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लेजर-प्रेरित फ्लोरोसेंट उत्सर्जन (L.I.F.E.) Cryososphere habits में Biomarkers के इन-सीटू मापन के लिए उपन्यास गैर इनवेसिव उपकरण के रूप में

Published: October 26, 2019 doi: 10.3791/60447
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 5, 6, 1,2
1Institute of Ecology, University of Innsbruck, 2Austrian Polar Research Institute, University of Vienna, 3BrainLinks-BrainTools, Bernstein Center Freiburg, 4Atom Science, Kasevich Lab, Stanford University, 5Institute of Experimental Physics, University of Innsbruck, 6Department of Physics, Extraterrestrial Vehicle Instruments Laboratory, Harvey Mudd College

Summary

क्रायोस्फीयर में कार्बन फ्रलक्स का अभी तक आकलन नहीं किया गया है लेकिन जलवायु परिवर्तन के संबंध में महत्वपूर्ण हैं। यहाँ हम एक उपन्यास प्रोटोटाइप डिवाइस है कि लेजर प्रेरित फ्लोरोसेंट उत्सर्जन (L.I.F.E.) प्रौद्योगिकी के आधार पर अधिहिमानी वातावरण में phototrophic क्षमता कब्जा दिखाने के लिए उच्च वर्णक्रमीय और स्थानिक संकल्प डेटा की पेशकश के तहत situ परिस्थितियों में.

Abstract

ग्लोबल वार्मिंग विभिन्न पारिस्थितिकी प्रणालियों में माइक्रोबियल समुदायों को प्रभावित करता है, विशेष रूप से क्रायोगोलिक आवास। हालांकि, कम चरम वातावरण में माइक्रोबियल मध्यस्थता कार्बन फ्रलक्स के बारे में जाना जाता है. इसलिए, उपलब्ध बहुत कम अध्ययनों में वर्णित नमूना अधिग्रहण की पद्धति दो प्रमुख समस्याओं का अर्थ है: ए) उच्च संकल्प डेटा के लिए बड़ी संख्या में नमूनों की आवश्यकता होती है, जो दूरस्थ क्षेत्रों में प्राप्त करना मुश्किल है; बी) इस तरह के काटने के रूप में अपरिहार्य नमूना हेरफेर, देखा, और बर्फ कोर के पिघलने कि situ स्थितियों में की एक गलतफहमी की ओर जाता है. इस अध्ययन में, एक प्रोटोटाइप डिवाइस है कि न तो नमूना तैयारी और न ही नमूना विनाश की आवश्यकता है प्रस्तुत किया है. इस उपकरण का उपयोग स्थलीय और बर्फ पारिस्थितिकी प्रणालियों में एक उच्च वर्णक्रमीय और स्थानिक संकल्प के साथ इनसीटॉस के लिए किया जा सकता है और यह एलएसर-I एनड्यूस्ड एफलुरसेन्सई ईमिशन(एल.आई.एफ.ई.)तकनीक पर आधारित है। फोटोऑटोट्रॉफिक अधिहिमानी समुदायों की पहचान फोटोपिगमेंट्स में एलआईएफई हस्ताक्षरों का पता लगाने से की जा सकती है। पोरफिरिन डेरिएवट्स क्लोरोफिलए (chla) (405 एनएम लेजर उत्तेजना) और बी-फाइकोरिथ्रिन (बी-पीई) (532 एनएम लेजर उत्तेजना) के लिए एल.आई.एफ.ई. इस पद्धति के सत्यापन के लिए, L.I.F.E. डेटा chl एक परिमाणीकरण कि वर्णक निष्कर्षण और बाद में अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी शामिल के लिएएक पारंपरिक विधि द्वारा अनुमोदित किया गया. क्षेत्र में प्रोटोटाइप प्रयोज्यता चरम ध्रुवीय वातावरण में साबित हो गया था. स्थलीय निवास पर आगे परीक्षण मोरक्को मिठाई में मंगल एनालॉग सिमुलेशन के दौरान और एक ऑस्ट्रियाई रॉक ग्लेशियर पर जगह ले ली. एल.आई.एफ.ई. उपकरण स्वीकार्य प्रचालन संभार तंत्र वाले बड़े क्षेत्रों के उच्च रिज़ॉल्यूशन स्कैन को सक्षम बनाता है और वैश्विक परिवर्तन के संदर्भ में अधिहिमानी समुदायों की पारिस्थितिक क्षमता की बेहतर समझ में योगदान देता है।

Introduction

क्रायोस्फीयर समुद्री बर्फ, हिमनद, उच्च पर्वत ीय झीलों, बर्फ क्षेत्रों, झील बर्फ, पिघले हुए पानी की धाराओं, और परमाफ्रॉस्ट को आश्रय देता है। इन क्षेत्रों में पृथ्वी केlandmases 1,2 के लगभग 11% को कवर और एक मान्यता प्राप्त cryososphere पर्यावरण के रूप में वातावरण द्वारा व्यापक हैं. हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि क्रायोस्फीयर के बड़े पैमाने पर क्षेत्र तेजी सेपीछेहट रहे हैं 3,4. अंटार्कटिक5,6, आल्प्स7, आर्कटिक8, और अन्य क्षेत्रों में नकारात्मक बर्फ द्रव्यमान संतुलन दिखाते हैं। बर्फ की टोपी और ग्लेशियरों के पीछे हटने पृथ्वी पर हमारे सबसे बड़े मीठे पानी जलाशय की कमी की ओर जाता है. कुछ क्षेत्रों में, ग्लेशियर पीछे हटना अजेय5है.

एक लंबे समय के लिए, बर्फ पारिस्थितिकी प्रणालियों बाँझ वातावरण माना जाता था. हालांकि, कठोर परिस्थितियों के बावजूद, पृथ्वी के क्राईस्फीयर में सक्रिय जीवन की उपस्थिति स्पष्ट है9,10,11,12,13,14,15 . पिघलने से बर्फ के भारी नुकसान की ओर प्रवृत्ति के कारण, क्रायोस्फीयर जैविक गतिविधि में बदलाव के माध्यम से जा रहा है, आसन्न निवास स्थान को प्रभावित कर रहा है। उन आंशिक रूप से अपरिवर्तनीय परिवर्तनों को समझने के लिए हमें उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ स्थिति में बर्फ में जैविक गतिविधि की जांच करने के लिए विधियों की आवश्यकता होती है।

अधिहिमानी वातावरण में, जीवन cryoconite छेद में पाया जा सकता है, बर्फ कवर, पिघल पानी, धाराओं, और नंगे बर्फ सतहों पर. हालांकि, सबसे स्पष्ट अधिहिमानी निवास क्रायोकोनिट छेद हैं। वे हिमनदों के वातावरण में विश्व स्तर पर दिखाई देते हैं और पहली बार 1870 के16,17में ग्रीनलैंड के लिए एक अभियान के दौरान स्वीडिश एक्सप्लोरर एडॉल्फ एरिक Nordenskold द्वारा वर्णित किया गया. नाम ग्रीक शब्द "kryos" (ठंडा) और "कोनिया" (धूल) से उत्पन्न होता है। Aeolian व्युत्पन्न अंधेरे कार्बनिक और अकार्बनिक मलबे बर्फ की सतह पर देते हैं और albedo स्थानीय स्तर पर कम. सौर विकिरण मलबे के पिघलने को बढ़ावा देता है गहरी बर्फ परतों में, तलछट के साथ बेलनाकार बेसिन बनाने (cryoconite)नीचे 9. क्रायोकोनिआइट होल 0.1-10% हिमनदीय अपाहिज क्षेत्र11को कवर करते हैं।

