Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

التحوير الجيني لبكتيريا السيانيد بالاقتران باستخدام مجموعه أدوات الاستنساخ النموذجية السيسونات

doi: 10.3791/60451 Published: October 31, 2019
* These authors contributed equally

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا يصف كيفيه القيام بتجميع ناقل النسخ المتماثل ذاتيا باستخدام مجموعه أدوات الاستنساخ النموذجية سيانوكوبالامين ، ii) إدخال المتجه إلى مضيف ترتبط عن طريق الاقتران ، و iii) توصيف سلالات البكتيريا الوراثية المحورة جينيا باستخدام قارئ لوحه أو تدفق الخلوية.

Abstract

البكتيريا الزرقاء هي مجموعه متنوعة من الكائنات الضوئية الاصطناعية النواة التي يمكن تعديلها وراثيا للإنتاج المتجدد للسلع الصناعية المفيدة. وقد أدت التطورات الاخيره في البيولوجيا التركيبية إلى تطوير عده مجموعات من أدوات الاستنساخ مثل السيسونات ، وهو نظام معياري للاستنساخ النمطي لبناء ناقلات البلازميد للتحول اللاحق أو الانتقال الزوجي إلى البكتيريا الزرقاء. هنا نحن الخطوط العريضة طريقه مفصله لتجميع ناقلات ذاتية التكرار (علي سبيل المثال ، تحمل كاسيت التعبير علامة الفلورسنت) ونقل الزوجية من المتجه إلى سلالات ترتبط Synechocystis sp. 6803 أو Synechكوكوس الونجاتوس utex 2973. الاضافه إلى ذلك ، فاننا نقدم وصفا لكيفيه توصيف أداء الجزء الوراثي (علي سبيل المثال ، المروج) باستخدام قارئ اللوحة أو قياس التدفق الخلوي.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

البكتيريا الزرقاء التغذية هي بكتريا يمكن استخدامها في التخليق الحيوي لمجموعه واسعه من المنتجات الايضيه ذات القيمة العالية الطبيعية وغير المتجانسة1،2،3،4،5، 6- ولا تزال هناك عده عقبات تحتاج إلى التغلب عليها لتوسيع صلاحيتها التجارية ، ولا سيما الغلات الضعيفة نسبيا مقارنه بالمنصات الحيوية غير المتجانسة (مثل القولونية والخميرة)7. ويساعد التوسع الأخير في الاداات الهندسية الوراثية المتاحة واستيعاب نموذج البيولوجيا التركيبية في البحوث الترتبطه علي التغلب علي هذه التحديات وزيادة تطوير البكتيريا الزرقاء كمصانعحيوية فعاله 8، 9و10.

النهج الرئيسية لإدخال الحمض النووي في البكتيريا الزرقاء هي التحول والاقتران والكهربية. والمتجات المنقولة إلى البكتيريا الزرقاء بالتحويل أو بالكهرباء هي ناقلات "انتحاريه" (اي المتجات التكاملية التي تسهل أعاده الدمج الذاتي) ، في حين يمكن نقل ناقلات النسخ المتماثل بنفسها إلى البكتيريا الزرقاء التحويل ، الاقتران أو الكهربية. النسبة للنوع الأول ، هناك بروتوكول متاح للأنواع النموذجية الهندسية القابلة للتحول الطبيعي11. في الاونه الاخيره ، تم تطوير مجموعه أدوات الاستنساخ (MoClo) وحدات لبكتيريا السيانيد يسمي سيانوكوبالامين التي توظف طريقه موحده لتجميع ناقلات البوابة الذهبية للهندسة باستخدام التحويل الطبيعي ، الكهربي أو الاقتران12.

وقد أصبحت تقنيات الجمعية الذهبية من نوع شعبيه متزايدة في السنوات الاخيره ، ومعايير الجمعية والمكتبات جزء متاحه الآن لمجموعه متنوعة من الكائنات الحية13،14،15،16 ،17. البوابة الذهبية يستخدم نوع الانزيمات تقييد IIS (علي سبيل المثال ، BsaI ، BpiI ، BsmBI ، BtgZI و AarI) وبدله من متقبلين وتعليق فريد لتسهيل التجمع الهرمي الاتجاهي لمتواليات متعددة في "وعاء واحد" رد فعل الجمعية. تعرف الانزيمات المقيدة لنوع IIS علي تسلسل غير متماثل فريد وتقطع مسافة محدده من مواقع التعرف عليها لإنشاء قطع متداخلة ، "نهاية لزجه" (عاده ما تكون 4 نوكليوتيد [NT] المتراكمة) ، والتي يمكن استغلالها لاحقا لدفع الحمض النووي المطلوب ردود فعلالجمعية 15,18. وقد سهل هذا تطوير المكتبات الكبيرة من أجزاء المستوي 0 وحدات (علي سبيل المثال ، والمروجين ، وإطارات القراءة المفتوحة والمنهيون) المعرفة من قبل بناء جمله مشتركه ، مثل معيار PhytoBricks19. ويمكن بعد ذلك تجميع أجزاء المستوي 0 بسهوله في أشرطه التعبير المستوي 1 ، وبعد ذلك أكثر تعقيدا التجميعات ترتيب اعلي (علي سبيل المثال ، التعبير المتعدد الجينات يبني) يمكن ان يبني في ناقلات متقبل من الاختيار12،15. ومن المزايا الرئيسية لتقنيات الجمعية الذهبية من نوع البوابة هي قدرتها علي الاتمته في مرافق عاليه الانتاجيه ، مثل الحمض النووي المصهر20،21، والتي يمكن ان تسمح للاختبار التصاميم التجريبية المعقدة التي لا يمكن تحقيقه بسهوله عن طريق العمل اليدوي.

