Summary
Kolflöden i kryosfären bedöms knappast ännu men är avgörande för klimatförändringarna. Här visar vi en ny prototyp enhet som fångar den fototrofiska potentialen i supraglaciala miljöer baserade på laserinducerad fluorescens emission (L.I.F.E.) teknik som erbjuder hög spektrala och rumsliga upplösning data under in situ förhållanden.
Abstract
Den globala uppvärmningen påverkar mikrobiella samhällen i en mängd olika ekosystem, särskilt kryosfäriska miljöer. Men lite är känt om mikrobiella-medierade kolflöden i extrema miljöer. Metoden för provtagning som beskrivs i de mycket få studier som finns innebär därför två stora problem: A) högupplösta data kräver ett stort antal prover, vilket är svårt att få i avlägsna områden. B) oundviklig prov manipulation såsom skärning, sågning och smältning av iskärnor som leder till en missuppfattning av in situ-förhållanden. I denna studie presenteras en prototyp apparat som varken kräver provberedning eller prov destruktion. Enheten kan användas för insitu-mätningarmed en hög spektraloch rumslig upplösning i terrestra och isens ekosystem och är baserad på Laser-i av Ff EMission (L.I.F.E.) teknik. Photoautotrophic supraglacial samhällen kan identifieras genom detektion av L.I.F.E. signaturer i photopigment. L.I.F.E. instrumenterar kalibreringen för porphyrinen derivat klorofylla (CHLa) (405 nm Laser-magnetisering) och b-phycoerythrin (b-PE) (532 nm Laser-magnetisering) demonstreras. För validering av denna metod ratificerades L.I.F.E. data av en konventionell metod för CHLen kvantifiering som involverade pigment utvinning och efterföljande absorptionsspektroskopi. Prototypen tillämplighet i fältet har bevisats i extrema polarmiljöer. Ytterligare tester på terrestra livsmiljöer ägde rum under mars analoga simuleringar i den marockanska dessert och på en österrikisk stenglaciär. L.I.F.E.-instrumentet möjliggör högupplöst skanning av stora områden med godtagbar drift logistik och bidrar till en bättre förståelse av den ekologiska potentialen hos supraglaciala samhällen i samband med global förändring.
Introduction
Kryosfären hamnar havsis, glaciärer, höga fjällsjöar, snö områden, Lake Ice, smälta vatten strömmar, och permafrost. Dessa områden täcker cirka 11% av jordens landområden1,2och är överarade av atmosfären som en erkänd kryosfärisk miljö. Nyligen genomförda studier visar att massiva områden i kryosfären snabbt reträtt3,4. Antarktis5,6, Alperna7, Arktis8, och andra regioner visar negativa is massa saldon. Reträtt av is mössor och glaciärer leder till utarmning av vår största sötvatten reservoar på jorden. I vissa områden är Glacier Retreat ostoppbar5.
Under en lång tid betraktades iseko system som sterila miljöer. Men trots tuffa förhållanden är närvaron av ett aktivt liv i jordens kryosfär uppenbar9,10,11,12,13,14,15 . På grund av trenden mot massiva förluster av is genom smältning, kryosfären genomgår en förskjutning i biologisk aktivitet, som påverkar angränsande livsmiljöer. För att förstå dessa delvis oåterkalleliga förändringar kräver vi metoder för att undersöka biologisk aktivitet i is under in situ-förhållanden med hög rumslig och tidsmässig upplösning.
I supraglacial miljöer, liv kan hittas i cryoconite hål, snötäcke, smältvatten, bäckar, och på kala isytor. Men den mest uppenbara supraglacial livsmiljöer är cryoconite hål. De uppträder globalt i glacierade miljöer och beskrevs första gången av den svenske upptäcktsresande Adolf Erik nordenskjold under en expedition till Grönland på 1870-talet16,17. Namnet härstammar från de grekiska orden "kryos" (kallt) och "Konia" (damm). Aeolian-derived mörkt organiskt och oorganiskt skräp fäster på isen ytan och minska albedo lokalt. Solstrålning främjar smältning av skräp i djupare is lager, bildar cylindriska bassänger med sediment (cryoconite) i botten9. Cryoconite hål täcker 0.1-10% av glaciala ablation zoner11.
Cryoconite samhällen består av virus, svampar, bakterier, cyanobakterier, mikroalger, och protozoer. Beroende på region, metazoan organismer såsom rotifers, nematodes, copepods, tardigrades, och insektslarver kan också hittas. Edwards och andra18 beskriver cryoconite hål som "Ice-Cold hotspots". De spårade också funktionella gener i cryoconite hål som är ansvariga för N, Fe, S, och P cykling. Mini Lake ekosystem andas och syntes till priser som finns i mycket varmare och mer näringsrika livsmiljöer11. Dessa fynd betonar den viktiga roll mikrobiell upptagning i supraglacial miljöer. Bredvid levande samhällen i kryoconite hål, kala is ytor är bebodda av isalger. Deras fysiologi är väl studerat19 men deras rumsliga fördelning har inte utvärderats20. Deras närvaro i supraglacial miljöer minskar albedo och därmed främjar smältning som leder till ett näringsämne utåt och näringsämne in i nedströms livsmiljöer9. Ökande temperaturer och därmed, en högre tillgänglighet av flytande vatten, påverkar netto ekosystem produktiviteten i dessa isiga ekosystem.
I supraglacial miljöer, fotosyntetiskt aktiva organismer omvandla oorganiska kol och kväve till organiska, tillgängliga källor för den mikrobiella livsmedel webben21,22. Fram till nu finns det få studier som uppskattar supraglacial kolflöden11,20,23. Avvikelsen i föreslagna satser av Carbon Flux resultat från en låg spatial och temporal data upplösning. Ytterligare, den rumsliga fördelningen av supraglacial samhällen utanför cryoconite hål bedöms knappt. Cook och andra20 förutspådde i sina modeller som supraglacial alg samhällen fixa upp till 11x mer kol än samtida cryoconite hål på grund av deras stora yta täckning. Upptäckten av supraglacial alger samhällen säkra prov integritet fortfarande hindras på grund av saknade verktyg för in situ detektering och kvantifiering.
