-7 μg/L에 이르는함량을 과대 평가했습니다. L.I.F.E. 측정값의 표준 편차는 낮았습니다.
실험실 표준과 의 situ 측정에서 스펙트럼 데이터의 비교
Chla 스펙트럼은 극저온 샘플과 A. 니둘란스 조류로부터 정제된 샘플 사이에 비교되었다. 모든 샘플에서 형광 피크는 700 nm-710 nm에 위치하였다. 그러나, 극저온 샘플에서 유래된 스펙트럼은 400 nm-650 nm 과 800 nm-1,000 nm 에서 더 높은 잡음 신호를보여주었다.
그림 9: 스펙트럼 데이터 해석. 405 nm 레이저로 여기 후 4 개의 저온 과립 (파란색) 및chl 표준 안료 용액 (빨간색)의 측정. 스펙트럼은 샘플 수집 후 1년 후에 기록되었다. 시료는 동결된 채 보관되었고 측정 전에 빛에 노출되지 않았습니다. 파장 교정 문제에 대응하여 형광 피크는 680 nm 대신 700 nm-710 nm에 위치합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
자동 저온 염곡물 분석
극저온 구멍의 자동 분석의 예에서(도10),가장 높은 안료 영역 밀도는 픽셀 라인 50에서 관찰되었다. 532 nm 레이저로 여기한 후 샘플 스펙트럼은 센서의 과포화에 대한 응답으로 255의 회색 값으로 차단된 피크를 보였다. 이 피크는 형광 신호가 아닌 녹색 레이저에서 파생됩니다.
그림 10: 직경 1mm의 단일 저온 과립의 자동화된 데이터 분석. 샘플은 베스레 Brøggerbreen (VBB)에서 수집하고 Ny-Ålesund에있는 북극 역 (GB) 시설의 어두운 실험실 방에서 샘플링 한 후 4 시간 이내에 측정되었습니다. 왼쪽 열은 B-PE 측정값을 표시하고 오른쪽 열은chl 데이터를 나타냅니다. 원시 이미지가 맨 위에 표시됩니다. 레이저 유도 형광 반응은 회색으로 표시됩니다. 빨간색 영역은 표준 안료의 반응을 나타냅니다. 중간 섹션은 대상 안료의 공간 분포를 도시한다. 형광 신호의 스펙트럼 특성은 하부 이미지에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
세균 매트의 생산성에 레이저 여기의 영향
레이저 및/또는 노출 시간의 전력을 증가시킬 때 1차 및 세균 생산성은 영향을 받지않았다(그림 11). 레이저 치료 에서 증가 된 전력으로 유의 한 차이가 검출 되지 않았습니다.
그림 11: 스발바르 의 시료의 생산성 측정. 세균성 매트는 다양한 레이저 강도 및 노출 시간의 녹색 및 파란색 레이저로 노출되었습니다. 데이터는 레이저 파장 소스(녹색 및 파란색)에 따라 색상이 지정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
교정
광자 수를 1초의 노출 시간으로 정상화한 후 안료 농도와 형광 강도 사이의 선형 상관관계가 있었다. 동일한 안료 농도를 가진 더 높은 열 높이에 비해. 또한, 약한 형광 신호는 센서에 충분한 광자 카운트를 위해 긴 노출 시간이 필요했습니다. 그러나 통합 시간이 길어센서의 미광량도 증가하여 신호 대 잡음 비율이 감소합니다. 현재 버전에서 소프트웨어는 데이터 감소 과정에서 노이즈와 신호를 구분할 수 없습니다. 따라서, 낮은 형광 강도 측정은 잡음이 표적 안료로부터 유래된 신호로 계산되었기 때문에 안료 과대 평가로 이어졌다. 또한, 보다 농축된 안료 용액으로부터의 형광 강도는 저농도 용액보다 더 큰 가변성을 보였다. 이 효과는 교정 곡선에 사용된 안료 용액 내의 흡수 공정에 의해 설명될 수 있습니다.
엽록소 정량화를 위한 데이터 검증
얼음과 눈 샘플을 여과한 후, 3차원 샘플은 거의 필터에 2차원 표본으로 나타났습니다. 이는 L.I.F.E(면적 밀도)와 분광광도 데이터(체적 측정) 간의 직접적인 비교를 정당화했습니다.
데이터세트(도 8)는높은 안료 농도가 과소 평가로 이어지는 반면, 낮은 안료 농도는 실제 값의 과대 평가로 이어진다는 것을 나타냈다. 이 효과는 필터 케이크의 두께에 의해 설명 될 수있다 따라서, 샘플의 체적 문자. 레이저 침투 깊이는 시편의 광학 밀도 및 두께에 따라 달라집니다. 높은 안료 함량은 레이저가 더 깊은 층에서 안료 형광을 유도할 수 없기 때문에 과소 평가되었다. 그러나 얇은 필터 케이크에서는 안료의 낮은 영역 밀도로 인해 낮은 형광 신호가 캡처되었습니다. 명백하게, 필터 자체는 450 nm 롱 패스 필터를 통과한 후 레이저 유도 신호를 나타내보였다(도12). 이 신호는 chla에서파생된 형광 신호로 오해의 소지가 있습니다. 따라서 얇고 너무 두꺼운 필터 케이크는 L.I.F.E. 계측기로 측정하기가 어렵습니다.