سيانوكوبالامين يبني علي نظام المصنع الثابتة moclo12،15. ولادراج جزء جديد في السيسونات ، يجب أولا ان تكون التسلسلات الجزئية مستانسه ، اي انه يجب أزاله مواقع الاعتراف "غير القانوني" لشركتي BsaI و BpiI. في حاله الترميز جزء لاطار القراءة المفتوحة (اي تسلسل الترميز ، الاقراص المدمجة) ، يمكن ان تتعطل مواقع التعرف عن طريق توليد طفرات مرادفه في التسلسل (اي تغيير كودون إلى بديل ان الرموز لنفس بقايا الأحماض الامينيه). ويمكن تحقيق ذلك من خلال مجموعه متنوعة من النهج ، بدءا من توليف الحمض النووي إلى الاستراتيجيات القائمة علي تضخيم تفاعل البلمره المتسلسل (PCR) مثل جمعيه جيبسون22. اعتمادا علي المضيف التعبير المستخدمة ، ينبغي توخي الحذر لتجنب إدخال المخطوطات النادرة التي يمكن ان تمنع كفاءه الترجمة23. أزاله مواقع التعرف في تسلسل المروج والمنهي عاده مسعى أكثر خطورة ، كما قد تؤثر التعديلات علي الدالة وقد لا يؤدي الجزء كما هو متوقع. علي سبيل المثال ، يمكن ان تغير التغييرات في مواقع ربط عامل النسخ المفترض أو موقع ربط الريبوسوم داخل المروج القوه والاستجابة للتوجيه/القمع. المثل ، فان التعديلات علي الملامح الهيكلية الرئيسية المنهي (علي سبيل المثال ، الجذعية الغنية GC ، حلقه وبولي U الذيل) قد تغير كفاءه إنهاء وتاثير التعبيرالجيني 24 ،25. علي الرغم من ان العديد من الموارد علي الإنترنت متاحه للتنبؤ بنشاط متواليات المروج والمنهي ، وإبلاغ ما إذا كانت الطفرة المقترحة ستؤثر علي الأداء26،27، وهذه الاداات غالبا ما تكون ضعيفه من التنبؤات الأداء في البكتيريا الزرقاء28،29،30.. علي هذا النحو ، في توصيف الجسم المجري للأجزاء المعدلة لا يزال يوصي بتاكيد النشاط. وللمساعدة في استنساخ المتواليات المتمردة ، يتضمن السيسونات نسخه منخفضه من النسخ التي يقبلها الاستنساخ علي أساس ناقل بيوريك pSB4K512،16،31. وعلاوة علي ذلك ، فان بوابه "التصميم والبناء" متاحه من خلال مسبك الجينوم في ادنبره للمساعدة في تصميم ناقلات الامراض (dab.genomefoundry.org). وأخيرا ، والاهم من ذلك ، وتشمل سيانوكوبالامين اثنين من التصميمات ناقلات المستوي T متقبل (ما يعادل المستوي 2 المتجات متقبل)15 لإدخال الحمض النووي في البكتيريا الزرقاء باستخدام ناقلات الانتحار ، أو ناقلات واسعه النطاق المضيف قادره علي النسخ المتماثل الذاتي في عده ترتبط الأنواع32،33،34.

هنا سوف نركز علي وصف بروتوكول لتوليد مستوي T ناقلات النسخ المتماثل الذاتي والتعديل الجيني لل synechالونجاتوس sti الشركة ال6803ه للامراض و Synechكوكوس الونجاتوس Utex 2973 (Synechёts الشركة الخاصة 6803 و s. Utex 2973 الاخره) عن طريق الاقتران (المعروف أيضا باسم التزاوج ثلاثي الوالدين). النقل الزوجي للحمض النووي بين الخلايا البكتيرية هو عمليه موصوفه جيدا وقد استخدمت سابقا للهندسة ترتبط الأنواع ، وخاصه تلك التي ليست مختصة بشكل طبيعي ، مثل s. الونجاتوس utex 297335، 36،37،38،39،40،41. وباختصار ، يتم احتضان الثقافات الترتبطه بسلاله كولاي التي تحمل المتجه الذي سيتم نقله (ناقل "الحمولة") والمتجات (اما في نفس سلاله e. كولاي أو في سلالات اضافيه) لتمكين الاقتران ("المعبئ" ومتجات "المساعد"). مطلوب أربعه شروط رئيسيه لنقل الزوجية ان يحدث: 1) الاتصال المباشر بين الخلايا المتورطة في نقل الحمض النووي ، 2) يجب ان يكون ناقل البضائع متوافقا مع نظام التصريف (اي انه يجب ان يحتوي علي مصدر مناسب للتحويل (Orit) ، المعروف أيضا باسم شجره المواد (أساس التنقل) الموقع) ، 3) الحمض النووي الذي يخدع البروتين (علي سبيل المثال ، المشفرة من قبل الجينات الغوغاء ) التي نيكس الحمض النووي في orit لبدء نقل واحد تقطعت بهم السبل للحمض النووي في السيانيد يجب ان تكون موجودة وأعرب اما من ناقلات البضائع أو المساعدين ، و 4) يجب الا يدمر الحمض النووي المنقول في السيانيد المستلم (اي ، يجب ان يكون مقاوما للتدهور بواسطة ، علي سبيل المثال ، تقييد النشاط الأحادي النواة)35،42. ولكي يستمر ناقل البضائع ، يجب ان يكون منشا النسخ المتماثل متوافقا مع زرقه المتلقي للسماح بالنسخ المتماثل الذاتي والانتشار في القسم الخاص بالخلايا التابعة للابنة. للمساعدة في الظروف 3 و 4 ، تتوفر العديد من ناقلات المساعد من خلال Addgene والمصادر التجارية الأخرى التي ترمز للغوغاء وكذلك العديد من ميثيل أسيس للحماية من الكريات المحلية الاصليه في المضيف سيانوكوبالامين43. في هذا البروتوكول ، تم تسهيل الاقتران بسلاله MC1061 e. القولونية التي تحمل المعبئ وناقلات المساعد pRK24 (www. addgeneorg/51950) و pRL528 (www.addgene.org/58495) ، علي التوالي. يجب توخي الحذر عند اختيار المتجات التي سيتم استخدامها للتحويل الزوجي. علي سبيل المثال ، في عده سيانوكوبالامين الذاتي--النسخ المتماثل ناقلات البضائع pPMQAK1 الترميز للبروتين الغوغاء12. ومع ذلك ، pSEVA421 لا44، وعلي هذا النحو ، يجب ان يتم التعبير عن الغوغاء من ناقل المساعد مناسبه. وينبغي ان تكون المتجات المستخدمة مناسبه أيضا للكائن المستهدف. فعلي سبيل المثال ، يتطلب النقل الزوجي الفعال في شركه انابينا sp. 7120 ناقل المساعد الذي يحمي ناقلات المعبئ ضد الهضم (علي سبيل المثال ، pRL623 ، الذي يشفر لثلاثه ميثيل أسيس Avaim ، Eco47iiM و Ecot22iM)45، 46.

وفي هذا البروتوكول ، نقوم بتوضيح كيفيه توصيف أداء الأجزاء (اي المروجين) بعلامة فلورية باستخدام قارئ اللوحة أو مقياس التدفق الخلوي. تدفق الخلايا الخلوية قادره علي قياس الفلوري علي أساس خليه واحده لعدد كبير من السكان. وعلاوة علي ذلك ، تسمح مقاييس التدفق الخلوي للمستخدمين "ببوابه" البيانات المكتسبة وأزاله الضوضاء الخلفية (علي سبيل المثال ، من الجسيمات في الثقافة أو التلوث). وعلي النقيض من ذلك ، فان قراء اللوحات يكتسبون قياسا مضانا لحجم معين من الثقافة ، وعاده ما يكون ذلك في العديد من الآبار المتماثلة. وتشمل المزايا الرئيسية للقراء لوحه علي أجهزه قياس الكريات الخلوية انخفاض التكلفة ، وتوافر اعلي وعاده لا حاجه لبرامج متخصصة لتحليل البيانات المصب. العيوب الرئيسية للقراء لوحه هي حساسية اقل نسبيا بالمقارنة مع المضخمات الخلوية والقضايا المحتملة مع كثافة بصريه من الثقافات المقاسه. النسبة للتحليلات المقارنة ، يجب ان تكون عينات قارئ اللوحات بشكل تطبيع لكل بئر (علي سبيل المثال ، لقياس كثافة الثقافة ، التي تؤخذ عاده علي انها الامتصاص في الكثافة البصرية عند 750 نانومتر [OD750]) ، والتي يمكن ان تؤدي إلى عدم دقه العينات التي هي أيضا كثيفه و/أو غير مختلطة جيدا (علي سبيل المثال ، عندما تكون عرضه للتجميع أو التلبد).