Som svar på logistikproblem studeras mindre ofta iseko system än livsmiljöer i tempererade områden. Data upplösningen beror på hur många prover som bedöms och är beroende av tillgängligheten för studieplatserna. Standard metoder för provtagning såsom sågning, Coring och efterföljande smältning innebär manipulation av den mikrobiella gemenskapen. Till exempel är klorofylla (CHLa) bedömning i fasta isprover omöjligt med standardmetoder utan betydande inblandning. Därför är smält-inducerad temperaturförändringar inom de undersökta mikrobiella samhällen oundvikliga. Som svar på thermolability av system II och andra cellulära strukturer i psychrophiles22, laboratorieanalyser av smält is prover kommer alltid att leda till en förfalskning av in situ villkor.
Icke-förstörande in situ-mätningar är det enda rimliga sättet att få tillförlitliga data. Detta mål kan uppnås med hjälp av fluorescensbaserade metoder. På grund av sin lätta skörd funktion, CHLa och b-phycoerythrin (B-PE) finns i organismer som bidrar till kolcykeln i supraglacial miljöer, som har bevisats av Anesio och andra11. Därför är dessa fluorescerande molekyler lämpliga biomarkörer för kvantifiering av mikrobiella medierade kolflöden i iseko system.
I denna studie presenterar vi utvecklingen, kalibreringen och tillämpligheten av ett nytt icke-invasivt verktyg för in situ-kvantifiering av CHLa -och B-PE-molekyler i terrestra och isens ekosystem. Prototyp enheten är baserad på laserinducerad fluorescerande strålning, även känd som L.I.F.E. Den optiska instrument (figur 1) fångar fluorescerande biomarkör signaturer efter laserinducerad fluorescens excitation. Förfarandet är oförstörande och kan utföras på studieplatsen eller i ett laboratorium.
Figur 1: L.I.F.E.-prototypen. Vänster: Foto av instrumentet utan skyddslock. Höger: Schematisk illustration av instrumentet. Total massa = 5,4 kg (laser och optik = 4,025 kg, laptop = 1,37 kg). Aluminiumram = 32,5 cm x 20,3 cm x 6,5 cm. optiskt rör: 18,4 cm x 4 cm (diameter). CCD: bluefox mv220g sensor; F: servostyrda lång pass filter (450 nm och 550 Nm); L: optiska linser; M1: speglar; M2: Dichroic spegel; MC: MicroController; P: Prisma; PBS: polariserande balk splitter; S: slits bländare gjord av justerbara rakblad. Scale bar = 70 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den bärbara Dual-våglängd kit väger 4,5 kg och används på ett stativ i kombination med en extern dator. Det går snabbt och enkelt att konfigurera fält. Instrumentet är anslutet till stativet och lins röret är anslutet till enheten tillsammans med en USB-kabel och kamerakabeln. Den externa datorn är ansluten till instrumentet med en USB-kabel. Stativet benen är justerade på ett sådant sätt att linsen röret är riktad mot och täcker preparatet. Sedan, en 5 mW grön laser träffar provet efter att ha passerat en polariserande balk splitter som omdirigerar polariserat ljus mot den optiska axeln av spektrometern. Preparatet uppvisar ett lysrörsljus, illustrerat i rött i figur 1. Hälften av det kollimerade ljuset passerar polariserande balk splitter och är fokuserad genom ett servo-styr lång pass filter som tar bort laser signalerna. Nästa, signalen träffar en bländare slits som består av två justerbara rakblad. En prisma spektralt separerar den fina linjen av ljus ortogonalt till slits bländare innan signalen fångas av sensorn. Proceduren upprepas med en blå laser. Rådata överförs automatiskt till en bärbar dator som också används för programvaru åtgärden.
Instrumentet styrs av en extern dator med en LabVIEW-miljö som synkroniserar bildtagning med CCD-kameran, slår på/av lasrar och roterar långa pass filter hjulet. Det grafiska användargränssnittet (GUI) är indelat i tre huvudavsnitt. Exponerings justeringen görs manuellt. Även om korrigeringen mellan exponeringstid och signalintensitet är linjär (figur 2b) är den maximala exponeringstiden begränsad till 10 s eftersom längre integrations tider leder till en signifikant minskning av signal-brus-förhållandet. Kommentarsfältet används för beskrivningen av provet (figur 2A). I den högra delen visas RAW-bilder så snart mätningarna är klara. Denna funktion är avgörande för omedelbar datautvärdering på fältet (figur 2C – E). Röda områden indikerar överexponerade pixlar, som kan undvikas genom att minska exponeringstiden.
Den efterföljande RAW data minskning processen är frikopplad från bilden förvärvs förfarande och kan göras när som helst efter bild förvärv.