क्रायोकोइट समुदायों में वायरस, कवक, बैक्टीरिया, सायनोबैक्टीरिया, माइक्रोएग्एग और प्रोटोजोआ शामिल होते हैं। इस क्षेत्र के आधार पर, रोटिफर्स, सूत्रकृमि, कोपपॉड्स, टार्डीग्रेड और कीट लार्वा जैसे मेटाज़ोअन जीव भी पाए जा सकते हैं। एडवर्ड्स और दूसरों18 "आइस ठंडा आकर्षण के केंद्र" के रूप में cryoconite छेद का वर्णन. उन्होंने क्रायोकोइट छेद में कार्यात्मक जीनों का भी पता लगाया जो एन, फे, एस और पी साइकिलिंग के लिए जिम्मेदार हैं। मिनी झील पारिस्थितिकी तंत्र बहुत गर्म और अधिक पोषक तत्वों से भरपूर निवास स्थान11में पाया दरों पर photosynthesize respire और photosynthesize. इन निष्कर्षों में अधिहिमानी वातावरण में माइक्रोबियल पृथक्करण की महत्वपूर्ण भूमिका पर जोर दिया गया है। क्रायोकोइट छेद में रहने वाले समुदायों के अलावा, नंगे बर्फ सतहों बर्फ शैवाल का निवास कर रहे हैं। उनके शरीर क्रिया विज्ञान का अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है19 लेकिन उनके स्थानिक वितरण का मूल्यांकन नहीं किया गया है20. अधिहिमानी वातावरण में उनकी उपस्थिति एल्बेडो को कम कर देती है और इसलिए पिघलने को बढ़ावा देती है जिससे पोषक तत्व बह जाता है और पोषक तत्व ों को डाउनस्ट्रीम आवास9में प्रवेश कर देता है . बढ़ते तापमान और इसलिए, तरल जल की उच्च उपलब्धता, इन बर्फीले पारिस्थितिकी प्रणालियों में शुद्ध पारिस्थितिकी तंत्र उत्पादकता को प्रभावित करती है।

अधिहिमानी वातावरण में प्रकाश संश्लेषी रूप से सक्रिय जीव अकार्बनिक कार्बन और नाइट्रोजन को कार्बनिक में रूपांतरित करते हैं, जो माइक्रोबियल खाद्य वेब21,22के लिए उपलब्ध स्रोत हैं। अब तक ऐसे कुछ अध्ययन हैं जो अनुमान लगाते हैं कि अधिहिमानी कार्बन फ्रलक्स11,20,23. कार्बन फ्रलक्स की प्रस्तावित दरों में विसंगति कम स्थानिक और लौकिक डेटा संकल्प से होती है। इसके अलावा, क्रायोकोइट छेद के बाहर अधिहिमानी समुदायों के स्थानिक वितरण का मुश्किल से मूल्यांकन किया जाता है। कुक और अन्य20 अपने मॉडल में भविष्यवाणी की है कि supralacial शैवाल समुदायों को उनके बड़े सतह कवरेज के कारण समकालीन cryoconite छेद की तुलना में 11x अधिक कार्बन को ठीक. नमूना अखंडता हासिल करने वाले अधिहिमानी शैवाल समुदायों का पता लगाना अभी भी स्थिति का पता लगाने और परिमाणीकरण के लिए उपकरण ों के लापता होने के कारण बाधित है।

रसद में कठिनाइयों के जवाब में, बर्फ पारिस्थितिकी प्रणालियों कम अक्सर समशीतोष्ण क्षेत्रों में निवास की तुलना में अध्ययन कर रहे हैं. डेटा रिज़ॉल्यूशन मूल्यांकन किए गए नमूनों की संख्या पर निर्भर करता है और अध्ययन स्थलों की पहुंच पर निर्भर करता है। ऐसे sawing के रूप में मानक नमूना तरीकों, coring, और बाद में पिघलने माइक्रोबियल समुदाय के हेरफेर शामिल है. उदाहरण के लिए, ठोस बर्फ के नमूनों में क्लोरोफिलए (चलएक) मूल्यांकन पर्याप्त हस्तक्षेप के बिना मानक विधियों के साथ असंभव है। इसलिए, जांच माइक्रोबियल समुदायों के भीतर पिघलने प्रेरित तापमान परिवर्तन अपरिहार्य हैं। 22में फोटोसिस्टम II और अन्य सेलुलर संरचनाओं की तापीयता के प्रत्युत्तर में पिघले हुए बर्फ के नमूनों का प्रयोगशाला विश्लेषण हमेशा स्थिति में मिथ्याकरण का कारण बन सकता है।

स्थिति माप में गैर विनाशकारी विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने के लिए केवल उचित तरीका है. यह लक्ष्य फ्लोरोसेंट-आधारित विधियों का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। उनके प्रकाश संचयन समारोह के कारण, chlएक और बी-phycoerythrin (बी-पीई) जीवों में मौजूद हैं कि अधिहिमानी वातावरण में कार्बन चक्र में योगदान, के रूप में Anesio और दूसरों द्वारा साबित कर दिया गया है11. अतः ये फ्लोरोसेंट अणु बर्फ पारिस्थितिकी तंत्र में माइक्रोबियल मध्यस्थता कार्बन फ्रलक्स के परिमाणीकरण के लिए उपयुक्त बायोमार्कर हैं।

इस अध्ययन में, हम विकास, अंशांकन, और एक उपन्यास गैर इनवेसिव उपकरण के लिए chlएक और बी-पीई अणुओं स्थलीय और बर्फ पारिस्थितिकी प्रणालियों में situ परिमाणीकरण के लिए प्रयोज्यता प्रस्तुत करते हैं. प्रोटोटाइप डिवाइस लेजर प्रेरित फ्लोरोसेंट उत्सर्जन पर आधारित है, जिसे एल.आई.एफ.ई. ऑप्टिकल उपकरण (चित्र 1) लेजर प्रेरित फ्लोरोसेंट उत्तेजना के बाद फ्लोरोसेंट biomarker हस्ताक्षर कब्जा. प्रक्रिया विनाशकारी है और अध्ययन स्थल पर या एक प्रयोगशाला में किया जा सकता है.

Figure 1
चित्र 1: L.I.F.E. प्रोटोटाइप. बाएँ: एक सुरक्षात्मक ढक्कन के बिना उपकरण की तस्वीर. ठीक है: उपकरण का योजनाबद्ध चित्रण। कुल द्रव्यमान - 5.4 किग्रा (लेजर और प्रकाशिकी - 4ण्025 किग्रा, लैपटॉप - 1.37 किग्रा)। एल्यूमिनियम फ्रेम - 32.5 सेमी x 20.3 सेमी x 6.5 सेमी ऑप्टिकल ट्यूब: 18.4 सेमी x 4 सेमी (व्यास)। सीसीडी: bluefox mv220g सेंसर; एफ: इमदादी-स्टीरने्ड लांग-पास फिल्टर (450 एनएम और 550 एनएम); एल: ऑप्टिकल लेंस; M1: दर्पण; M2: dichroic दर्पण; एम सी: microcontroller; पी: प्रिज्म; पीबीएस: polarizing बीम विभाजक; एस: समायोज्य उस्तरा ब्लेड से बना भट्ठा एपर्चर। स्केल बार - 70 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पोर्टेबल दोहरी तरंगदैर्ध्य किट 4.5 किलो वजन का होता है और एक बाहरी कंप्यूटर के साथ संयोजन में एक तिपाई पर प्रयोग किया जाता है. क्षेत्र सेटअप त्वरित और आसान है। साधन तिपाई से जुड़ा हुआ है, और लेंस ट्यूब एक यूएसबी केबल और कैमरा केबल के साथ डिवाइस से जुड़ा हुआ है. बाहरी कंप्यूटर एक यूएसबी केबल का उपयोग कर साधन से जुड़ा है. तिपाई पैर इस तरह से समायोजित कर रहे हैं कि लेंस ट्यूब की ओर निर्देशित है और नमूना शामिल हैं. फिर, एक 5 mW हरी लेजर एक polarizing बीम विभाजक है कि स्पेक्ट्रोमीटर के ऑप्टिकल अक्ष की ओर polarized प्रकाश redirects पारित करने के बाद नमूना हिट. यह नमूना एक फ्लोरोसेंट प्रकाश को दर्शाता है, जो चित्र 1में लाल रंग में सचित्र है। collimated प्रकाश के आधे polarizing बीम विभाजक गुजरता है और लेजर संकेतों को हटा कि एक इमदादी-स्टीयर्ड लंबे समय से पास फिल्टर के माध्यम से ध्यान केंद्रित किया है। अगले, संकेत एक एपर्चर भट्ठा कि दो समायोज्य उस्तरा ब्लेड के होते हैं हिट. एक प्रिज्म स्पेक्ट्रमली संकेत सेंसर द्वारा कब्जा कर लिया है इससे पहले कि भट्ठा एपर्चर के लिए प्रकाश लंबकोणीय की ठीक लाइन अलग करती है। प्रक्रिया एक नीले लेजर के साथ दोहराया जाता है. कच्चे डेटा भी सॉफ्टवेयर आपरेशन के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक पोर्टेबल कंप्यूटर के लिए स्वचालित रूप से स्थानांतरित कर रहे हैं.