كلمحه عامه ، وهنا نظهر بالتفصيل مبادئ توليد مستوي 0 أجزاء ، تليها الجمعية الهرمية باستخدام مجموعه سيانوكوبالامين والاستنساخ إلى ناقلات مناسبه لنقل الزوجية. ثم نقوم بإثبات عمليه النقل الزوجية ، واختيار سلالات التحويلات التي تعبر عن علامة فلورية ، والحصول لاحقا علي البيانات الفلورية باستخدام مقياس التدفق الخلوي أو قارئ اللوحة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. الجمعية ناقلات باستخدام أدوات MoClo النبات والسيانيد

ملاحظه: قبل المضي قدما مع الجمعية ناقلات, فمن المستحسن بشده ان المستخدمين التعرف علي هياكل مستوي المتجات من النبات ونظم mocogate موغلو12,15.

  1. بناء أجزاء من المستوي 0
    ملاحظه: يمكن توليف أجزاء المستوي 0 كمتجات كامله أو كتسلسل خطي للتجميع مع المتقبلين من المستوي 0 (علي سبيل المثال ، gBlocks ، IDT). بدلا من ذلك ، يمكن تضخيم متواليات من قالب مصدر (علي سبيل المثال ، ناقل أو الحمض النووي الوراثي المنقي). هنا ، يتم وصف كيفيه إنشاء جزء جديد من المستوي 0 من منتج مضخم. يتم عرض نظره عامه علي عمليه تجميع البوابة الذهبية من المستوي 0 إلى المستوي T فيالشكل 1.
    1. تصميم الإشعال.
      1. تقرر ما هو مستوي 0 وحده لتجميع وتحديد المناسبة 5 ′ و 3 ′ يتدلى (الجدول 1)12,15. تحقق من تسلسل الحمض النووي لاستنساخ لوجود مواقع تقييد BpiI أو BsaI.
        ملاحظه: يجب ان يكون التسلسل الذي يحتوي علي أحد هذه المواقع المستانسه بواسطة تعديل واحد أو أكثر من نتس في تسلسل موقع تقييد. وترد استراتيجية للقيام بذلك باستخدام جمعيه البوابة الذهبية في الشكل 2.
      2. لتضخيم تسلسل الحمض النووي ، وتصميم المناسب للامام وعكس التمهيدي الزوج. للحصول علي التمهيدي إلى الامام ، حدد 18 − 30 bp مكمله ل 5 ′ نهاية تسلسل قالب الحمض النووي. للحصول علي التمهيدي العكسي ، حدد 18 − 30 bp عكس مكمله لنهاية 3 ′ من تسلسل قالب الحمض النووي.
        ملاحظه: الإشعال مع درجات حرارة الذوبان (Tm) من 58 − 62 درجه مئوية عاده ما تعطي نتائج التضخيم الأكثراتساقا(الشكل 1ا).
      3. أضافه ما يلي إلى نهاية 5 ′ التمهيدي إلى الامام: 1) سلسله عشوائية من 4 − 6 نتس في نهاية 5 ′ من الموقع BpiI ، 2) موقع تقييد BpiI (GAAGAC) ، 3) اثنين من المترددين عشوائية ، و 4) المتراكمة 5 ′ المحددة في الخطوة 1.1.1.1. أضافه ما يلي إلى نهاية 5 ′ التمهيدي العكسي: 1) سلسله عشوائية من 4 − 6 نتس في نهاية 5 ′ من الموقع BpiI ، 2) موقع تقييد BpiI (GAAGAC) ، 3) اثنين من المترددين عشوائية ، و 4) المتراكمة 3 ′ المحددة في الخطوة 1.1.1.1. عند الانتهاء ، اطلب أزواج التمهيدي.
        ملاحظه: راجع الشكل 1a للحصول علي مثال عن زوج التمهيدي الامامي والعكسي.
    2. تضخيم تسلسل الحمض النووي من الحمض النووي الجيني.
      1. استخراج الحمض النووي الجيني كما هو موضح في القسم 5. تضخيم المنتجات من قبل PCR باستخدام البوليميراتالحمض النوويعاليه الدقة (جدول المواد).
        ملاحظه: علي سبيل المثال ، قم باعداد تفاعلات PCR (20 − 50 μL) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدام ~ 100 ng من الحمض النووي الجيني لكل رد فعل. استخدام برنامج الدراجات الحرارية التي تتكون من خطوه التشبع الاوليه من 98 درجه مئوية ل 30 ثانيه ، تليها أكثر من 25 دورات من التشبع في 98 درجه مئوية ل 10 ثانيه ، الصلب التمهيدي في 58 درجه مئوية ل 15 ثانيه وتمديد المنتج في 72 درجه مئوية ل 30 ثانيه (تعديل هذا الأخير اعتمادا علي حجم المنتج/نوع من البلمره الحمض النووي المستخدمة) ، تليها خطوه التمديد النهائي من 72 درجه مئوية لمده 2 دقيقه.
      2. إذا كان المنتج PCR ان يكون هلام تنقيه ، تشغيل رد فعل PCR بأكمله علي هلام اجبرز كما هو موضح في القسم 6. قطع الفرقة من الفائدة من هلام اجنشا وتنقيته باستخدام هلام استخراج عده (جدول المواد).
      3. بديل إلى خطوه 1.1.2.2, ان ال [بكر] منتوج ان يكون استعملت دون هلام تنقيه, تحققت النطاق حجم ب يركض [اليقووت] من ال [بكر] رد فعل عينه (~ 5 [ميكرول]) علي [اغبرز] هلام. إذا كان الهلام يظهر فقط الفرقة المناسبة وأي دليل علي الدمامل التمهيدي ، تنقيه المنتج PCR باستخدام مجموعه تنقيه الحمض النووي (جدول المواد).
      4. Elute تنقيه الحمض النووي في حجم صغير من الماء منزوع الأيونات (علي سبيل المثال ، 10 μL) للحصول علي تركيز الحمض النووي عاليه (> 20 نانوغرام/μL عاده ما تكون كافيه).
    3. تجميع منتج الحمض النووي المضخم (أو المنتجات ، انظر الشكل 2) في المستوي 0. قم باعداد مزيج تفاعل 20 μL مع BpiI (الشكل 1B) واعداد برنامج التدوير الحراري كما هو موضح في الجدول 2. انتقل إلى e. القولونية التحول باستخدام 5 μl من مزيج رد فعل المستوي 0 المجمعة (كما هو موضح في القسم 2).
  2. بناء جمعيات المستوي 1
    1. تحديد المستوي 0 أجزاء لتجميع (الشكل 1C والجدول 1). اختيار المناسبة المستوي 1 متقبل متجه15.
      ملاحظه: في هذه المرحلة من المهم ان نعرف ما تصميم ناقلات النهائي سيكون في المستوي T ، لان هذا سيؤثر علي اختيار ناقلات المستوي 1 متقبل. يمكن استخدام المستوي 1 موضع 1 (إلى الامام) المتجه متقبل (pICH47732) كافتراضي إذا كان الهدف هو الحصول علي تجميع مستوي 1 واحد (علي سبيل المثال ، شريط التعبير الجيني) في المستوي T. ومع ذلك ، إذا كان من المقرر تجميع اثنين أو أكثر من التجميعات من المستوي 1 في المستوي T ، يجب مراعاه الموضع والاتجاه لكل تجميع من المستوي 1. يمكن تجميع ما يصل إلى سبعه تجميعات المستوي 1 في متجه المستوي T متقبل باستخدام متجات متقبل المستوي 1 مع المواضع المناسبة12.
    2. تجميع أجزاء المستوي 0 في المستوي 1. قم باعداد مزيج تفاعل 20 μL مع BsaI واعداد برنامج التدوير الحراري كما هو موضح في الجدول 2. انتقل إلى e. القولونية التحول باستخدام 5 μl من مزيج رد فعل المستوي 1 المجمعة (كما هو موضح في القسم 2).
  3. بناء الجمعيات المستوي T
    1. تحديد التجميعات من المستوي 1 للتجميع (الشكل 1D). اختيار متجه المستوي T متقبل المناسبة.
      ملاحظه: pUC19A (مقاومه الامبيسلين) و pUC19S (المقاومة spectinomycin) هي المتجات التكاملية رقم عاليه النسخ التي ليست قادره علي تكرار في البكتيريا الزرقاء وتستخدم في المقام الأول للتكامل الجيني (اي ، تدق في أو ضرب الخروج من الجينات) عن طريق أعاده الدمج المتماثل12. ويمكن تسليم النواقل التكاملية بالتحول الطبيعي في الأنواع القابلة لترتبط القابلة للتحويل11. pPMQAK1 هو مجموعه واسعه من المضيفين ، ناقلات التكرار التي يتم تسليمها عن طريق نقل الزوجية (القسم 3).
    2. اختيار المناسبة نهاية الارتباط لربط 3 ′ نهاية الجمعية المستوي 1 النهائي إلى العمود الفقري المستوي T15.
      ملاحظه: الارتباط النهائي المطلوب هو نفس الرقم كموضع الجزء الأخير. علي سبيل المثال ، سيتطلب متجه المستوي T بموضع واحد فقط من المستوي 1 (إلى الامام أو الخلف) جزءا من الوصلة النهائية 1 (pICH50872) للربط في العمود الفقري للمستوي T.
    3. تجميع واحد أو أكثر من التجميعات المستوي 1 في المستوي T. اعداد مزيج تفاعل مع BpiI وناقل الارتباط النهائي المطلوب واعداد برنامج التدوير الحراري كما هو موضح في الجدول 2. انتقل إلى e. القولونية التحول باستخدام 5 μl من مزيج رد فعل المستوي T المجمعة (كما هو موضح في القسم 2).