Figur 2: L.I.F.E. grafiskt användargränssnitt för datainsamling och rådata utvärdering. (A) programvaran möjliggör manuell textinmatning för prov beskrivningar. (B) exponeringstiden kan justeras före mätningen. (C − E) RAW-bilder visas på höger sida av gränssnittet. (E) röda färger indikerar en mättnad av sensorn. (F) aktiveringen av knappen Kör mätning utlöser datainsamlingsprocessen. I matrisen (G) visas alla kommandon som körs automatiskt vid datainsamling. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: exempel på en RAW-bild. Vänster: Rådata för CHLen standard i aceton lösning, inspelad med L. I. F. E instrumentet. På grund av enhetens optiska egenskaper visas signalen som en skev linje. Höger: Tolkning av RAW-bild per pixel (px). Spektralaxeln (5 NM/px-upplösning) ritas mot den rumsliga axeln (30 μm/px-upplösning). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den 12-bitars gråskalan RAW-bilder visar en rumslig komponent på grund av den endimensionella bländare slits och en spektralkomponent på grund av prismat framför CCD (figur 3). Som svar på optiska begränsningar är RAW-bilderna förvrängda. Därför måste de beskäras och dewarped genom att tillämpa en kod som erkänner graden av distorsion. Detta görs med en Programvaruguide (figur 4). Därefter är våglängdskalibreringen klar med 532 nm-lasern. Den gröna lampan är producerad av frekvens fördubblingen av en 1 064 nm infraröd laser. Båda våglängderna kan detekteras av CCD och därför kan den spektrala positionen för varje pixel beräknas i dewarped bilder automatiskt (figur 4).
Bilden beskärs sedan ner till ett givet våglängdsområde (550 – 1000 Nm för gröna lasermätningar och 400 – 1000 för blå lasermätningar). Gråvärden från varje pixel i en markerad pixel rad räknas och summeras. Ett grått värde kan vara mellan 0 – 255. Därefter står varje pixel rad för ett nummer. Ytterligare programvaru instruktioner på skärmen leder till generering av en tomt som visar grå värdes antalet från varje pixel linje som ritas mot de rumsliga koordinaterna. Detta möjliggör en kvantitativ rumslig diskriminering av CHLa och B-PE samtidigt i provet. Dessutom kan de spektrala egenskaperna för ett prov ritas automatiskt från valda pixel rader.
Figur 4: Dewarping RAW-bilder. Vänster: RAW-bild fångas med en grön laser. Inget filter användes. Signalerna visas vid 532 nm och 1 064 nm. Exponeringstid = 0,015 s. centrera: den beskurna 532 nm signalerar används som en hänvisa till fodrar för att korrigera fiskögeförvrängda en uppsättning av avbildar. Höger: Den dewarped bilden från RAW-bildkälla. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Protocol
1. kalibrering och validering
Anmärkning: för pigment kalibrering, Förbered utspädnings rader från stamlösningar av CHLa och B-PE. Den CHLen stamlösning späds med aceton och B-PE späds med destillerat sterilt vatten. Därefter kommer 15 mL av varje spädningssteg att behövas. Skydda pigmenten från ljus genom att Linda dem med aluminiumfolie. Förvara CHLa i en frys och B-PE i kylskåp tills vidare användning. Ett detaljerat protokoll för utspädnings raden följer i avsnitten 1,1 för CHLa och 1,2 för B-PE. Både CHLa och B-PE laboratorie kalibrering för pigment detektering och kvantifiering med L.I.F.E. instrumentet beskrivs nedan. En tidigare kalibrering24 gjordes med samma pigment som i denna studie.
-
Klorofyllen utspädnings rad
- Lös upp 1 mg CHLa (renat från a. nidulans alger) med aceton i ett prov rör på 50 ml och späd denna CHLen stamlösning med aceton till följande slutliga koncentrationer: 1 000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20 10 5 1 och 0,5 ng/mL.
- Överför 15 mL av varje spädning till 50 mL provrör och täck dem i aluminiumfolie på grund av ljuskänslighet. Förvara rören i en-20 ° c frys tills kalibrerings mätningarna är tagna.
Obs: protokollet kan avbrytas här. - Mät CHLa absorptionsfunktioner från varje utspädning i en dubbelstrålspektrofotometer som tre exemplar och beräkna CHLa -halten enligt Lorenzen25, som beskrivs i detalj i avsnitt 2.2.2.
-
PE-utspädnings rad
- Späd en 4 mg/mL B-PE stamlösning med sterilt filtrerat vatten (pH = 7) till följande slutliga koncentrationer: 1 000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20 10 och 5 ng/mL B-PE. Överför 15 mL av varje spädning i ett prov rör på 50 mL och täck det med aluminiumfolie. Förvaras vid 4 ° c tills det används ytterligare.
Obs: protokollet kan avbrytas här.
- Späd en 4 mg/mL B-PE stamlösning med sterilt filtrerat vatten (pH = 7) till följande slutliga koncentrationer: 1 000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20 10 och 5 ng/mL B-PE. Överför 15 mL av varje spädning i ett prov rör på 50 mL och täck det med aluminiumfolie. Förvaras vid 4 ° c tills det används ytterligare.
-
Inställning för kalibrering
- Bygg ett rack som visas i figur 5 för att etablera tre mätplattformar, var och en 1,5 cm högre än nästa.
Obs: rack-och pelar höjden spelar en viktig roll för mätningarna eftersom vätskors yta ska ligga kvar i L.I.F.E. instrumentets brännpunkt enligt figur 5. - Tillsätt 5 mL av den högsta koncentrerade spädningen i en plastflaska av polyscintillation och placera den på den högsta punkten i racket. Mät fluorescensintensiteten.
- Placera injektionsflaskan i mittenpositionen av racket och tillsätt ytterligare 5 mL (10 mL total volym). Mät fluorescensintensiteten. Upprepa proceduren vid det lägsta läget på racket med ytterligare 5 mL (15 mL total volym, totalt 45 mm i kolonnhöjd).
Obs: anpassa exponeringstiden för varje spädningssteg för att förhindra detektormättnad (gråvärden över 255 i 12-bitars bilder) och för ett tillräckligt signal-brus-förhållande för svaga fluorescens-signaler. - Upprepa steg 1.3.2 och 1.3.3 med alla utspädningar (steg 1.1.1 och 1.2.1) av CHLa och B-PE.
- Läs in de genererade datafilerna i guiden för data reducering för att automatiskt räkna och summera de grå värdena från varje pixel rad längs Y-axeln (spatial fördelning).