साधन एक बाहरी कंप्यूटर द्वारा नियंत्रित किया जाता है जो एक LabVIEW वातावरण का उपयोग करके नियंत्रित होता है जो चित्र को सीसीडी कैमरे के साथ सिंक्रनाइज़ करता है, ऑन/ऑफ लेज़रों को स्विच करता है, और लंबे समय से पास फिल्टर व्हील को घुमाता है। आलेखी प्रयोक्ता इंटरफ़ेस (GUI) को तीन मुख्य खंडों में विभाजित किया गया है। जोखिम समायोजन मैन्युअल रूप से किया जाता है। हालांकि जोखिम समय और संकेत तीव्रता के बीच सुधार रैखिक है (चित्र 2B),अधिकतम जोखिम समय 10 s तक सीमित है क्योंकि अब एकीकरण बार संकेत करने के लिए शोर अनुपात में एक महत्वपूर्ण कमी करने के लिए नेतृत्व. टिप्पणी फ़ील्ड का उपयोग नमूने के वर्णन के लिए किया जाता है (चित्र 2A) . सही अनुभाग में, कच्चे छवियों के रूप में जल्द ही के रूप में माप समाप्त कर रहे हैं प्रदर्शित कर रहे हैं. यह सुविधा क्षेत्र में तत्काल डेटा मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण है (चित्र 2C-E)। लाल क्षेत्रों overexposed पिक्सल, जो जोखिम समय को कम करने से बचा जा सकता है संकेत मिलता है.

बाद में कच्चे डेटा में कमी की प्रक्रिया छवि अधिग्रहण प्रक्रिया से decoupled है और छवि अधिग्रहण के बाद किसी भी समय किया जा सकता है.

Figure 2
चित्र 2: डेटा अधिग्रहण और कच्चे डेटा मूल्यांकन के लिए L.I.F.E. ग्राफ़िकल यूजर इंटरफेस। (A)सॉफ्टवेयर नमूना विवरण के लिए मैनुअल पाठ इनपुट सक्षम बनाता है. (बी) जोखिम समय माप से पहले समायोजित किया जा सकता है। (सी ]ई) कच्चे छवियों इंटरफ़ेस के दाईं ओर प्रदर्शित कर रहे हैं. (ई) लाल रंग संवेदक की संतृप्ति का संकेत देते हैं। (च)रन मापन बटन का सक्रियण डेटा प्राप्ति प्रक्रिया को ट्रिगर करता है. सरणी(G)में, डेटा प्राप्ति के दौरान स्वचालित रूप से निष्पादित किए गए सभी आदेश प्रदर्शित होते हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: एक कच्चे प्रतिबिंब का उदाहरण. बाएँ: chl के कच्चे डेटा एसीटोन समाधान मेंएक मानक, L.I.F.E साधन के साथ दर्ज की गई. डिवाइस के ऑप्टिकल गुणों के कारण, संकेत एक विकृत लाइन के रूप में प्रदर्शित किया जाता है. ठीक है: प्रति पिक्सेल कच्ची छवि की व्याख्या (px). स्पेक्ट्रमी अक्ष (5 दउ/px रिज़ॉल्यूशन) को स्थानिक अक्ष (30 डिग्री उध/px रिज़ॉल्यूशन) के विरुद्ध प्लॉट किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

12-बिट ग्रे-स्केल कच्चे चित्र एक-आयामी छिद्र भट्ठा और सीसीडी के सामने प्रिज्म के कारण वर्णक्रमीय घटक के कारण स्थानिक घटक दिखाते हैं (चित्र 3)। ऑप्टिकल बाधाओं के जवाब में कच्चे छवियों विकृत कर रहे हैं. इसलिए, उन्हें एक ऐसा कोड लागू करके फसली और विकृत करने की आवश्यकता है जो विरूपण की डिग्री को पहचानता है। यह एक सॉफ्टवेयर जादूगर के साथ किया जाता है (चित्र 4)। अगले, तरंगदैर्ध्य अंशांकन 532 एनएम लेजर के साथ किया जाता है. हरी प्रकाश एक 1,064 एनएम अवरक्त लेजर की आवृत्ति दोहरीकरण द्वारा उत्पादन किया है. दोनों तरंगदैर्ध्य सीसीडी द्वारा पता लगाया जा सकता है और इसलिए, प्रत्येक पिक्सेल के वर्णक्रमीय स्थिति dewarped छवियों में स्वचालित रूप से गणना की जा सकती है (चित्र 4) .

चित्र तो एक दिया तरंगदैर्ध्य रेंज के लिए नीचे फसली है (550-1,000 एनएम हरी लेजर माप के लिए और 400-1,000 नीले लेजर माप के लिए). चयनित पिक्सेल रेखा में प्रत्येक पिक्सेल के धूसर मानों की गणना की जाती है और उन्हें अभिव्यक्त किया जाता है. कोई धूसर मान 0-255 से श्रेणी कर सकता है. उसके बाद, प्रत्येक पिक्सेल लाइन एक नंबर के लिए खातों. इसके अलावा परदे पर सॉफ्टवेयर निर्देश स्थानिक निर्देशांक के खिलाफ साजिश रची प्रत्येक पिक्सेल लाइन से ग्रे मूल्य मायने रखता दिखा एक साजिश की पीढ़ी के लिए नेतृत्व. यह नमूने में एक साथ chlएक और बी-पीई की एक मात्रात्मक स्थानिक भेदभाव के लिए अनुमति देता है। साथ ही, एक नमूने के वर्णक्रमीय गुण चयनित पिक्सेल लाइनों से स्वचालित रूप से प्लॉट किया जा सकता है.

Figure 4
चित्र 4: विकृत कच्चे चित्र. बाएँ: कच्चे छवि एक हरे रंग की लेजर के साथ कब्जा कर लिया. कोई फ़िल्टर उपयोग नहीं किया गया. सिग्नल 532 एनएम और 1,064 एनएम पर प्रदर्शित किए जाते हैं। एक्सपोजर समय - 0.015 s. केंद्र: फसली 532 एनएम संकेत छवियों का एक सेट dewarp करने के लिए एक संदर्भ पंक्ति के रूप में प्रयोग किया जाता है. ठीक है: कच्चे छवि स्रोत से विकृत छवि. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Protocol

1. अंशांकन और सत्यापन

नोट: वर्णक अंशांकन के लिए, chlएक और बी-पीई के शेयर समाधान से कमजोर पड़ने पंक्तियों तैयार करते हैं। chlएक शेयर समाधान एसीटोन के साथ पतला है और बी-पीई आसुत बाँझ पानी के साथ पतला है। बाद में, प्रत्येक कमजोर पड़ने कदम के 15 एमएल की जरूरत होगी. उन्हें एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लपेटकर प्रकाश से pigments को सुरक्षित रखें. chlएक फ्रीजर में और एक फ्रिज में बी-पीई स्टोर जब तक आगे का उपयोग करें. कमजोर पड़ने पंक्ति के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉलchl के लिए 1.1 और बी-पीई के लिए 1.2 अनुभागों में इस प्रकार है। दोनों chlएक और बी-पीई प्रयोगशाला अंशांकन वर्णक का पता लगाने और L.I.F.E. साधन के साथ परिमाणीकरण के लिए नीचे वर्णित है. एक पिछले अंशांकन24 इस अध्ययन में के रूप में एक ही pigments के साथ बनाया गया था.