2.e . القولونية التحول وتنقيه ناقلات

  1. E. القولونية التحول (اليوم 1)
    1. أذابه الصقيع (~ 25 μL) من الخلايا e. القولونية المختصة كيميائيا (جدول المواد) وماصه بلطف في أنبوب 1.5 mL علي الجليد. أضافه 5 μL من مزيج التجميع (المستوي 0, 1 أو T) واحتضان الأنبوب علي الجليد لمده 30 − 60 دقيقه أخرى.
    2. خلايا الصدمة الحرارية عن طريق احتضان الأنبوب في حمام مائي في 42 درجه مئوية ل 30 ثانيه ، ثم وضع الأنبوب مره أخرى علي الجليد لمده 2 دقيقه. أضافه درجه حرارة الغرفة (RT) سوبر الأمثل مع القمع هدم (S.O.C.) المتوسطة (250 μL) إلى أنبوب. احتضان الأنبوب في 37 درجه مئوية ل 1 ح في 225 دوره في الدقيقة في حاضنه تهتز.
    3. لوحه 40 μl من الثقافة علي لوحه أجار LB تحتوي علي التركيز النهائي المناسب من المضادات الحيوية (100 ميكروغرام/مل ل السبيكتينوميسين ثنائي هيدروكلوريد خماسي الهيدرات [المستوي 0] ، 100 ميكروغرام/مل من الصوديوم كاربينسيلين [المستوي 1] ، أو 50 ميكروغرام/مل من كبريتات الكاناميسين [ مستوي T]) ، 1 مم ايزوبروبيل-بيتا-د-ثيوغالالاكتويرانيوسايد (IPTG) و 40 ميكروغرام/مل من 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl-β-D-جالاكتوبيرانوسيدي (X-غال) للفحص الأزرق والأبيض. احتضان اللوحة بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
      ملاحظه: يمكن ان تختلف كميه الثقافة مطلي اعتمادا علي كفاءه الخلايا e. القولونية المختصة وتفاعل الربط. لوحه حجم أكبر إذا لوحظ < 10 مستعمرات بعد الحضانة بين عشيه وضحيها.
  2. اختيار المستعمرات البيضاء واعداد الثقافات السائلة (اليوم الثاني)
    ملاحظه: اعتمادا علي كفاءه رد فعل الجمعية والتحويل اللاحق ، لوحات أجار LB قد لا تحتوي علي مستعمرات أو مستعمرات زرقاء أو مستعمرات بيضاء (الشكل 3). المستعمرات الزرقاء هي مؤشر لمتجات متقبل التي لم تخضع للقيود (اي ، نسخه وظيفية من Lacz لا تزال موجودة). تشير المستعمرات البيضاء إلى انه قد تم فقدان كاسيت التعبير Lacz واستبداله بجزء/تجميع.
    1. وبشكل اختياري ، تحقق من ان المستعمرات البيضاء تحتوي علي المتجه المتوقع من خلال تنفيذ PCR كما هو موضح في القسم 7.
    2. اختيار مستعمرات بيضاء واحده (أو المستعمرات PCR التحقق) مع 10 μL غيض ونقل إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي علي LB المتوسطة (5 مل) وتركيزات المضادات الحيوية المناسبة (الخطوة 2-1-3). احتضان الأنابيب في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها في 225 دوره في الدقيقة في حاضنه تهتز.
  3. تنقيه ناقلات plasmid (اليوم 3)
    1. اختياريا ، واعداد الأسهم الجلسرين من الثقافة e. كولاي بين عشيه وضحيها لمخزن علي المدى الطويل من ناقلات. أضافه 500 μL من الثقافة البكتيرية إلى 500 μL من 50 ٪ (v/v) الجلسرين في أنبوب 1.5 − 2.0 mL المناسبة لمخزن at-80 درجه مئوية. اخلطه برفق من خلال عكس 5 − 10x. فلاش تجميد عينات في النيتروجين السائل وتخزينها في 80 درجه مئوية الفريزر.
    2. تدور الثقافات في 15 مل أنابيب الطرد المركزي في 3,000 x g لمده 5 − 10 دقيقه. تجاهل ماده طافي دون إزعاج الخلية بيليه. تنقيه المتجه باستخدام مجموعه تنقيه البلازميد (جدول المواد). Elute تنقيه ناقلات في 35 μL من الماء منزوع الأيونات.
      ملاحظه: استخدام وحدات تخزين اقل الشطف لزيادة تركيز المتجه. ويمكن وضع نفس الأنف من خلال عمود تنقيه مرتين لزيادة الغلة.
    3. قياس تركيز المتجه في الأنف باستخدام مقياس طيفي (جدول المواد).
      ملاحظه: المتجات العالية النسخ في e. كولاي، مثل pUC19 ، تعطي عاده غله من 50 − 300 نانوغرام/Μl. انخفاض عدد ناقلات النسخ ، مثل pPMQAK1 ، تعطي عاده غله من 15 − 60 نانوغرام/μl.
  4. التحقق من صحة ناقلات
    ملاحظه: يمكن التحقق من المتجات عن طريق الهضم قيد (الخطوة 2-4-1) و/أو التسلسل (الخطوة 2-4).
    1. تقييد 0.5 − 1 ميكروغرام من ناقلات مع انزيم (ق) تقييد المناسبة والتحقق من احجام النطاق المتوقع كما هو موضح في القسم 6 (الشكل 4).
      ملاحظه: احجام النطاق غير صحيحه تشير عاده إلى التجميع الخاطئ ، وفي هذه الحالة يمكن فحص المزيد من المستعمرات البيضاء أو يمكن تكرار التجميع. يمكن استخدام BsaI و BpiI للتحقق من صحة الحجم الصحيح لادراج المستوي 0 وتجميعات المستوي 1 ، علي التوالي. يمكن استخدام BsaI أو BpiI بالتزامن مع انزيم تقييد إضافي ومتوافق والذي يقطع داخل الادراج و/أو العمود الفقري المتجه لإنتاج مجموعه متميزة من النطاقات المفصولة جيدا بعد الهضم.
    2. تسلسل المتجه بواسطة تسلسل Sanger باستخدام التمهيدي المناسب المنبع من المنطقة المجمعة باستخدام مرفق التسلسل التجاري (الجدول 3).
      ملاحظه: يجب ان تكون كافة أجزاء المستوي 0 الجديد متسلسلة لتاكيد هويه التسلسل المتوقع. لا يكون التحقق من صحة التسلسل لمتجات المستوي 1 و T عاده مطلوبا إذا تم تجميعه من أجزاء المستوي 0 المتسلسلة سابقا.