Obs: varierande exponeringstider kompenseras automatiskt genom att normalisera fluorescensintensiteten till en integrations tid på 1 s. - Beräkna pigment områdes tätheten med en Poissonregressions analys med hjälp av de kända koncentrationerna från utspädnings serien och de normaliserade fluorescensintensiteterna som beräknades. Normalisera sedan fluorescensantalet från de tre olika kolumn höjderna till 1,5 cm (5 mL) genom att multiplicera antalet från varje kolumnhöjd med en faktor (faktorerna 1, 0,5 och 0,33, för 5 mL, 10 mL respektive 15 mL koncentrations lösningar).
- Bygg ett rack som visas i figur 5 för att etablera tre mätplattformar, var och en 1,5 cm högre än nästa.
Figur 5: inställning för L.I.F.E. kalibrering med CHLa och B-PE under laboratorieförhållanden.
(A) instrumentets lins rör. B) grön laser för b-PE excitation. (C) blå laser förCHL excitation. D) scintillationinjektionsflaska. E) L.I.F.E. instrumentets brännpunkt. F) B-PE/vatten eller CHLa/aceton lösning med 5 ml, 10 ml och 15 ml. Gdistaner som håller ytan på varje lösning i fokalplanet för tre olika volymer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. provtagning och provberedning
- Insamling av snö och is
- Samla snö och supraglacial is från en glaciär till sterila polyeten påsar och förvara dem frysta tills vidare bearbetning.
Anmärkning: för denna studie samlades proverna in vid Midtre Lovenbreen (MLB), en polytermisk glaciär nära forskningsbyn Ny-Ålesund i den höga arktiska skärgården i Svalbard (78 ° 53 ' N, 12 ° 03 ' E). - Prov bakterie mattor från glaciären forefield i sterila polyeten påsar och transportera alla prover till ett laboratorium för vidare bearbetning.
- Smält fryst material långsamt i mörker vid 4 ° c. Filtrera vätske prov på GF/F-filter (47 mm diameter) och anteckna den filtrerade volymen. Behåll filtren frysta tills vidare bearbetning.
- Samla snö och supraglacial is från en glaciär till sterila polyeten påsar och förvara dem frysta tills vidare bearbetning.
- Klorofylla mätningar
- Med hjälp av L.I.F.E. instrumentet, Mät filtret i fyra slumpmässiga områden, vardera i tre exemplar med den gröna och blå lasern. Beräkna den totala pigment koncentrationen genom att multiplicera områdets densitet med det filtrerade området och filtrerad volym. Normalisera pigment koncentrationen (μg/L) till en volym av 1 L.
- Bedöm CHLett innehåll i GF/F filter med en laboratorie standard enligt protokollet av Lorenzen25. För att göra detta, placera varje filter i en injektionsflaska med 13 mL aceton och förvara dem i mörker vid 4 ° c över natten. Nästa, ta en flaska och placera den på isen innan ultraljudsbehandling för 2 min vid 50% effekt i kontinuerligt läge. Pressa och ta bort filtret från injektionsflaskan.
- Fäst Tygon slang i en spruta och ta bort CHLa extraktion-aceton blanda från injektionsflaskan. Byt ut Tygon-slangen mot en GF-5-filterhållare. Överför lösningen till en kvarts kuvette.
- Efter kalibrering av absorbansspektrometern för aceton, placera provet i kuvette i spektrometern och mät absorbansdragen mellan 400 – 750 nm. Ta sedan bort kuvette från spektrometern och tillsätt 200 μL av 2 M HCl till provet. Upprepa sedan absorbansmätningen för att mäta phaeophytin-halten i provet.
- Mätning av mikrobiell aktivitet via radioaktivt märkta markörer och inverkan av laserintensitet och exponeringstid på produktivitetsnivåer
Varning: Akta dig för markörens radioaktivitet (β-strålning). Använd en laboratorie kappa, handskar och skyddsglasögon, och arbeta under en draghuv i en licensierad isotop labb.- För bakteriell produktion överföring fem portioner av bakteriella mattor i sterila polyeten påsar. Inaktivera kontrollerna med formaldehyd till en slutkoncentration på 4%.
Anmärkning: tre alikvoter används för 3H-märkta leucin upptag och två alikvoter används som kontroller. - Exponera mattorna med en blå laser (405 nm, 5 mW) och med en grön laser (532 nm, 5 mW) för 10 s och 30 s vardera. Upprepa proceduren med 50 mW lasrar. Inaktivera sedan proverna som inte behandlades med formaldehyd.
Anmärkning: en matta används endast för en laser exponering. Använd icke-exponerade mikrobiella mattor som kontroller. - Efter laserbehandling, uppskatta bakteriell och primärproduktion genom att införliva 3H-leucin och NaH14Co3, respektive. För bakterie produktion mätningar, använda fem portioner per prov (20 mL) och tillsätt formalin (4% slutkoncentration) till två av parallellerna, som fungerar som kontroller för abiotiska införlivandet av markören. Tillsätt 3h-leucin (40 Nm) till alla prover av de olika behandlingarna och inkubera dem under 4 h under in situ-betingelser (0,1 ° c). Avsluta reaktionen genom att tillsätta formalin till de återstående levande proverna.
- För bakterie produktion av bakterie mattor, överför märkta prover till kryovials. Extrahera celler med 5% triklorättiksyra och centrifugera vid 10 000 x g i 5 min enligt protokollen från kirchman26 och Bell27. Tillsätt scintillationsvätskans och placera kryovien i en injektionsflaska av polyscintillation. Analysera proverna med en vätske scintillationsräknare och beräkna upptagnings takten.