  1. क्लोरोफिलएक कमजोर पड़ने पंक्ति
    1. एक 50 एमएल नमूना ट्यूब में एसीटोन के साथ chlA (ए nidulans शैवाल से शुद्ध) के 1 मिलीग्राम भंग और निम्नलिखित अंतिम सांद्रता के लिए एसीटोन के साथएक शेयर समाधान पतला: 1,000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10; 5; 1; और 0.5 एनजी/
    2. 50 एमएल नमूना ट्यूबों में प्रत्येक कमजोर पड़ने के 15 एमएल स्थानांतरण और प्रकाश संवेदनशीलता के कारण एल्यूमीनियम पन्नी में उन्हें कवर. एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ट्यूब ों स्टोर जब तक अंशांकन माप लिया जाता है.
      नोट: प्रोटोकॉल यहाँ बाधित किया जा सकता है।
    3. triplicates के रूप में एक डबल-बीम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में प्रत्येक कमजोर पड़ने सेchl एक अवशोषण सुविधाओं को मापने और Lorenzen25द्वारा वर्णित के रूप मेंएक सामग्री chl की गणना, जो खंड 2.2.2 में विस्तार से वर्णित किया जाएगा.
  2. पीई तनुता पंक्ति
    1. बाँझ फ़िल्टरकिए गए पानी के साथ एक 4 mg/mL B-PE स्टॉक समाधान को पतला करें (पीएच जेड 7) निम्नलिखित अंतिम सांद्रता के लिए: 1,000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10; और 5 एनजी/एमएल बी-पीई। एक 50 एमएल नमूना ट्यूब में प्रत्येक कमजोर पड़ने के 15 एमएल स्थानांतरण और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर. आगे का उपयोग करने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
      नोट: प्रोटोकॉल यहाँ बाधित किया जा सकता है।
  3. अंशांकन के लिए सेटअप करें
    1. तीन माप प्लेटफार्मों, अगले से अधिक प्रत्येक 1.5 सेमी स्थापित करने के लिए चित्र 5 में दिखाया गया है के रूप में एक रैक बनाएँ।
      नोट: रैक और स्तंभ ऊँचाई माप के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है क्योंकि द्रवों की सतह एल.आई.एफ.ई. उपकरण के केन्द्र बिन्दु में बनी रहनी चाहिए जैसा कि चित्र 5में दर्शाया गया है।
    2. एक polyscintillation प्लास्टिक शीशी में उच्चतम केंद्रित कमजोर पड़ने के 5 एमएल जोड़ें और रैक के उच्चतम बिंदु पर डाल दिया। फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापने।
    3. रैक के मध्य स्थिति में शीशी प्लेस और एक और 5 एमएल (10 एमएल कुल मात्रा) जोड़ें. फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापने। एक और 5 एमएल (15 एमएल कुल मात्रा; कुल 45 मिमी स्तंभ ऊंचाई में) के साथ रैक पर सबसे कम स्थिति पर प्रक्रिया दोहराएँ।
      नोट: डिटेक्टर संतृप्ति को रोकने के लिए प्रत्येक कमजोर पड़ने कदम के लिए जोखिम समय अनुकूलित (पर ग्रे मूल्यों 255 में 12-बिट छवियों) और कमजोर फ्लोरोसेंट संकेतों का एक पर्याप्त संकेत करने के लिए शोर अनुपात के लिए.
    4. 1.3.2 और 1.3.3 सभी कमजोर पड़ने के साथ चरणों को दोहराएँ (कदम 1.1.1 और 1.2.1) chla और B-PE.
    5. स्वचालित रूप से गणना और Y-अक्ष (स्थानिक वितरण) के साथ प्रत्येक पिक्सेल लाइन से ग्रे मान योग करने के लिए डेटा कमी विज़ार्ड में उत्पन्न डेटा फ़ाइलों को लोड करें।
      नोट: विभिन्न जोखिम समय 1 s के एक एकीकरण समय के लिए फ्लोरोसेंट तीव्रता सामान्यीकृत द्वारा स्वचालित रूप से मुआवजा दिया जाता है.
    6. कमजोर पड़ने श्रृंखला से ज्ञात सांद्रता और गणना की गई सामान्यीकृत फ्लोरोसेंट तीव्रता का उपयोग करएक Poison प्रतिगमन विश्लेषण के साथ वर्णक क्षेत्र घनत्व की गणना करें। फिर एक कारक के साथ प्रत्येक स्तंभ ऊंचाई से गिनती गुणा द्वारा तीन अलग-अलग स्तंभ ऊंचाइयों से 1.5 सेमी (5 एमएल) के लिए फ्लोरोसेंट गणना सामान्य (कारक 1, 0.5, और 0.33, 5 एमएल, 10 एमएल, और 15 एमएल एकाग्रता समाधान, क्रमशः) के लिए।

Figure 5
चित्र 5: प्रयोगशाला शर्तों के तहत chla और B-PE के साथ L.I.F.E. अंशांकन के लिए सेटअप करें।
(ए) यंत्र की लेंस ट्यूब। (बी) बी-पीई उत्तेजना के लिए ग्रीन लेजर। (ग) ब्लू लेजर के लिए chlएक उत्तेजना. (डी) छान वील. (ई) एल.आई.एफ.ई. यंत्र का फोकल बिंदु। (च) B-PE/पानी या chla/acetone समाधान के साथ 5 एमएल, 10 एमएल, और 15 एमएल. (छ) स्पेसर्स जो प्रत्येक विलयन की सतह को तीन भिन्न खंडों के लिए फोकस तल पर रखते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. नमूना और नमूना प्रसंस्करण

  1. बर्फ और बर्फ का संग्रह
    1. एक ग्लेशियर से बर्फ और अधिहिमानी बर्फ को बाँझ पॉलीथीन बैग में एकत्र करें और उन्हें आगे के प्रसंस्करण तक जमे हुए स्टोर करें।
      नोट: इस अध्ययन के लिए, नमूने Midtre Lovenbreen (MLB), Svalbard के उच्च आर्कटिक Archipelago में अनुसंधान गांव Ny-lesund के पास एक बहुतापीय ग्लेशियर में एकत्र किए गए थे (78 डिग्री 53 'एन, 12 डिग्री 03 ' ई).
    2. ग्लेशियर फोरफील्ड से बाँझ पॉलीथीन बैग में नमूना जीवाणु मैट और आगे की प्रक्रिया के लिए एक प्रयोगशाला में सभी नमूनों के परिवहन।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में धीरे-धीरे जमे हुए सामग्री पिघला। GF/F फिल्टर (47 मिमी व्यास) पर तरल नमूने फ़िल्टर और फ़िल्टर की गई मात्रा नोट करें। फिल्टर आगे प्रसंस्करण जब तक जमे हुए रखें.
  2. क्लोरोफिलएक माप
    1. L.I.F.E. साधन का उपयोग करना, चार यादृच्छिक क्षेत्रों में फिल्टर उपाय, हरी और नीले लेजर का उपयोग triplicates में प्रत्येक. फ़िल्टर किए गए क्षेत्र और फ़िल्टर की गई मात्रा के साथ क्षेत्र घनत्व गुणा करके समग्र वर्णक एकाग्रता की गणना करें। वर्णक सांद्रता को सामान्य करते हुए 1 ल् की मात्रा में वर्णक सांद्रता (जग/एल)।
    2. Lorenzen25द्वारा प्रोटोकॉल के अनुसार एक प्रयोगशाला मानक के साथ GF/F फिल्टर कीएक सामग्री chl का आकलन करें। ऐसा करने के लिए, एसीटोन के 13 एमएल के साथ एक शीशी में प्रत्येक फिल्टर डाल दिया और उन्हें रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर। अगले, एक शीशी लेने के लिए और निरंतर मोड में 50% बिजली पर 2 मिनट के लिए sonication से पहले बर्फ पर जगह है। निचोड़ और शीशी से फिल्टर हटा दें।
    3. एक सिरिंज करने के लिए टाइपोन ट्यूबिंग संलग्न करें और शीशी से chlएक निष्कर्षण-एसीटोन मिश्रण को हटा दें। एक GF-5 फिल्टर धारक के साथ tygon टयूबिंग बदलें. समाधान को क्वार्ट्ज क्यूवेट में स्थानांतरित करें।
    4. एसीटोन के लिए अवशोषण स्पेक्ट्रोमीटर कैलिब्रेट करने के बाद, स्पेक्ट्रोमीटर में cuvette में नमूना जगह है और 400-750 एनएम के बीच अवशोषण सुविधाओं को मापने. इसके बाद, स्पेक्ट्रोमीटर से क्यूवेट को हटा दें और नमूने के लिए 2 एम एचसीएल के 200 डिग्री एल जोड़ें। फिर, नमूने में फीओफाइटिन सामग्री को मापने के लिए अवशोषण माप को दोहराएँ।
  3. रेडियोलेबल मार्करऔर लेजर तीव्रता और उत्पादकता दरों पर जोखिम समय के प्रभाव के माध्यम से माइक्रोबियल गतिविधि के मापन
    चेतावनी: मार्कर रेडियोधर्मिता (जेड-विकिरण) से सावधान रहें। एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने, और काले चश्मे का प्रयोग करें, और एक लाइसेंस प्राप्त आइसोटोप प्रयोगशाला में एक धूआं हुड के तहत काम करते हैं.
    1. जीवाणु उत्पादन के लिए बाँझ पॉलीथीन बैग में जीवाणु मैट के पांच alicots हस्तांतरण. एक 4% अंतिम एकाग्रता के लिए formaldehyde के साथ नियंत्रण निष्क्रिय.
      नोट: तीन alicots 3एच लेबल ल्यूकोइन तेज के लिए उपयोग किया जाता है और दो alicots नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है।
    2. एक नीले लेजर (405 एनएम, 5 mW) के साथ मैट को उजागर और एक हरे रंग की लेजर के साथ (532 एनएम, 5 mW) के लिए 10 s और 30 प्रत्येक. 50 mW लेज़रों के साथ प्रक्रिया दोहराएँ. फिर, उन नमूनों को निष्क्रिय करें जिनका फार्मेल्डिहाइड के साथ इलाज नहीं किया गया था।
      नोट: एक चटाई केवल एक लेजर जोखिम के लिए प्रयोग किया जाता है। नियंत्रण के रूप में गैर उजागर माइक्रोबियल मैट का प्रयोग करें।
    3. लेजर उपचार के बाद, क्रमशः 3एच-ल्यूसिन और नाएच14सीओ3को शामिल करके जीवाणु और प्राथमिक उत्पादन का अनुमान लगाएं। जीवाणु उत्पादन माप के लिए, नमूना प्रति पांच aliquots का उपयोग करें (20 एमएल) और समानताएं, जो मार्कर के अजैविक निगमन के लिए नियंत्रण के रूप में सेवा के दो करने के लिए formaline (4% अंतिम एकाग्रता) जोड़ें. विभिन्न उपचारों के सभी नमूनों में 3एच-ल्यूसिन (40 एनएम) जोड़ें और उन्हें स्थिति में स्थितियों (0.1 डिग्री सेल्सियस) के तहत 4 एच के लिए इनक्यूबेट करें। शेष लाइव नमूनों में औपचारिक रूप से जोड़कर प्रतिक्रिया को समाप्त करें।
    4. जीवाणु मैट के जीवाणु उत्पादन के लिए, लेबल नमूनों को क्रायोविल्स में स्थानांतरित करें। किरचमन26 और बेल27के प्रोटोकॉल के अनुसार 5 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर 5% ट्राइक्लोरोऐसीटिक एसिड और अपकेंद्रित्र के साथ कोशिकाओं को निकालें . प्रस्फुरीय द्रव जोड़ें और क्रायोविएल को एक पॉलीसिंटिलेशन शीशी में डाल दिया। एक तरल scintillation काउंटर के साथ नमूने का विश्लेषण और तेजी से दरों की गणना.
      नोट: तीन alicots 3एच लेबल ल्यूकोइन तेज के लिए उपयोग किया जाता है, दो aliquots नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है।
    5. प्राथमिक उत्पादन के लिए, विभिन्न उपचार (100 एमएल) के पांच प्रतिकृतियां तैयार, अंधेरे नमूनों की नकल करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में उनमें से दो लपेटो, और सभी के लिए NaH14सीओ3 (1 $Ci) जोड़ें। परिवेश प्रकाश में 4 एच के लिए और सीटू तापमान (0.1 डिग्री सेल्सियस) में इनक्यूबेट। शेष तीन प्रतिकृतियां काला करके प्रतिक्रिया को समाप्त करें और नमूने को GF/F फ़िल्टर (25 मिमी व्यास) पर फ़िल्टर करें।
    6. सभी अतिरिक्त कार्बन को हटाने के लिए फिल्टर करने के लिए 2 एन एच सीएल के 100 डिग्री एल जोड़ें और इसे धूआं हुड के नीचे हवा दें। 80 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग प्लेट पर नमूने सूखी और polyscintillation शीशियों में नमूने जगह है।
    7. प्राथमिक और जीवाणु उत्पादन के सभी उपचारों के प्रति मिनट (डीपीएम) रेडियोधर्मी विघटन को मापने के लिए, क्रायोविएलियों को पॉलीसिंटिलेशन शीशियों में रखें और 5 एमएल की शानदार कॉकटेल जोड़ें। एक तरल प्रस्फुरेशन काउंटर के साथ डीपीएम को मापने और तेज दरों की गणना।