3. توليد المسوخ عن طريق الاقتران

ملاحظه: هنا ، يتم وصف بروتوكول لنقل الزوجية من ناقلات البضائع النسخ المتماثل الذاتي إلى synechالونجاتوس sti الشركة ال6803ه للنقل الخاصة أو s. ال2973 utex11،47 . وينطبق هذا البروتوكول علي الأنواع الأخرى من النماذج (علي سبيل المثال ، s. الونجاتوس 7942 و Synechococcus sp. 7002). وينبغي ان يتم جميع العمل مع البكتيريا الزرقاء (والاستعدادات العازلة المرتبطة بها) في ظل ظروف معقمه في غطاء التيار الرقائقي.

  1. نمو من ال [ترتبط كلتثر] (يوم 1)
    1. اعداد BG11 المتوسطة وفقا ليا سميث وآخرون11، ولوحات أجار مع LB-BG11 و BG11 + Kan50 (القسم 8).
    2. اعداد ثقافة جديده من Synechالونجاتوس sti الوحدة ال6803ه أو s. BG11 utex 2973 عن طريق تلقيح قارورة مخروطيه 100 ml من الطازجة المتوسطة (50 ml) مع الخلايا المصدرة من لوحه أجار BG11 اكسرينك. تنمو الثقافات ال6803ه في 30 درجه مئوية ، 100 ميكرومول الفوتونات م-2s-1 في 100 دوره في الدقيقة وتنمو s. الونجاتوس utex 2973 في 40 درجه مئوية ، 300 ميكرومول الفوتونات م-2s-1 في 100 دوره في الدقيقة. تنمو الثقافات حتى OD750 = 0.5 − 1.5 (عاده 1 − 2 أيام).
      ملاحظه: الونجاتوس utex 2973 الثقافات يمكن زراعتها في 40 درجه مئوية في كثافة الضوء العالي (علي سبيل المثال ، 2000 ميكرومول الفوتونات m-2S-1)48.
  2. نمو المساعد والبضائع e. القولونية سلالات (اليوم 2)
    1. تطعيم LB المتوسطة التي تحتوي علي الامبيسلين (التركيز النهائي 100 ميكروغرام/مل) و الكلورامفينيكول (التركيز النهائي 25 ميكروغرام/مل) مع سلاله MC1061 التي تحتوي علي ناقلات pRK24 و pRL528 ( اي سلاله المساعد) وتنمو في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها في 225 دوره في الدقيقة في حاضنه الاهتزاز. يكبر حجم كافيه من ثقافة سلاله المساعد ، علي افتراض 1 مل من الثقافة مطلوبه لكل الاقتران.
    2. تطعيم LB المتوسطة (5 مل) التي تحتوي علي المضادات الحيوية المناسبة مع الثقافة e. كولاي تحمل ناقلات البضائع (اي متجه المستوي T). تنمو الثقافة في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها في 225 دوره في الدقيقة في حاضنه الاهتزاز.
  3. الانتقال الزوجي (التزاوج ثلاثي الوالدين) (اليوم الثالث)
    1. اعداد المساعد القولونية وسلالات البضائع. الطرد المركزي المساعد والبضائع e. كولاي الثقافات بين عشيه وضحيها في 3,000 x g لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. تجاهل ماده طافي دون إزعاج بيليه الخلية.
    2. غسل بيليه عن طريق أضافه الطازجة LB المتوسطة دون المضادات الحيوية. استخدام نفس وحده التخزين كالثقافة الاوليه. أعاده تعليق بيليه عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا. لا دوامه الثقافة. كرر هذه الخطوة 3x لأزاله المضادات الحيوية المتبقية من الثقافة بين عشيه وضحيها.
    3. طرد مركزي الثقافة المعاد تعليقها (كما هو الحال في الخطوة 3-3-1) ، وتجاهل ماده طافي وأعاده التعليق في نصف حجم LB متوسطه من حجم الثقافة الاوليه (علي سبيل المثال ، 2.5 ml إذا كانت الثقافة بين عشيه وضحيها 5 مل). الجمع بين 450 μL من سلاله المساعد مع 450 μL من سلاله البضائع في أنبوب 2 مل ووضع جانبا (ترك في RT) حتى 3.3.6 الخطوة.
    4. اعداد الثقافة الترتبطه. لكل رد فعل الاقتران ، استخدم 1 مل من الثقافة الترتبطه (OD750 = 0.5 − 1.5).
    5. الطرد المركزي الحجم الإجمالي المطلوب للثقافة ترتبط في 1,500 x g ل 10 دقيقه في RT ، ثم تجاهل ماده طافي بعناية دون إزعاج بيليه الخلية. يغسل بيليه عن طريق أضافه BG11 الطازجة المتوسطة من نفس الحجم الاولي. أعاده تعليق بيليه عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا ، لا دوامه الثقافة. كرر هذه الخطوة 3x وتعيين الثقافة غسلها جانبا.
    6. أضافه الترتبط من الثقافة المغسولة (900 μL) إلى مجموعات e. القولونية (المساعد والبضائع) (900 μl) في أنبوب 2 مل. تخلط الثقافات عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا. لا دوامه. احتضان الخليط في RT لمده 30 دقيقه ل Synechёrs ال6803ه الثانية أو 2 ح ل s. الونجاتوس utex 2973.