Anmärkning: tre alikvoter används för 3H-märkta leucin upptag, två alikvoter används som kontroller. - För primärproduktion, förbereda fem replikat av olika behandlingar (100 mL), Linda två av dem i aluminiumfolie för att efterlikna de mörka proverna, och tillsätt NaH14Co3 (1 μci) till alla. Inkubera i 4 timmar i omgivningsljuset och in situ-temperaturen (0,1 ° c). Avsluta reaktionen genom att göra de återstående tre replikaterna mörkare och filtrera provet på GF/F-filter (25 mm i diameter).
- Tillsätt 100 μL av 2 N HCl till filtren för att ta bort allt överflödigt kol och låt det luftas under draghuven. Torka proverna på en värmeplatta vid 80 ° c och placera proverna i polyscintillationsflaskor.
- För att mäta radioaktiva sönderfall per minut (DPM) av alla behandlingar av primär-och bakterie produktion, placera kryovialerna i polyscintillationsflaskor och tillsätt 5 mL scintillationscocktail. Mät DPM med en vätske scintillationsräknare och beräkna upptagnings takten.
- För bakteriell produktion överföring fem portioner av bakteriella mattor i sterila polyeten påsar. Inaktivera kontrollerna med formaldehyd till en slutkoncentration på 4%.
Representative Results
Laboratorie kalibrering för B-PE
Responssignalerna från B-PE-utspädnings raden mättes med L.I.F.E.-instrumentet i ett mörkt rum vid 20 ° c (figur 6). Räknings hastigheten berodde på både koncentrationen och kolonnhöjden för det uppmätta provet. Låg koncentration och låg kolonnhöjd B-PE prov fluorescerade starkare jämfört med prover av samma koncentration och högre kolonnhöjd.
Figur 6: kalibrering av B-PE-laboratoriet. B-PE-innehåll och kolonndensitetskalibrering visas. Normaliserade Count-frekvenser beräknades för en kolumnhöjd på 1,5 cm. återutskrift med tillåtelse28. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
En Poissonregression användes för den slutliga kalibrerings linjen Fit. Det fanns en linjär korrelation mellan området densiteter och pixel grå värde räknas. Funktionen av kurvan var y = 81.04 x (figur 7), vilket innebär att en grå värde räkna hastighet av 8 104 i en 1 s utsatt provet equaled en områdes täthet på 100 ng/cm2 B-PE. Den CHLen kalibrering är inställd på ett analogt sätt. Funktionen var y = 8.94 x.
Figur 7: slutlig kalibreringskurva för B-PE. De grå värde räkningarna normaliserades till en exponeringstid på 1 s och plottade mot områdes tätheten. Reprint med tillåtelse28. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Ansökan om cryoconite prover från Svalbard och laboratorie validering av data
Medelvärdena för L.I.F.E. mätningarna och de enskilda mätningarna av samma prov som härrör från konventionell extraktion med aceton och efterföljande analys med en spektrofotometer illustreras i figur 8.
Figur 8: data validering med naturliga prover. Proverna (MLB) rangordnas av CHLa -innehåll, baserat på resultaten från en laboratoriespektrofotometer (enstaka värden) och jämfört med CHLen fluorescensdata mätt på fyra slumpmässiga områden per filter. Felstaplar representerar standardavvikelsen för L.I.F.E. mätningar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
CHLett innehåll som sträcker sig från 48 μg/l-67 μg/l var underskattat, och lägre CHLett innehåll som sträcker sig från 0,7 μg/l-7 μg/l överskattades av L.I.F.E. prototypen. Standardavvikelserna från L.I.F.E. mätningarna var låga.
Jämförelse av spektrala data från in situ-mätningar med laboratorie standarder
CHLa Spectra var jämförbara mellan cryoconite prover och de från renas från a. nidulans alger. Fluorescenstopparna i alla prover var placerade vid 700 nm – 710 nm. Spektra från kryoconite-prover visade dock högre buller signaler mellan 400 nm – 650 nm och från 800 nm – 1000 Nm jämfört med spektra av CHLa pigment standard (figur 9).
Figur 9: tolkning av spektraldata. Mätningar av fyra kryokonite granulat (blå) och en CHLen standard pigment lösning (röd) efter excitation med 405 nm lasrar. Spektrat spelades in 1 år efter provinsamling. Proverna hölls frysta och exponerades inte för ljus före mätningen. Som svar på våglängdskalibreringsproblem ligger fluorescenstoppen vid 700 nm – 710 nm istället för 680 Nm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Automatiserad kryokonite korn analys
I ett exempel på en automatiserad analys av ett cryoconite hål (figur 10), den högsta pigment området tätheter observerades vid pixel linje 50. Provet spektrum efter excitation med en 532 nm Laser visade en topp med en avskuren på ett grått värde av 255 som svar på övermättnad av sensorn. Denna topp härstammar från den gröna lasern och inte från den fluorescerande signalen.
Figur 10: automatiserad dataanalys av en enda kryokonite-granule med en diameter på 1 mm. Provet samlades in på Vestre Brøggerbreen (VBB) och mättes inom 4 timmar efter provtagning i ett mörkt laboratorie rum vid Arctic Station (GB)-anläggningen i ny-Ålesund. Den vänstra kolumnen visar B-PE-mätningar och den högra kolumnen representerar CHLa -data. RAW-bilderna visas överst. Laserinducerad fluorescens svar visas i grått. Röda områden indikerar responsen från standard pigment. Mittsektionen illustrerar den rumsliga fördelningen av mål pigment. Fluorescenssignalens spektrala egenskaper visas i de lägre bilderna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Inverkan av laserexcitation på produktiviteten i bakterie mattor
Varken primär eller bakteriell produktivitet påverkades när man ökade effekten av lasern och/eller exponeringstiden (figur 11). Inga signifikanta skillnader upptäcktes under laser behandlingar med ökad effekt.