Representative Results

बी-पीई के लिए प्रयोगशाला अंशांकन
बी-पीई कमजोर पड़ने की पंक्ति के अनुक्रिया संकेतों को 20 डिग्री सेल्सियस(चित्र 6)पर एक अंधेरे कमरे में एल.आई.एफ.ई. उपकरण से मापा गया था। गिनती दर दोनों एकाग्रता और मापा नमूना के स्तंभ ऊंचाई पर निर्भर करता है. कम एकाग्रता और कम स्तंभ ऊंचाई बी-पीई नमूना एक ही एकाग्रता और उच्च स्तंभ ऊंचाई के नमूनों की तुलना में मजबूत fluoresced.

Figure 6
चित्र 6: बी-पीई प्रयोगशाला अंशांकन। बी-पीई सामग्री और स्तंभ घनत्व अंशांकन दिखाया गया है। सामान्य गणना दरों की गणना 1.5 सेमी के स्तंभ ऊंचाई के लिए की गई थी. अनुमति28के साथ पुनर्मुद्रण . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एक Poison प्रतिगमन अंतिम अंशांकन लाइन फिट के लिए इस्तेमाल किया गया था. क्षेत्र घनत्व और पिक्सेल धूसर मान गणनाओं के बीच एक रेखीय सहसंबंध था. वक्र का फलन प़् ् 81ण्04x(चित्र 7) था जिसका अर्थ है कि 1 स-स में उजागर नमूने में 8,104 की धूसर मान गणना दर 100 उधे बृ 2 ब-पीई के क्षेत्र घनत्व के बराबर थी। chlएक अंशांकन एक एनालॉग तरीके से स्थापित किया गया है. समारोह y था $ 8.94x.

Figure 7
चित्रा 7: बी-पीई के लिए अंतिम अंशांकन वक्र। ग्रे मूल्य मायने रखता है 1 s के एक जोखिम समय के लिए सामान्यीकृत और क्षेत्र घनत्व के खिलाफ साजिश रची गई. अनुमति के साथ पुनर्मुद्रण28| कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Svalbard और डेटा की प्रयोगशाला सत्यापन से cryoconite नमूने पर आवेदन
एल.आई.एफ.ई. मापन के माध्य मान और एसीटोन का उपयोग करके पारंपरिक निष्कर्षण से व्युत्पन्न एक ही नमूनों की एकल माप और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ बाद के विश्लेषण को चित्र 8में दिखाया गया है।

Figure 8
चित्र 8: प्राकृतिक नमूनों के साथ डेटा सत्यापन। नमूने (MLB) एक प्रयोगशाला स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (एकल मूल्यों) के परिणामों के आधार पर एकसामग्री chl द्वारा रैंक कर रहे हैं और फिल्टर प्रति चार यादृच्छिक क्षेत्रों पर मापा chlएक फ्लोरोसेंट डेटा के साथ तुलना में. त्रुटि पट्टियाँ L.I.F.E. माप के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Chl48 g/L-67 से लेकर एक विषय को कम करके आंका गया था, और कम chlएक सामग्री से लेकर 0.7 g/L-7 g/L/L द्वारा overestimated थे. L.I.F.E. माप से मानक विचलन कम थे.

प्रयोगशाला मानकों के साथ situ माप से वर्णक्रमीय डेटा की तुलना
Chlएक स्पेक्ट्रम cryoconite नमूने और ए nidulans शैवाल से शुद्ध से उन लोगों के बीच तुलनीय थे. सभी नमूनों में फ्लोरोसेंट चोटियों 700 एनएम-710 एनएम पर स्थित थे। तथापि, क्रायोकोनिट नमूनों से प्राप्त स्पेक्ट्रम में 400 दउ-650 एनएम तथा 800 दउ-1,000 दउ के बीच उच्च रव संकेतों का पता चलता है, जबकि चlवर्णक मानक(चित्र 9)।

Figure 9
चित्र 9: स्पेक्ट्रल डेटा व्याख्या. चार cryoconite granules के माप (नीला) और एक chlएक मानक वर्णक समाधान (लाल) 405 एनएम लेज़रों के साथ उत्तेजना के बाद. स्पेक्ट्रम नमूना संग्रह के बाद 1 साल दर्ज किए गए थे. नमूने जमे हुए रखा गया था और माप से पहले प्रकाश के संपर्क में नहीं थे. तरंगदैर्ध्य अंशांकन मुद्दों के जवाब में, फ्लोरोसेंट चोटी पर स्थित है 700 एनएम -710 एनएम के बजाय 680 एनएम. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

स्वचालित क्रायोकोइट अनाज विश्लेषण
क्रायोकोइट छिद्र के स्वचालित विश्लेषण के एक उदाहरण में (चित्र 10) पिक्सेल रेखा 50 पर उच्चतम वर्णक क्षेत्र घनत्व पाया गया। एक 532 एनएम लेजर के साथ उत्तेजना के बाद नमूना स्पेक्ट्रम सेंसर के oversaturation के जवाब में 255 के एक ग्रे मूल्य पर एक कट ऑफ के साथ एक चोटी दिखाया. इस चोटी हरी लेजर से व्युत्पन्न और फ्लोरोसेंट संकेत से नहीं.