    7. الطرد المركزي الخليط في 1,500 x g لمده 10 دقيقه في RT. أزاله 1.6 mL من supernatant. أعاده تعليق بيليه في المتبقية ~ 200 μL من supernatant. وضع فلتر غشاء 0.45 μm علي لوحه أجار رطل BG11 تفتقر إلى المضادات الحيوية (القسم 8). تنتشر بعناية 200 μl من مزيج الثقافة e. القولونية/cyanobacterial علي الغشاء مع رش معقمه أو طرف العقيمة محني وختم لوحه مع الفيلم البارافين.
    8. احتضان لوحه LB-BG11 مع الغشاء ل 24 ح. الحفاظ علي الاغشيه مع الثقافات ال6803ه الصلبة الصلبة في 30 درجه مئوية ، 100 ميكرومول الفوتونات م-2s-1. الحفاظ علي الاغشيه مع s. الونجاتوس utex 2973 الثقافات في 40 درجه مئوية في 150 ميكرومول الفوتونات م-2S-1.
  4. نقل الغشاء
    1. بعد 24 ساعة ، نقل بعناية الغشاء باستخدام ملقط اللهب تعقيمها إلى لوحه أجار BG11 الطازجة التي تحتوي علي المضادات الحيوية المناسبة (القسم 8) لتحديد لناقلات البضائع. ختم لوحه مع الفيلم البارافين.
    2. احتضان لوحه أجار BG11 في ظل ظروف النمو المناسبة ، كما هو موضح أعلاه ل Synechocystis ال6803 الصلبة أو s. الونجاتوس utex 2973 ، حتى تظهر مستعمرات.
      ملاحظه: المستعمرات عاده ما تظهر بعد 7 − 14 يوما ل Synechالونجاتوس sti الشركة العامة ل6803 و 3 − 7 أيام ل s. ال2973 utex.
  5. اختيار الكونجوجانتس
    ملاحظه: المستعمرات ترتبط فقط تحمل ناقلات البضائع سوف تكون قادره علي النمو علي الغشاء (الشكل 5).
    1. باستخدام حلقه معقمه الحرارة ، حدد ما لا يقل عن اثنين من المستعمرات الفردية من الغشاء وخط علي لوحه أجار BG11 جديده تحتوي علي المضادات الحيوية المناسبة (الشكل 5ج).
      ملاحظه: المستعمرات الطازجة قد لا تزال ملوثه مع e. القولونية التي تم ترحيلها من الاقتران (اي إذا كانت المستعمرات البيضاء الصغيرة واضحة علي لوحه) ، لذلك اثنين أو ثلاث جولات اضافيه من أعاده الينثر علي لوحات أجار BG11 الطازجة هي عاده اللازمة للحصول علي ثقافة ترتبط اكسرينوس.
    2. تاكيد غياب e. كولاي التلوث عن طريق تطعيم سلسله من الثقافة الترتبطه في أنبوب الطرد المركزي 15 مل تحتوي علي 5 مل من المتوسطة LB واحتضان في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها في 225 دوره في الدقيقة في حاضنه تهتز. بعد فتره نمو كافيه (~ 7 أيام) ، واختيار المستعمرات axenنوس الفردية لأقامه الثقافات السائلة لمخزن علي المدى الطويل أو التجارب اللاحقة.
  6. مخزن من سلالات ترتبط
    1. تنمو الثقافة السائلة ترتبط في BG11 (كما هو موضح في القسم 3.1) حتى OD750 = 1.5 − 3.0. الطرد المركزي 10 مل من الثقافة لمده 10 دقيقه في 1,500 x g، أزاله ماده طافي وأعاده تعليق الخلايا في 5 مل من الطازجة BG11 المتوسطة.
    2. أضافه 3.5 mL من الاوتوكلاف تعقيم 50 ٪ (v/v) الجلسرين لتركيز الجلسرين النهائي من ~ 20 ٪ (v/v)49. هذا النهج يعمل بشكل جيد لل Synechocystis الاتصالات ال6803ه. بدلا من ذلك ، أضافه 5 مل من فلتر تعقيم BG11 التي تحتوي علي 16 ٪ (v/v) ثنائي ميثيل سلفوكسيد (dmso) لتركيز dmso النهائي من ~ 8 ٪ (v/v)50. ويوصي بهذا النهج لمعظم السلالات ، بما في ذلك s. الونجاتوس utex 2973.
      تحذير: DMSO سامه وينبغي التعامل معها مع الحماية المناسبة.
    3. اخلطه برفق من خلال عكس 5 − 10x. Subaliquot ~ 1 مل من الثقافة في منفصلة مخزن متوافقة 1.5 mL أنابيب المسمار كاب (جدول المواد). وضع أنابيب في 80 درجه مئوية الفريزر لمخزن. لا فلاش تجميد في النيتروجين السائل.
      ملاحظه: يوصي بثلاثه أسهم علي الأقل لكل سلاله.
    4. للانتعاش ، وأزاله أنبوب من-80 درجه مئوية الفريزر وذوبان الثقافة في 35 درجه مئوية حمام المياه في حين خلط بلطف. أضف الثقافة المذابة إلى 50 مل من الBG11 الطازجة المتوسطة والنمو كثقافة سائله (كما هو موضح في القسم 3.1).
      ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن ان تكون الثقافة ستريمل ونميت علي لوحه أجار BG11 الطازجة. يجب احياء الثقافات المحورة وراثيا تحمل علامات الاختيار في البداية علي لوحات أجار BG11 دون المضادات الحيوية ومن ثم أعيدت تعبئتها علي لوحات أجار BG11 مع المضادات الحيوية المناسبة.

4-توصيف المروج

ملاحظه: هنا يتم وصف النهج القياسي لتحليل قوه جزء المروج عن طريق قياس مستويات التعبير من علامة الفلورسنت (eYFP) بعد فتره نمو 72 h باستخدام اما قارئ لوحه أو تدفق المضخم12.