Figur 11: produktivitetsmätningar av prover från Svalbard. Bakteriella mattor exponerades med gröna och blå lasrar av varierande laser intensiteter och exponeringstider. Data är färgade enligt laser våglängd källa (grön och blå). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Kalibrering
Det fanns ett linjärt samband mellan pigment koncentration och fluorescensintensitet efter normalisering av fotons räkning till en exponeringstid på 1 s. prover med låg kolonnhöjd och låga pigment koncentrationer ledde till en överskattning av mål pigmenten, jämfört med högre kolonnhöjder med samma pigment koncentration. Dessutom krävde svaga fluorescenssignaler långa exponeringstider för tillräckligt antal foton på sensorn. Men långa integrations tider ökade också mängden ströljus på sensorn, vilket resulterade i en minskning av signal-brus-förhållande. I sin nuvarande version kan programvaran inte skilja mellan brus och signal under data reducerings processen. Därför ledde mätningar med låg fluorescensintensitet till en pigment överskattning eftersom brus räknades som en signal som härrörde från mål pigmenten. Vidare uppvisade fluorescensintensiteter från mer koncentrerade pigment lösningar en större variation än lösningar med låg koncentration. Denna effekt kan förklaras av absorptionsprocesser inom de pigment lösningar som användes för kalibreringskurvan.
Data validering för klorofyllen kvantifiering
Efter filtrering is och snö prover, de tredimensionella proverna verkade nästan som ett tvådimensionellt prov på filtret. Detta motiverade en direkt jämförelse mellan L. I. F. E (områdes täthet) och spektrofotometriska data (volymetrisk mätning).
Datamängden (figur 8) indikerade att hög pigment koncentration leder till en underskattning, medan låg pigment koncentration leder till en överskattning av det faktiska värdet. Denna effekt kan förklaras av tjockleken på filterkakan och därmed den volymetriska karaktären av provet. Laserpenetrationsdjupet berodde på provets optiska densitet och tjocklek. Höga pigment innehåll var underskattat eftersom lasern inte kunde inducera pigment fluorescens i djupare skikt. I tunna filterkakor fångades dock låga fluorescenssignaler på grund av låga tätheter av pigment. Tydligen, filtret själv visade laserinducerade signaler efter att ha passerat 450 nm lång pass filter (figur 12). Denna signal räknades missvisande som fluorescenssignal härledd från CHLa. Därför är tunna och för tjocka filterkakor svåra att mäta med L.I.F.E. instrumentet.
Figur 12: fluorescenssignaler från tjocka (A) och tunna (B) filterkakor på ett GF/F-filter. (A) själv skuggning förhindrar laserinducerad fluorescens från djupare skikt, vilket resulterar i en underskattning av den faktiska pigment koncentrationen. (B) fluorescens emission från filter tårta med overlay av filter reflektioner. (C) rådata visar filter reflektion (grå). Den spektrala egenskapen hos ett laboratorium som härrör CHLett fluorescensmönster illustreras i rött. Scale bar = 45 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Begränsningar av L.I.F.E. prototyp
Under datareduktion tolkade MATLAB-programvaran de råa bilderna genom att summera pixel linjer inom ett givet våglängdsområde. Den aktuella versionen av programvaran gjorde inte åtskillnad mellan organiska och oorganiska härledda signaler. Närvaron av flera signaler kan leda till en överskattning av det faktiska pigment innehållet. Långa exponeringstider på grund av låga fluorescensintensiteter ledde till en minskning av signal-brus-förhållandet, vilket främjade effekten enligt beskrivningen ovan (se figur 8 och figur 12).
En Geode Rock visas i figur 13 uppvisade rött fluorescerande ljus när den utsätts för grönt och blått ljus. För närvarande är det oklart om fluorescensen är en följd av mineraler eller från Porfyrin-baserade molekyler. Därför kan en överlagring av biologiska och icke-biologiska signaler begränsa tillämpningen av denna metod och kräver inrättandet av en fluorescensdatabas som är särskilt gjord för L.I.F.E.-prototypen.
Figur 13: mineralfluorescens från en Geode-sten, som återfinns i ny-Ålesund. Klippan var upphetsad med en 532 nm 50 mW laser (a) och en 405 nm 50 MW laser (B). Båda bilderna fångades med ett polariserings filter monterat på linsen, vilket ledde till en förfalskning av de faktiska fluorescensfärgerna. C) True Color-bilder utan användning av ett polariserings filter under dagsljus. Scale bar = 40 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Beutler och andra29 drog slutsatsen att karakteristiska emissions spektra av cyanobakterier i marina ekosystem är beroende av miljöförhållanden. Också, det metabola tillståndet har en inverkan på fluorescensegenskaper i phototrofiska organismer30. Instrumentet kan skilja mellan alg-och cyanobakteriella fluorescensmönstret genom att använda Bio-fingeravtrycks bibliotek som innehåller spektralinformation av preparatet korrelerat med miljöförhållanden.
I mörkanpassade CHLa -molekyler är alla reaktions centra helt oxiderade och tillgängliga för foto kemi och ingen fluorescensavkastning är släckt31. Med hjälp av L.I.F.E. förfarande, är ett prov först upphetsad av en 532 nm Laser (grön) och sedan med en 405 nm Laser (blå). Under den andra excitation av den blå lasern, CHLa kan visa en minskad fluorescens svar på grund av tidigare excitation av den gröna lasern. CHLa absorberar energi vid 532 nm våglängd, trots dess avstånd från dess absorption maximal våglängd32. Innan den faktiska CHLen mätning vid 405 nm, kan den gröna lasern orsaka fotokemiska reaktioner, aktivera kylning mekanismer i mål pigment. Vidare ledde för belysningen av Marina foto trofiska organismer inte till en förändring i spektrala norm kurvor mellan 450 nm – 600 Nm medan standardavvikelsen i fluorescensintensiteter ökade med 25%29. Beroende på Art ökade fluorescensintensiteterna till och med till följd av tidigare excitation. Det här avsnittet kräver ytterligare utredning.