Figure 10
चित्र 10: 1 मिमी के व्यास के साथ एक एकल क्रायोकोइट ग्रेन्युल का स्वचालित डेटा विश्लेषण। नमूना Vestre Brggerbreen (VBB) में एकत्र किया गया था और 4 घंटे के भीतर आर्कटिक स्टेशन (GB) में एक अंधेरे प्रयोगशाला कमरे में नमूने के बाद मापा Ny-lesund में सुविधा. बायाँ स्तंभ B-PE माप दिखाता है और दायाँ स्तंभ किसीडेटा को chl का प्रतिनिधित्व करता है. कच्चे छवियों के शीर्ष पर प्रदर्शित कर रहे हैं. लेजर प्रेरित फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाओं ग्रे में प्रदर्शित कर रहे हैं. लाल क्षेत्रों मानक pigments से प्रतिक्रिया का संकेत मिलता है. मध्य भाग लक्ष्य वर्णकों के स्थानिक वितरण को दर्शाता है। फ्लोरोसेंट संकेत के वर्णक्रमीय गुण कम छवियों में प्रदर्शित कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

बैक्टीरियल मैट में उत्पादकता पर लेजर उत्तेजना का प्रभाव
लेजर की शक्ति और/अथवा जोखिम समय में वृद्धि करते समय न तो प्राथमिक और न ही जीवाणु उत्पादकता प्रभावित हुई (चित्र 11)। कोई महत्वपूर्ण अंतर वृद्धि की शक्ति के साथ लेजर उपचार के तहत पाया गया.

Figure 11
चित्र 11: Svalbard से नमूनों की उत्पादकता माप. बैक्टीरियल मैट अलग लेजर तीव्रता और जोखिम समय के हरे और नीले पराबैंगनीकिरण के साथ उजागर किया गया. डेटा लेजर तरंगदैर्ध्य स्रोत (हरे और नीले) के अनुसार रंग का कर रहे हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

अंशांकन
फोटॉन गणना को सामान्य करने के बाद वर्णक एकाग्रता और फ्लोरोसेंट तीव्रता के बीच एक रैखिक सहसंबंध था 1 s. कम कॉलम ऊंचाई और कम वर्णक सांद्रता वाले नमूने लक्ष्य वर्णकों के अतिसंहार के कारण, एक ही वर्णक एकाग्रता के साथ उच्च स्तंभ ऊंचाइयों की तुलना में. इसके अलावा, कमजोर फ्लोरोसेंट संकेतों सेंसर पर पर्याप्त फोटॉन मायने रखता है के लिए लंबे समय से जोखिम समय की आवश्यकता है. हालांकि, लंबे एकीकरण बार भी सेंसर पर आवारा प्रकाश की मात्रा में वृद्धि हुई है, संकेत करने के लिए शोर अनुपात की कमी में जिसके परिणामस्वरूप. अपने वर्तमान संस्करण में, सॉफ्टवेयर शोर और संकेत के बीच डेटा में कमी की प्रक्रिया के दौरान भेद नहीं कर सकते. इसलिए, कम फ्लोरोसेंट तीव्रता माप एक वर्णक overestimation के लिए नेतृत्व किया क्योंकि शोर एक संकेत है कि लक्ष्य pigments से व्युत्पन्न के रूप में गिना गया था. इसके अलावा, अधिक केंद्रित वर्णक समाधान से फ्लोरोसेंट तीव्रता कम एकाग्रता समाधान की तुलना में अधिक परिवर्तनशीलता से पता चला. इस प्रभाव वर्णक समाधान है कि अंशांकन वक्र के लिए इस्तेमाल किया गया भीतर अवशोषण प्रक्रियाओं द्वारा समझाया जा सकता है.

क्लोरोफिलएक परिमाणीकरण के लिए डेटा सत्यापन
बर्फ और बर्फ के नमूने छानने के बाद, तीन आयामी नमूने लगभग फिल्टर पर एक दो आयामी नमूना के रूप में दिखाई दिया. यह L.I.F.E (क्षेत्र घनत्व) और स्पेक्ट्रोफोटोमीट्रिक डेटा (volumetric माप) के बीच एक सीधा तुलना उचित.

आँकड़ा समुच्चय(चित्र 8) ने संकेत दिया है कि उच्च वर्णक सांद्रता एक अल्पामूल्यन की ओर ले जाती है, जबकि कम वर्णक सांद्रता वास्तविक मान के अति-आकलन की ओर ले जाती है। इस प्रभाव फिल्टर केक की मोटाई द्वारा समझाया जा सकता है और इसलिए, नमूना की volumetric चरित्र. लेजर प्रवेश गहराई ऑप्टिकल घनत्व और नमूना की मोटाई पर निर्भर करता है. उच्च वर्णक सामग्री को कम करके आंका गया क्योंकि लेजर गहरी परतों में वर्णक फ्लोरोसेंट प्रेरित नहीं कर सका. हालांकि, पतली फिल्टर केक में, कम फ्लोरोसेंट संकेतों pigments के कम क्षेत्र घनत्व के कारण कब्जा कर लिया गया. जाहिर है, फिल्टर ही 450 एनएम लंबे समय से पास फिल्टर पारित करने के बाद लेजर प्रेरित संकेत दिखाया (चित्र 12). इस संकेत को क्लएसे व्युत्पन्न फ्लोरोसेंट संकेत के रूप में भ्रामक रूप से गिना गया था . इस प्रकार, पतली और बहुत मोटी फिल्टर केक L.I.F.E. साधन के साथ मापने के लिए मुश्किल कर रहे हैं.

Figure 12
चित्र 12: एक GF/F फिल्टर पर मोटी (A) और पतली (B) फिल्टर केक से फ्लोरोसेंट संकेत। (ए)स्व-शेडिंग लेजर-प्रेरित फ्लोरोसेंट को गहरी परतों से रोकता है, जिसके परिणामस्वरूप वास्तविक वर्णक एकाग्रता का कम करके आँका जाता है। (बी) फिल्टर प्रतिबिंब द्वारा ओवरले के साथ फिल्टर केक से फ्लोरोसेंट उत्सर्जन। (ग) कच्चे डेटा फिल्टर परावर्तन (ग्रे) दिखाते हैं। एक प्रयोगशाला के वर्णक्रमीय गुण गुण प्राप्त chlएक फ्लोरोसेंट पैटर्न लाल रंग में सचित्र है. स्केल बार - 45 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एल.आई.एफ.ई. प्रोटोटाइप की सीमाएं
डेटा में कमी के दौरान, MATLAB कोडित सॉफ्टवेयर एक दिया तरंगदैर्ध्य रेंज के भीतर पिक्सेल लाइनों संक्षेप द्वारा कच्चे छवियों की व्याख्या की. सॉफ्टवेयर के वर्तमान संस्करण कार्बनिक और अकार्बनिक व्युत्पन्न संकेतों के बीच अंतर नहीं किया. एकाधिक संकेतों की उपस्थिति वास्तविक वर्णक सामग्री का एक overestimation करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. कम फ्लोरोसेंट तीव्रता के कारण लंबे समय तक जोखिम के कारण सिग्नल-टू-शोर अनुपात में कमी आई, जो ऊपर वर्णित प्रभाव को बढ़ावा दे रहा था (चित्र 8 और चित्र 12देखें)।

चित्र 13 में दर्शाए गए भू-प्रदर्शक शैल में हरे और नीले प्रकाश के साथ उजागर होने पर लाल फ्लोरोसेंट प्रकाश का प्रदर्शन किया गया। वर्तमान में, यह स्पष्ट नहीं है कि फ्लोरोसेंट खनिजों से या porphyrin आधारित अणुओं से हुई है. इसलिए, जैविक और nonbiological संकेतों का एक ओवरले इस विधि के आवेदन को सीमित कर सकते हैं और विशेष रूप से L.I.F.E. प्रोटोटाइप के लिए किए गए एक फ्लोरोसेंट डेटाबेस की स्थापना की आवश्यकता होती है।