그림 12: GF/F 필터에서 두꺼운(A) 및 얇은(B) 필터 케이크의 형광 신호. (A)자체 가광은 레이저로 유도된 형광을 더 깊은 층으로부터 방지하여 실제 안료 농도를 과소평가합니다. (B)필터 반사에 의한 오버레이필터 케이크의 형광 방출. (C)원시 데이터는 필터 반사(회색)를 표시합니다. 형광 패턴을 유래한 실험실 유래의 스펙트럼 특성은 적색으로 예시된다. 배율 표시줄 = 45mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
L.I.F.E. 프로토타입의 한계
데이터 감소 동안 MATLAB 코딩 소프트웨어는 지정된 파장 범위 내에서 픽셀 선을 합산하여 원시 이미지를 해석했습니다. 소프트웨어의 현재 버전은 유기 및 무기 유래 신호를 구별하지 않았다. 다중 신호의 존재는 실제 안료 내용의 과대 평가로 이끌어 낼 수 있습니다. 낮은 형광 강도로 인한 긴 노출 시간은 신호 대 잡음 비의 감소로 이어졌으며, 전술한 바와 같이 효과를 촉진하였다(도 8 및 도 12참조).
그림 13에 나타난 지오드 암석은 녹색과 청색광으로 노출되었을 때 적색 형광등을 나타냈다. 현재, 형광이 광물또는 포르피린 계 분자에서 유래했는지 여부는 분명하지 않다. 따라서 생물학적 및 비생물학적 신호의 오버레이는 이 방법의 적용을 제한하고 L.I.F.E. 프로토타입을 위해 특별히 만들어진 형광 데이터베이스의 확립을 요구할 수 있습니다.
그림 13: 니-올레순드에서 발견된 지오드 암석의 광물 형광. 바위는 532 nm 50 mW 레이저(A)와405 nm 50 mW 레이저(B)로흥분했다. 두 사진 모두 렌즈에 부착된 편광 필터로 캡처되어 실제 형광 색상을 위조했습니다. (C)일광 조건에서 편광 필터를 사용하지 않고 진정한 색상 이미지. 배율 표시줄 = 40mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Beutler 와 다른사람 29 해양 생태계에서 시아노 박테리아의 특성 방출 스펙트럼 환경 조건에 따라 달라 집니다 결론을 내렸다. 또한, 대사 상태는 광영양유기체(30)의형광 특성에 영향을 미친다. L.I.F.E 계측기는 환경 조건과 상관관계가 있는 시편의 스펙트럼 정보를 포함하는 생체 지문 라이브러리를 사용하여 조류 및 시아노박테리아 형광 패턴을 구별할 수 있습니다.
어두운 적응 chl분자에서, 모든 반응 센터는 완전히 산화되고 광화학에 유효하며 형광 수율은31을담금질되지 않습니다. L.I.F.E. 절차를 사용하여, 견본은 먼저 532 nm 레이저 (녹색)에 의해 흥분되고 그 다음 405 nm 레이저 (청색). 청색 레이저에 의한 두 번째 여기 동안, chla는 녹색 레이저에 의한 사전 흥분으로 인한 형광 반응 감소를 나타낼 수 있다. Chla는 흡수 최대 파장32에서의거리에도 불구하고 532 nm 파장에서 에너지를 흡수합니다. 405 nm에서 실제chl 측정 하기 전에, 녹색 레이저 광 화학 반응을 일으킬 수 있습니다., 대상 안료에 담 금 질 메커니즘을 활성화. 또한, 해양 광영양 생물의 사전 조명은 450 nm-600 nm 사이의 스펙트럼 규범 곡선의 변화를 유도하지 않았으며 형광 강도의 표준 편차는 25%29%증가하였다. 종에 따라, 형광 강도도 이전 흥분에 대한 응답으로 증가. 이 항목에서는 추가 조사가 필요합니다.
적용
우리는 극저온 구멍에 중점을 두고 다양한 서식지에서 L.I.F.E. 장비를 테스트했습니다. 레이저는 측정 중에 주변 광이 없기 때문에 토양 및 생물막 서식지에 성공적으로 적용되었습니다. 극저온 과립은 침전층이 구멍 아래에서 빛을 차단할 때 측정될 수있습니다(도 14A,C). 얇은 퇴적물 극저온 구멍은 아래에서 길 잃은 빛에 투과되었다(그림 14B). 미광이 측정을 방해합니다. 따라서, 베어 얼음 표면의 안료 농도는 아직 일광 조건에서 측정할 수 없습니다. 신호 처리 노력은 현재 높은 주변 광 조건에서 시스템의 작동을 가능하게하기 위해 진행되고있다.