  1. النمو الثقافي
    1. اعداد ثقافات البذور عن طريق تطعيم 10 مل من BG11 المتوسطة التي تحتوي علي المضادات الحيوية المناسبة مع مستعمره واحده من سلاله ترتبط المحورة وراثيا تحمل كاسيت التعبير علامة الفلورسنت. أيضا اعداد ثقافات البذور لسلالات التحكم السلبية المناسبة (علي سبيل المثال ، سلاله نوع البرية و/أو سلاله المحورة وراثيا تحمل نفس العمود الفقري ناقلات ولكنها تفتقر إلى كاسيت التعبير علامة الفلورسنت).
      ملاحظه: يوصي بأربع نسخ متماثلة بيولوجية علي الأقل.
    2. تنمو الثقافات البذور ل 48 h أو حتى OD750 = 1 − 1.5 تحت ظروف النمو المناسب لسلاله الأنواع.
    3. لتتبع المروج التعبير مع مرور الوقت ، أولا قياس OD750 من كل ثقافة البذور. حساب متطلبات التخفيف لجلب كل ثقافة إلى بداية OD750 = 0.2. اعداد عينات الثقافة التجريبية المخففة (حجم الإجمالي 2 مل) في لوحه مسطحه القاع 24 بئر (جدول المواد).
    4. احتضان لوحه في حاضنه تهتز مع أضواء LED بيضاء (جدول المواد) في ظل ظروف النمو المناسبة. قياس كثافة النمو الثقافي (OD750) والبروتين الفلوري الأصفر المعزز (eyfp) الفلوري باستخدام اما قارئ لوحه (القسم 4.2) أو مقياس التدفق الخلوي (القسم 4.3).
      ملاحظه: يمكن ان تزرع الثقافات ال6803ه الخاصة بالرقم المحلي العام و s. الونجاتوس utex 2973 كما في الخطوة 3-1-2. ويوصي بشده ان يتم الحفاظ علي لوحه تحت الرطوبة العالية (95 ٪) لتجنب تبخر عينات الثقافة.
  2. قارئ لوحه
    1. امزج الثقافات بإيجاز في اللوحة التي تضم 24 بئرا (الخطوة التالية) باستخدام الماصات اللطيفة. نقل عينه فرعيه من كل ثقافة إلى لوحه سوداء مسطحه القاع 96-بئر (جدول المواد). تمييع إذا لزم الأمر (100 الحجم النهائي μL). تجنب تشكيل فقاعات لان هذا يمكن ان تتداخل مع دقه القياس.
      ملاحظه: من المستحسن ان يتم تنفيذ جميع القياسات علي عينات في نطاق OD750 من 0.2 − 1.0. كما كثافة الثقافات في 24-حسنا سوف تزيد مع مرور الوقت ، ويوصي المخففات التالية استنادا إلى الزيادات المتوقعة في ظروف النمو القياسية: لا التخفيف في 0 ح ، 1:4 في 24 ح ، 1:10 في 48 h و 1:10 في 72 h. هكذا علي سبيل المثال ، في 24 ح الحصاد 25 μL من الثقافة وتخلط مع 75 μL من BG11 المتوسطة.
    2. وتشمل اثنين من الآبار فارغه في لوحه 96-بئر (اي ، 100 μL من BG11 المتوسطة). وضع لوحه 96 البئر في قارئ لوحه (جدول المواد). يهز لوحه ل 60 s في 500 دوره في الدقيقة باستخدام شاكر المدارية في القارئ لوحه لخلط الآبار.
      ملاحظه: يمكن للثقافات ترتبط تجميع و/أو التلبد ، لذا فان الخلط الجيد أمر بالغ الاهميه قبل القراءة لاجراء قياسات دقيقه.
    3. قياس OD750 والفلوري eyfp مع موجات الاثاره/الانبعاثات في 485 nm/520 نانومتر.
    4. طرح متوسط قياسات OD750 لبئرين فارغتين من قياس od750 لكل عينه تحتوي علي ثقافة البكتيريا الزرقاء بشكل جيد.
    5. تطبيع القيم الفلورية لكل عينه الثقافة عن طريق تقسيم القياس الفلورية eYFP (الخطوة 4-2) بواسطة750 OD المعدلة للثقافة (الخطوة 4.2.4). ثم نطرح متوسط قيمه الفلورية العادية (eYFP الفلورية/OD750) من الحيوية التي تحاكي السلالة المناسبة للسيطرة السلبية من السلالات المعدلة وراثيا التي تحمل كاسيت التعبير eyfp.
      ملاحظه: يتالق البكتيريا الزرقاء بشكل طبيعي بسبب وجود اصباغ ، مثل الكلوروفيل والبروتينات الفيكوبيليليه.
    6. مؤامرة النمو الثقافي مع مرور الوقت (الشكل 6A) ومتوسط تطبيع القيم الفلورية لكل ثقافة تجريبية في النقاط الزمنيه المطلوبة (علي سبيل المثال ، 72 h ؛ الشكل 6(ب).
  3. تدفق المضخم الخلوي
    1. اختيار لوحه متوافقة لتدفق نظام مناوله السائل الخلوي. علي سبيل المثال ، استخدم لوحه 96 القاع المستديرة (جدول المواد) مع مقياس التدفق الخلوي (جدول المواد) المستخدم في هذا البروتوكول.
    2. امزج الثقافات بإيجاز في اللوحة التي تضم 24 بئرا (الخطوة التالية) باستخدام الماصات اللطيفة. تمييع الثقافات إلى OD750 = 0.1 − 0.2 لتجنب انسداد فوهه في نظام مناوله السائل. أضافه حجم مناسب من عينه الثقافة إلى لوحه 96-حسنا وجلب إلى الحجم النهائي من 250 μL مع فلتر-تعقيم 1x الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني). وتشمل بئر فارغه للحل المتوسط علي لوحه تحتوي علي 60 μL من BG11 و 190 μL من 1x تلفزيوني.
      ملاحظه: يوصي بوحدة التخزين هذه في حاله وجود حاجه إلى أعاده تشغيل العينات. لا ينصح وحدات التخزين اعلي من 250 μL كحد اقصي لحجم كل بئر هو 300 μL.
    3. وبمجرد ان يكون مقياس التدفق الخلوي جاهزا للاستخدام ، ضع لوحه 96 بشكل جيد مع عينات الثقافة في محطه مناوله السائل. اعداد بروتوكول البرنامج لمقياس التدفق الخلوي لجمع قياسات 10,000 الاحداث الفردية (علي سبيل المثال ، الخلايا). قياس الفلورية eYFP مع الاثاره/الانبعاثات الموجية من 488 nm/515 − 545 نانومتر. التدبير الأول والتحقق من القراءة من بئر فارغه (الشكل 7ا) ، ثم تشغيل العينات.
    4. بوابه السكان من خلايا البكتيريا الزرقاء داخل مجموعات البيانات مبعثر إلى الامام والجانب ، باستثناء المناطق المشتركة مع قراءه فارغه (الشكل 7ب). طرح متوسط القيم الفلورية eYFP من البيولوجية نسخا متماثلة من سلاله التحكم السلبية المناسبة من سلالات المعدلة وراثيا تحمل كاسيت التعبير eYFP (الشكل 7C ، D). رسم متوسط قيم الفلورية المتوسطة لكل خليه لكل ثقافة تجريبية في النقاط الزمنيه المطلوبة (علي سبيل المثال ، 72 h ؛ الشكل 7(ه).

5. استخراج الجينات الجينية من البكتيريا الزرقاء

ملاحظه: يستخدم البروتوكول أدناه مجموعه استخراج الحمض النووي التجارية (جدول المواد).