Figure 13
चित्र 13: एक भू-ड चट्टान से खनिज फ्लोरोसेंट, Ny-lesund में पाया. यह चट्टान 532 एनएम 50 मीटर डब्ल्यू लेजर (ए) और 405 एनएम 50 मीटर डब्ल्यू लेजर (बी) से उत्साहित थी . दोनों तस्वीरें एक ध्रुवीकरण लेंस पर संलग्न फिल्टर के साथ कब्जा कर लिया गया, जो वास्तविक फ्लोरोसेंट रंग के एक मिथ्याकरण के लिए नेतृत्व किया. (सी) दिन के उजाले की स्थिति के तहत एक ध्रुवीकरण फिल्टर के उपयोग के बिना सही रंग छवि. स्केल बार - 40 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Beutler और अन्य29 निष्कर्ष निकाला है कि समुद्री पारिस्थितिकी प्रणालियों में cyanobacteria की विशेषता उत्सर्जन स्पेक्ट्रम पर्यावरण की स्थिति पर निर्भर करते हैं. इसके अलावा, चयापचय अवस्था का प्रकाशपोषी जीवों में फ्लोरोसेंट गुणों पर प्रभाव पड़ता है30. एल.आई.एफ.ई. उपकरण पर्यावरणीय स्थितियों से संबंधित नमूने की वर्णक्रमीय जानकारी वाले जैव-फिंगरप्रिंट पुस्तकालयों का उपयोग करके शैवाल और सायनोबैक्टीरियल फ्लोरोसेंट पैटर्न के बीच अंतर कर सकता है।

अंधेरे में adapted chlएक अणुओं, सभी प्रतिक्रिया केन्द्रों पूरी तरह से ऑक्सीकरण कर रहे हैं और photochemistry के लिए उपलब्ध है और कोई फ्लोरोसेंट उपज31बुझा दिया है. L.I.F.E. प्रक्रिया का उपयोग करना, एक नमूना पहले एक 532 एनएम लेजर (हरी) और फिर एक 405 एनएम लेजर (नीले) के साथ उत्साहित है. नीले लेजर द्वारा दूसरी उत्तेजना के दौरान, chlएक हरे लेजर द्वारा पूर्व उत्तेजना के कारण एक कम फ्लोरोसेंट प्रतिक्रिया दिखा सकता है. चlएक अवशोषण अधिकतम तरंगदैर्ध्य32से दूरी के बावजूद 532 दउ तरंगदैर्ध्य पर ऊर्जा अवशोषित करता है। 405 एनएम पर वास्तविक chlएक माप से पहले, हरी लेजर photochemical प्रतिक्रियाओं का कारण हो सकता है, लक्ष्य pigments में शमन तंत्र को सक्रिय. इसके अतिरिक्त समुद्री प्रकाशपोषी जीवों के पूर्व-प्रदीपन से 450 दउ-600 दउ के बीच वर्णक्रमीय प्रमेय वक्रों में परिवर्तन नहीं हुआ जबकि फ्लोरोसेंट तीव्रता में मानक विचलन में 25%29की वृद्धि हुई। प्रजातियों पर निर्भर करता है, फ्लोरोसेंट तीव्रता भी पूर्व उत्तेजना के जवाब में वृद्धि हुई. इस विषय को आगे की जांच की आवश्यकता है.

लागू
हमने क्रायोकोइट छेदों पर जोर देने के साथ विभिन्न आवासों में एल.आई.एफ.ई. उपकरण का परीक्षण किया। माप के दौरान परिवेश प्रकाश की अनुपस्थिति के कारण लेजर को मिट्टी और बायोफिल्म आवासों में सफलतापूर्वक लागू किया गया था। क्रायोकोलाइट कणिकाओं को तब मापा जा सकता था जब तलछट की परतें होल के नीचे से प्रकाश को अवरुद्ध करती हैं (चित्र 14क,ब्) पतली तलछट क्रायोकोलाइट छिद्र नीचे से आवारा प्रकाश के लिए पारगम्य थे (चित्र 14ख) आवारा प्रकाश माप के साथ हस्तक्षेप करता है। इस प्रकार, नंगे बर्फ सतहों में वर्णक एकाग्रता अभी तक दिन के उजाले की स्थिति के तहत औसत दर्जे का नहीं है. सिग्नल प्रसंस्करण के प्रयास वर्तमान में उच्च परिवेश प्रकाश की स्थिति में प्रणाली के संचालन को सक्षम करने के लिए चल रहे हैं।

Figure 14
चित्र 14: शीर्ष पर तरल पानी के साथ Cryoconite छेद. (ए) एल.आई.एफ.ई. लेंस ट्यूब के साथ हिमनद पर क्रायोकोलाइट। स्केल बार - 70 मिमी (ठ) तलछट परत (लाल) बहुत पतली होती है। क्रायकोनाइट परत के माध्यम से आवारा प्रकाश खून बह रहा है। (ग)तलछट परत इतनी मोटी होती है कि वह नीचे से भटके हुए प्रकाश को अवरुद्ध कर देगी। cryoconite छेद के इस प्रकार के L.I.F.E. साधन के साथ औसत दर्जे का है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अंत में, हमारे एल.आई.एफ.ई. यंत्र ने स्थलीय आवासों जैसे मिट्टी, जीवाणु मैट, बायोफिल्म्स और हिमनदीय सतहों पर क्रायोकोइट छिद्रों में फोटोऑटोट्रॉफिक जीवों का पता लगाया। लक्ष्य अणु थे chla और B-PE. स्थानिक संकल्प 30 डिग्री मीटर/ सीएमए के लिए पता लगाने की सीमा 250 pg/mL और 2 एनजी/एमएल बी-पीई के लिए थी। एक प्रयोगशाला अंशांकन के बाद हम नमूने है कि आर्कटिक में हमारे अध्ययन साइट पर एकत्र किए गए थे में वर्णक सामग्री मात्रा निर्धारित करने में सक्षम थे. हम एक स्वचालित डेटा में कमी की प्रक्रिया के लिए स्वयं क्रमादेशित सॉफ्टवेयर लागू किया. खनिजों की उपस्थिति और माप के दौरान प्रकाश की स्थिति बदलने के प्रभाव आगे की जांच की आवश्यकता है.

जलवायु वार्मिंग के साथ, बढ़ते तापमान तरल पानी की बढ़ी हुई उपलब्धता का कारण बनते हैं, जिसके परिणामस्वरूप ऑटोट्रॉफिक और विषमपोषी प्रकृति की बर्फीली सतहों पर उच्च जैविक गतिविधि होती है। क्राईमोस्फीयर में सक्रिय जीवन की पूरी तस्वीर देने के लिए विषमपोषी जीवों का पता लगाने के लिए जोरदार प्रयास किए जाने चाहिए। यह अन्य लक्ष्य pigments और उचित लेजर उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के साथ परीक्षण किया जा सकता है. इसलिए, एल.आई.एफ.ई. एक उपयुक्त निगरानी प्रणाली प्रदान करता है जो वैश्विक परिवर्तन के साथ-साथ संभावित खगोल-जैविक अनुप्रयोगों के संदर्भ में अधिहिमानी स्थितियों के लिए उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प प्रदान करता है।

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों ने आभार कर्नल (आईएल) जे.एन. प्रिट्जकर, तवानी फाउंडेशन, संयुक्त राज्य अमेरिका, ऑस्ट्रिया के विज्ञान, अनुसंधान और अर्थव्यवस्था मंत्रालय (स्पार्कलिंग विज्ञान SPA04$149 और SPA05]201), अल्पाइन Forschungstelle Obergurgl (एएफओ), ऑस्ट्रिया ईएसफोरम ( [WF), Hintertuxer Natur Eis Palast से रोमन Erler, ऑस्ट्रिया के संघीय वानिकी और बेस प्रबंधक निक कॉक्स Ny Alesund (Svalbard) में आर्कटिक स्टेशन से. हम भी सबरीना Obwegeser, करीना Rofner, और फैबियन Drewes फिल्माने के दौरान उनकी मदद के लिए ऋणी हैं. अंत में, हम सहवर्ती वीडियो के लिए आवाज देने के लिए जेम्स ब्राडली शुक्रिया अदा करना चाहता हूँ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
aceton Merck 67-64-1
B-Phycoerythrin Invirtrogen P6305
Chlorophyll a standard Sigma-Aldrich C6144-1MG
formaline Merck HT501128 36%
GF/C filters Whatman WHA1822025 25mm diameter
HCl Merck H1758 36,5-38%
L.I.F.E. Prototype University of Innsbruck built on demand
LabView National Instruments Software, Laboratory Virtual Instrumentation Engineering Workbench
Leucine, L-[4,5-3H], 1 mCi Perkin Elmer NET1166001MC radioactive
Liquid scintillation cocktail Beckman Ready Use Beckman not more available, can be compensated by Ultra Gold, Packard
liquid scintillation counter Beckman out of stock LSC 6000 IC
NaH14CO3 (4 µCi/ml) DHI Denmark 4 μCi/ml, 1 ml radioactive
Osmonics polycarbonate filters DHI Denmark PCTE 25mm diameter, 0,2µm pore size
Polyscintillation vials Perkin Elmer WHA1825047 20ml
sample tubes Sigma Aldrich T2318-500EA Greiner centrifuge tubes, 50ml
Spectrophotometer Hitachi NA Model U2001, any photometer for absorption spectroscopy measuring at 664nm and 750nm would be appropriate
trichloric acetic acid (TCA) Merck T6399 100%
ultrasonic probe nano lab QS1T-2