그림 14: 위에 액체 물이 있는 극저온 구멍. (A)L.I.F.E. 렌즈 튜브를 가진 빙하에 극저온. 스케일 바 = 70mm.(B)퇴적층(빨간색)은 매우 얇습니다. 길 잃은 빛은 극저온 층을 통해 출혈. (C)퇴적층은 아래에서 미광을 차단할 수 있을 만큼 두껍다. 이러한 유형의 극저온 구멍은 L.I.F.E. 계측기로 측정할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
결론적으로, 우리의 L.I.F.E. 기기는 토양, 세균 매트, 생물막 및 빙하 표면의 극저온 구멍과 같은 육상 서식지에서 광사성 생물을 검출했습니다. 표적 분자는 chla 및 B-PE였다. 공간 해상도는 30 μm/px였습니다. chla의 검출 한계는 B-PE의 경우 250 pg/mL 및 2 ng/mL였습니다. 실험실 교정 후 우리는 북극의 연구 현장에서 수집 된 샘플의 안료 함량을 정량화 할 수있었습니다. 우리는 자동화 된 데이터 감소 프로세스를 위해 자체 프로그래밍 된 소프트웨어를 적용했습니다. 측정 중에 광물의 존재와 변화하는 조명 조건의 영향은 추가 조사가 필요합니다.
기후 온난화로 인해 온도가 높아짐에 따라 액체 물의 가용성이 향상되어 자가 영양 및 이종 영양 특성의 얼음 표면에서 생물학적 활동이 증가합니다. 극저온에서 활동적인 삶의 전체 그림을 제공하기 위해 이종 영양 생물을 감지하기 위해 적극적인 노력을 기울여야합니다. 이것은 그밖 표적 안료 및 적당한 레이저 여기 파장으로 시험될 수 있었습니다. 따라서 L.I.F.E.는 글로벌 변화뿐만 아니라 가능한 천체 생물학적 응용 분야와 맥락에서 상분 조건에 대한 높은 시간적 및 공간 적 해상도를 제공하는 적합한 모니터링 시스템을 제공합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 감사하게도 대령 (IL) J.N. 프리츠커, 타와니 재단, 미국, 오스트리아 과학, 연구 및 경제부 (스파클링 과학 SPA04_149 및 SPA05_201), 알파인 포르충스텔 오베르구르글 (AFO), 오스트리아 우주 포럼 ( ÖWF), 힌터툭서 나투르 아이스 팔라스트의 로만 에를러, 니 알레순드(스발바르)의 북극 역에서 오스트리아 연방 임업 및 베이스 매니저 닉 콕스. 또한 사브리나 오브베게서, 카리나 로프너, 파비안 드웨즈가 촬영 중 도움을 청할 책임이 있습니다. 마지막으로, 우리는 수반되는 비디오에 대한 목소리를 준 제임스 브래들리에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aceton | Merck | 67-64-1 | |
| B-Phycoerythrin | Invirtrogen | P6305 | |
| Chlorophyll a standard | Sigma-Aldrich | C6144-1MG | |
| formaline | Merck | HT501128 | 36% |
| GF/C filters | Whatman | WHA1822025 | 25mm diameter |
| HCl | Merck | H1758 | 36,5-38% |
| L.I.F.E. Prototype | University of Innsbruck | built on demand | |
| LabView | National Instruments | Software, Laboratory Virtual Instrumentation Engineering Workbench | |
| Leucine, L-[4,5-3H], 1 mCi | Perkin Elmer | NET1166001MC | radioactive |
| Liquid scintillation cocktail Beckman Ready Use | Beckman | not more available, can be compensated by Ultra Gold, Packard | |
| liquid scintillation counter | Beckman | out of stock | LSC 6000 IC |
| NaH14CO3 (4 µCi/ml) | DHI Denmark | 4 μCi/ml, 1 ml | radioactive |
| Osmonics polycarbonate filters | DHI Denmark | PCTE | 25mm diameter, 0,2µm pore size |
| Polyscintillation vials | Perkin Elmer | WHA1825047 | 20ml |
| sample tubes | Sigma Aldrich | T2318-500EA | Greiner centrifuge tubes, 50ml |
| Spectrophotometer | Hitachi | NA | Model U2001, any photometer for absorption spectroscopy measuring at 664nm and 750nm would be appropriate |
| trichloric acetic acid (TCA) | Merck | T6399 | 100% |
| ultrasonic probe | nano lab | QS1T-2 |
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