Tillämplighet
Vi testade L.I.F.E. instrument i olika livsmiljöer med betoning på kryokonite hål. Lasern tillämpades framgångsrikt i jord och biofilm livsmiljöer på grund av frånvaron av omgivande ljus under mätningen. Kryokonite granulat kan mätas när sedimentlager blockeras ljus från under hålet (figur 14a,C). Tunna sediment kryoconite hål var genomsläpplig för ströljus underifrån (figur 14b). Ströljus stör mätningen. Således är pigment koncentration i kala isytor inte mätbara under dagsljus förhållanden ännu. Signal behandling pågår för närvarande för att möjliggöra drift av systemet i höga omgivningsljus förhållanden.
Figur 14: Cryoconite hål med flytande vatten ovanpå. (A) cryoconite på glaciär med L.I.F.E. Lens Tube. Skalbar = 70 mm. (B) sedimentskiktet (rött) är mycket tunt. Ströljus blöder genom cryoconite skiktet. (C) sedimentskiktet är tillräckligt tjockt för att blockera strö ljuset under. Denna typ av cryoconite hål är mätbara med L.I.F.E. instrument. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Sammanfattningsvis, vårt L.I.F.E. instrument upptäcks photoautotrofiska organismer i terrestra livsmiljöer såsom jordar, bakterie mattor, biofilmer, och i cryoconite hål på glaciala ytor. Mål molekylerna var CHLa och B-PE. Den rumsliga upplösningen var 30 μm/px. Detektionsgränsen för CHLa var 250 pg/ml och 2 ng/ml för B-PE. Efter en laboratorie kalibrering kunde vi kvantifiera pigment innehåll i prover som samlades in på vår studieplats i Arktis. Vi tillämpade självprogrammerade programvaror för en automatiserad data minsknings process. Effekterna av närvaron av mineraler och förändrade ljusförhållanden under mätningarna kräver ytterligare utredning.
Med klimatuppvärmningen, ökande temperaturer leder till ökad tillgång till flytande vatten, vilket resulterar i högre biologisk aktivitet på isiga ytor av autotrofiska och heterotrofiska natur. Kraftfulla ansträngningar bör göras för att detektera heterotrofiska organismer på plats för att ge en fullständig bild av aktivt liv i kryosfären. Detta kan testas med andra mål pigment och lämpliga laser excitation våglängder. Därför ger L.I.F.E. ett lämpligt övervakningssystem som ger hög temporala och rumsliga upplösning för supraglacial förhållanden i samband med globala förändringar samt möjliga astrobiologiska tillämpningar.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar tacksamt överste (IL) J.N. Pritzker, den Tawani stiftelsen, USA, det österrikiska federala ministeriet för vetenskap, forskning och ekonomi (Sparkling Science SPA04_149 och SPA05_201), Alpine Forschungsstelle Obergurgl (AFO), österrikiska Space forum ( ÖWF), romersk Erler från Hintertuxer natur EIS Palast, Österrikes federala skogs-och bas chef Nick Cox från arktiska stationen i ny Ålesund (Svalbard). Vi är också skuldsatta till Sabrina Obwegeser, Carina Rofner, och Fabian Drewes för deras hjälp under inspelningen. Slutligen vill vi tacka James Bradley för att ge rösten för samtidig video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aceton | Merck | 67-64-1 | |
| B-Phycoerythrin | Invirtrogen | P6305 | |
| Chlorophyll a standard | Sigma-Aldrich | C6144-1MG | |
| formaline | Merck | HT501128 | 36% |
| GF/C filters | Whatman | WHA1822025 | 25mm diameter |
| HCl | Merck | H1758 | 36,5-38% |
| L.I.F.E. Prototype | University of Innsbruck | built on demand | |
| LabView | National Instruments | Software, Laboratory Virtual Instrumentation Engineering Workbench | |
| Leucine, L-[4,5-3H], 1 mCi | Perkin Elmer | NET1166001MC | radioactive |
| Liquid scintillation cocktail Beckman Ready Use | Beckman | not more available, can be compensated by Ultra Gold, Packard | |
| liquid scintillation counter | Beckman | out of stock | LSC 6000 IC |
| NaH14CO3 (4 µCi/ml) | DHI Denmark | 4 μCi/ml, 1 ml | radioactive |
| Osmonics polycarbonate filters | DHI Denmark | PCTE | 25mm diameter, 0,2µm pore size |
| Polyscintillation vials | Perkin Elmer | WHA1825047 | 20ml |
| sample tubes | Sigma Aldrich | T2318-500EA | Greiner centrifuge tubes, 50ml |
| Spectrophotometer | Hitachi | NA | Model U2001, any photometer for absorption spectroscopy measuring at 664nm and 750nm would be appropriate |
| trichloric acetic acid (TCA) | Merck | T6399 | 100% |
| ultrasonic probe | nano lab | QS1T-2 |
References
- Boyd, E. S., Skidmore, M., Mitchell, A. C., Bakermans, C., Peters, J. W. Methanogenesis in subglacial sediments. Environmental Microbiology Reports. 2, 685-692 (2010).
- Sattler, B., Puxbaum, H., Psenner, R. Bacterial growth in supercooled cloud droplets. Geophysical Research Letters. 28, 239-242 (2001).
- Good, P., et al. A review of recent developments in climate change science. Part I: Understanding of future change in the large-scale climate system. Progress in Physical Geography. 35, 281-296 (2011).
- Fountain, A. G., et al. The Disappearing Cryosphere: Impacts and Ecosystem Responses to Rapid Cryosphere Loss. BioScience. 62, 405-415 (2012).