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References

  1. Boyd, E. S., Skidmore, M., Mitchell, A. C., Bakermans, C., Peters, J. W. Methanogenesis in subglacial sediments. Environmental Microbiology Reports. 2, 685-692 (2010).
  2. Sattler, B., Puxbaum, H., Psenner, R. Bacterial growth in supercooled cloud droplets. Geophysical Research Letters. 28, 239-242 (2001).
  3. Good, P., et al. A review of recent developments in climate change science. Part I: Understanding of future change in the large-scale climate system. Progress in Physical Geography. 35, 281-296 (2011).
  4. Fountain, A. G., et al. The Disappearing Cryosphere: Impacts and Ecosystem Responses to Rapid Cryosphere Loss. BioScience. 62, 405-415 (2012).
  5. Rignot, E., Mouginot, J., Morlighem, M., Seroussi, H., Scheuchl, B. Widespread, rapid grounding line retreat of Pine Island, Thwaites, Smith, and Kohler glaciers, West Antarctica, from 1992 to 2011. Geophysical Research Letters. 41, 3502-3509 (2014).
  6. McMillan, M., et al. Increased ice losses from Antarctica detected by CryoSat-2. Geophysical Research Letters. 41, 3899-3905 (2014).
  7. Barletta, V. R., et al. Glacier shrinkage and modeled uplift of the Alps. Geophysical Research Letters. 33, 14307 (2006).
  8. Nuth, C., et al. Decadal changes from a multi-temporal glacier inventory of Svalbard. The Cryosphere. 7, 1603-1621 (2013).
  9. Takeuchi, N., Kohshima, S., Seko, K. Structure, formation, and darkening process of albedo-reducing material (cryoconite) on a Himalayan glacier: A granular algal mat growing on the glacier. Arctic Antarctic and Alpine Research. 33, 115-122 (2001).
  10. Takeuchi, N. Optical characteristics of cryoconite (surface dust) on glaciers: the relationship between light absorbency and the property of organic matter contained in the cryoconite. Annals of Glaciology. 34, 409-414 (2002).
  11. Anesio, A. M., Hodson, A. J., Fritz, A., Psenner, R., Sattler, B. High microbial activity on glaciers: importance to the global carbon cycle. Global Change Biology. 15, 955-960 (2009).
  12. Anesio, A. M., et al. Carbon fluxes through bacterial communities on glacier surfaces. Annals of Glaciology. 51, 32-40 (2010).
  13. Storrie-Lombardi, M. C., Sattler, B. Laser-Induced Fluorescence Emission (L.I.F.E): In Situ Nondestructive Detection of Microbial Life in the Ice Covers of Antarctic Lakes. Astrobiology. 9, 659-672 (2009).
  14. Murray, A. E., et al. Microbial life at -13 °C in the brine of an ice-sealed Antarctic lake. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20626-20631 (2012).
  15. Edwards, A., et al. A distinctive fungal community inhabiting cryoconite holes on glaciers in Svalbard. Fungal Ecology. 6, 168-176 (2013).
  16. Miteva, V. Bacteria in Snow and Glacier Ice. Psychrophiles: from Biodiversity to Biotechnology. Margesin, R., Schinner, F., Marx, J. C., Gerday, C. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin/Heidelberg, Germany. 31-50 (2008).
  17. Yallop, M. L., et al. Photophysiology and albedo-changing potential of the ice algal community on the surface of the Greenland ice sheet. The ISME Journal. 6, 2302-2313 (2012).
  18. Edwards, A., et al. A metagenomic snapshot of taxonomic and functional diversity in an alpine glacier cryoconite ecosystem. Environmental Research Letters. 8, 035003 (2013).
  19. Remias, D., et al. Characterization of an UV-and VIS-absorbing, purpurogallin-derived secondary pigment new to algae and highly abundant in Mesotaenium berggrenii (Zygnematophyceae, Chlorophyta), an extremophyte living on glaciers. FEMS Microbiology Ecology. 79, 638-648 (2012).
  20. Cook, J., et al. An improved estimate of microbially mediated carbon fluxes from the Greenland ice sheet. Journal of Glaciology. 58, 1098-1108 (2012).
  21. Mueller, D. R., Vincent, W. F., Pollard, W. H., Fritsen, C. H. Glacial cryoconite ecosystems: a bipolar comparison of algal communities and habitats. Nova Hedwigia Beiheft. 123, 173-198 (2001).
  22. Morgan-Kiss, R. M., Priscu, J. C., Pocock, T., Gudynaite-Savitch, L., Huner, N. P. A. Adaptation and Acclimation of Photosynthetic Microorganisms to Permanently Cold Environments. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70, 222-252 (2006).
  23. Hodson, A., et al. The cryoconite ecosystem on the Greenland ice sheet. Annals of Glaciology. 51, 123-129 (2010).
  24. Tilg, M., et al. L.I.F.E.: laser induced fluorescence emission, a non-invasive tool to detect photosynthetic pigments in glacial ecosystems. Proceedings SPIE. 8152, Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology XIV, 81520I. , (2011).
  25. Lorenzen, C. J. Determination of chlorophyll and pheo-pigments: spectrophotometric equations. Limnology & Oceanography. 12, 343-346 (1967).
  26. Kirchman, D. Measuring bacterial biomass production and growth rates from leucine incorporation in natural aquatic environments. Methods in Microbiology. , 227-238 (2001).
  27. Bell, R. T. Estimating production of heterotrophic bacterioplankton via incorporation of tritiated thymidine. Handbook of methods in aquatic microbial ecology. Edited by. Kemp, P. F., Cole, J. J., Sherr, B. F., Sherr, E. B. , CRC press. Boca Raton, FL. 495-503 (1993).
  28. Groemer, G., et al. Field trial of a dual-wavelength fluorescent emission (L.I.F.E.) instrument and the Magma White rover during the MARS2013 Mars analog mission. Astrobiology. 14, 391-405 (2014).
  29. Beutler, M. Spectral fluorescence of chlorophyll and phycobilins as an in situ tool of phytoplankton analysis-models, algorithms and instruments. , Christian-Albrechts Universität Kiel. Doctoral dissertation (2003).
  30. Krogmann, K. D. Discoveries in Oxygenic Photosynthesis (1727-2003): A Perspective. Photosynthesis Research. 80, 15-57 (2004).
  31. Corrêa, D. S., et al. Reverse saturable absorption in chlorophyll A solutions. Journal of Applied Physics B. 74, 559-561 (2002).
  32. Kaňa, R., et al. The slow S to M fluorescence rise in cyanobacteria is due to a state 2 to state 1 transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1817, 1237-1247 (2012).

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पर्यावरण विज्ञान अंक 152 लेजर प्रेरित फ्लोरोसेंट उत्सर्जन (L.I.F.E.) गैर इनवेसिव क्रायोगोलिक निवास स्थान बर्फ phycoerythrin क्लोरोफिल हिमनद पिघल
लेजर-प्रेरित फ्लोरोसेंट उत्सर्जन (L.I.F.E.) Cryososphere habits में Biomarkers के इन-सीटू मापन के लिए उपन्यास गैर इनवेसिव उपकरण के रूप में
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Weisleitner, K., Hunger, L., Kohstall, C., Frisch, A., Storrie-Lombardi, M. C., Sattler, B. Laser-Induced Fluorescence Emission (L.I.F.E.) as Novel Non-Invasive Tool for In-Situ Measurements of Biomarkers in Cryospheric Habitats. J. Vis. Exp. (152), e60447, doi:10.3791/60447 (2019).

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