- Rignot, E., Mouginot, J., Morlighem, M., Seroussi, H., Scheuchl, B. Widespread, rapid grounding line retreat of Pine Island, Thwaites, Smith, and Kohler glaciers, West Antarctica, from 1992 to 2011. Geophysical Research Letters. 41, 3502-3509 (2014).
- McMillan, M., et al. Increased ice losses from Antarctica detected by CryoSat-2. Geophysical Research Letters. 41, 3899-3905 (2014).
- Barletta, V. R., et al. Glacier shrinkage and modeled uplift of the Alps. Geophysical Research Letters. 33, 14307 (2006).
- Nuth, C., et al. Decadal changes from a multi-temporal glacier inventory of Svalbard. The Cryosphere. 7, 1603-1621 (2013).
- Takeuchi, N., Kohshima, S., Seko, K. Structure, formation, and darkening process of albedo-reducing material (cryoconite) on a Himalayan glacier: A granular algal mat growing on the glacier. Arctic Antarctic and Alpine Research. 33, 115-122 (2001).
- Takeuchi, N. Optical characteristics of cryoconite (surface dust) on glaciers: the relationship between light absorbency and the property of organic matter contained in the cryoconite. Annals of Glaciology. 34, 409-414 (2002).
- Anesio, A. M., Hodson, A. J., Fritz, A., Psenner, R., Sattler, B. High microbial activity on glaciers: importance to the global carbon cycle. Global Change Biology. 15, 955-960 (2009).
- Anesio, A. M., et al. Carbon fluxes through bacterial communities on glacier surfaces. Annals of Glaciology. 51, 32-40 (2010).
- Storrie-Lombardi, M. C., Sattler, B. Laser-Induced Fluorescence Emission (L.I.F.E): In Situ Nondestructive Detection of Microbial Life in the Ice Covers of Antarctic Lakes. Astrobiology. 9, 659-672 (2009).
- Murray, A. E., et al. Microbial life at -13 °C in the brine of an ice-sealed Antarctic lake. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20626-20631 (2012).
- Edwards, A., et al. A distinctive fungal community inhabiting cryoconite holes on glaciers in Svalbard. Fungal Ecology. 6, 168-176 (2013).
- Miteva, V. Bacteria in Snow and Glacier Ice. Psychrophiles: from Biodiversity to Biotechnology. Margesin, R., Schinner, F., Marx, J. C., Gerday, C. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin/Heidelberg, Germany. 31-50 (2008).
- Yallop, M. L., et al. Photophysiology and albedo-changing potential of the ice algal community on the surface of the Greenland ice sheet. The ISME Journal. 6, 2302-2313 (2012).
- Edwards, A., et al. A metagenomic snapshot of taxonomic and functional diversity in an alpine glacier cryoconite ecosystem. Environmental Research Letters. 8, 035003 (2013).
- Remias, D., et al. Characterization of an UV-and VIS-absorbing, purpurogallin-derived secondary pigment new to algae and highly abundant in Mesotaenium berggrenii (Zygnematophyceae, Chlorophyta), an extremophyte living on glaciers. FEMS Microbiology Ecology. 79, 638-648 (2012).
- Cook, J., et al. An improved estimate of microbially mediated carbon fluxes from the Greenland ice sheet. Journal of Glaciology. 58, 1098-1108 (2012).
- Mueller, D. R., Vincent, W. F., Pollard, W. H., Fritsen, C. H. Glacial cryoconite ecosystems: a bipolar comparison of algal communities and habitats. Nova Hedwigia Beiheft. 123, 173-198 (2001).
- Morgan-Kiss, R. M., Priscu, J. C., Pocock, T., Gudynaite-Savitch, L., Huner, N. P. A. Adaptation and Acclimation of Photosynthetic Microorganisms to Permanently Cold Environments. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70, 222-252 (2006).
- Hodson, A., et al. The cryoconite ecosystem on the Greenland ice sheet. Annals of Glaciology. 51, 123-129 (2010).
- Tilg, M., et al. L.I.F.E.: laser induced fluorescence emission, a non-invasive tool to detect photosynthetic pigments in glacial ecosystems. Proceedings SPIE. 8152, Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology XIV, 81520I. , (2011).
- Lorenzen, C. J. Determination of chlorophyll and pheo-pigments: spectrophotometric equations. Limnology & Oceanography. 12, 343-346 (1967).
- Kirchman, D. Measuring bacterial biomass production and growth rates from leucine incorporation in natural aquatic environments. Methods in Microbiology. , 227-238 (2001).
- Bell, R. T. Estimating production of heterotrophic bacterioplankton via incorporation of tritiated thymidine. Handbook of methods in aquatic microbial ecology. Edited by. Kemp, P. F., Cole, J. J., Sherr, B. F., Sherr, E. B. , CRC press. Boca Raton, FL. 495-503 (1993).
- Groemer, G., et al. Field trial of a dual-wavelength fluorescent emission (L.I.F.E.) instrument and the Magma White rover during the MARS2013 Mars analog mission. Astrobiology. 14, 391-405 (2014).
- Beutler, M. Spectral fluorescence of chlorophyll and phycobilins as an in situ tool of phytoplankton analysis-models, algorithms and instruments. , Christian-Albrechts Universität Kiel. Doctoral dissertation (2003).
- Krogmann, K. D. Discoveries in Oxygenic Photosynthesis (1727-2003): A Perspective. Photosynthesis Research. 80, 15-57 (2004).
- Corrêa, D. S., et al. Reverse saturable absorption in chlorophyll A solutions. Journal of Applied Physics B. 74, 559-561 (2002).
- Kaňa, R., et al. The slow S to M fluorescence rise in cyanobacteria is due to a state 2 to state 1 transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1817, 1237-1247 (2012).