  1. تنمو الثقافة السائلة ترتبط في BG11 (كما هو موضح في القسم 3.1) حتى OD750 = 1.5 − 3.0. تدور 10 مل من الثقافة في 3,000 x g لمده 10 دقيقه وتجاهل supernatant. تجميد بيليه عن طريق احتضان الأنابيب في-20 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
  2. أضافه 400 μL من المخزن المؤقت تحلل (المخزن المؤقت AP1) و 400 μL من محلول ريبونكليوداز (RNase A) ، و 50 ٪ (w/v) من الخرز الزجاجي (0.5 مم قطر). تعطيل العينات باستخدام مطحنه حبه (جدول المواد) في 30 هرتز (اي ما يعادل 1,800 الذبذبات/دقيقه) لمده 6 دقائق.
  3. تدور العينة في 17,000 x g لمده 5 دقائق ونقل بعناية ماده طافي إلى أنبوب جديد وتجاهل بيليه. المضي قدما وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد).

6. اجبرز هلام الكهربائي

  1. يلقي 1 ٪ (ث/الخامس) هلام اجنشا تحتوي علي 0.02 ٪ (v/v) بروميد ايثيديوم. تحميل العينات والمرجعية المناسبة سلم الحمض النووي.
  2. تشغيل عينات ل 50 دقيقه في 125 V. التحقق من فصل الفرقة علي الاشعه فوق البنفسجية (UV) المصباح.
    ملاحظه: يمكن تعديل الوقت قيد التشغيل والنسبة المئوية هلام اجبرز لتتناسب مع حجم الفرقة المتوقعة. فعلي سبيل المثال ، قد يحسن النسبة المئوية الأعلى للهلام ووقت التشغيل الأطول من دقه النطاق وفصل منتجات الحمض النووي < 500 bp.

7. مستعمره PCR

  1. اعداد مزيج تفاعل PCR باستخدام مجموعه قياسيه (جدول المواد) ومزيج مناسب من الإشعال (علي سبيل المثال ، الإشعال التي تحيط بمنطقه التجميع أو التي تخص تسلسلات داخل منطقه التجميع (الجدول 3). ماصه 10 μL في أنبوب PCR.
  2. لمس برفق اعلي مستعمره بيضاء واحده مع مسواك معقمه أو 10 μL طرف ماصه وتطعيم أنبوب PCR التي تحتوي علي مزيج تفاعل PCR. اهتم بوضع علامة علي المستعمرة والمباراة مع أنبوب PCR محدده. يحرك مزيج التفاعل برفق لضمان التخلص من الخلايا القولونية في المحلول.
  3. تضخيم المنتجات من قبل PCR. استخدام برنامج يتكون من خطوه التشبع الاوليه من 95 درجه مئوية ل 60 s ، 30 جولات من 95 درجه مئوية ل 15 ثانيه ، 58 درجه مئوية ل 15 ثانيه (درجات قليله تحت القيم Tm من الإشعال) ، 72 درجه مئوية ل 30 ثانيه (30 s/kb من ادراج) ، تليها خطوه التمديد النهائي من 72 درجه مئوية لمده 5 دقائق.

8. اعداد BG11 المتوسطة ولوحهات

  1. اعداد حلول الأسهم من 100x BG11 المتوسطة ، والحديد (سيترات الأمونيوم حديديك) ، والعناصر النزره ، والفوسفات (K2hpo4) ، Na2CO3 و TES العازلة وفقا ل Lea-سميث وآخرون11. الفوسفات الاوتوكلاف و Na2CO3 الأسهم. استخدام مرشحات 0.2 μm لتصفيه تعقيم المخزن المؤقت TES (pH 8.2) وحلول الأسهم ناهكو3 .
  2. اعداد 1 لتر من BG11 المتوسطة. مزيج 10 مل من 100x BG11 ، 1 مل من العناصر النزره و 1 مل من الأسهم الحديد والاوتوكلاف الحل مع 976 مل من الماء. مره واحده وقد يبرد الحل وصولا إلى RT ، أضافه 1 مل من الأسهم الفوسفات ، 1 مل من Na2CO3 الأسهم و 10 مل من ناهكو3، والتكيف مع درجه الحموضة 7.6 − 7.8 مع 1 م HCl.
  3. BG11 أجار لوحات (1.5 ٪ [w/v])
    1. الجمع بين 700 مل من الماء منزوع الأيونات و 15 غرام من أجار في قارورة زجاجيه. في قارورة الثانية ، أضافه 186 mL من الماء ، 10 مل من 100x BG11 ، 1 مل من العناصر النزره و 1 مل من الحديد المخزون. الاوتوكلاف كلا الحلين.
    2. مره واحده وقد هدات الحلول وصولا إلى حوالي 60 درجه مئوية ، والجمع بينهما وأضافه 1 مل من الأسهم الفوسفات ، 1 مل من Na2CO3 الأسهم ، 10 مل من ناسكو3 الأسهم و 50 مل من المتوسطة العقيمة LB ، والتي ينبغي ان تعطي المجلد النهائي من 1 ل. يلقي بيتري الاطباق مع 25 mL من BG11 أجار المتوسطة.
  4. BG11 + Kan50 أجار لوحات (1.5 ٪ [w/v])
    1. الجمع بين 700 مل من الماء منزوع الأيونات و 15 غرام من أجار في قارورة زجاجيه. في قارورة ثانيه ، أضافه 3 غرام من ثيوكبريتات الصوديوم (Na2S2O3) ، 226 mL من الماء ، 10 مل من الأسهم BG11 100x ، 1 مل من العناصر النزره و 1 مل من الأسهم الحديد. الاوتوكلاف كلا الحلين.
    2. مره واحده وقد تبريد الحلول وصولا إلى حوالي 60 درجه مئوية ، والجمع بينهما وأضافه 1 مل من الأسهم الفوسفات ، 1 مل من Na2CO3 الأسهم ، 10 مل من المخزون الاحتياطي TES ، و 10 مل من الأوراق المالية نامكو3 ، والتي ينبغي ان تعطي المجلد النهائي من 1 ل. أضافه كاناميسين كبريتات إلى التركيز النهائي من 50 ميكروغرام/مل ويلقي اطباق بيتري مع 35 مل من المتوسطة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

لإظهار سير عمل تجميع البوابة الذهبية ، تم تجميع كاسيت التعبير في الموضع 1 للمستوي 1 (إلى الامام) المتجه متقبل (pICH47732) الذي يحتوي علي الأجزاء التالية من المستوي 0: المروج لل C-phycocyanin Pcpc560 (pc 0.005) ، تسلسل الترميز eYFP (pC 0.008) والمنهي مزدوجة Trr (pc 0.082)12. بعد تحويل رد فعل التجميع ، تم تحديد التجميعات الناجحة باستخدام الفحص القياسي الأزرق الأبيض لمستعمرات e. كولاي (الشكل 3). تم تجميع الكاسيت التعبير eYFP في متجه المستوي 1 ومتجه نهاية الارتباط 1 (pICH50872) إلى متجه المستوي T متقبل (pPMQAK1) لإعطاء المتجه Cpcba-eyfp (الشكل 4ا). تم التحقق من ناقلات Cpcba-eyfp تجميعها عن طريق الهضم تقييد (الشكل 4ب).

ادي الانتقال الناجح للزوج Cpcba-eyfp أو المتجه pPMQAK1 الفارغ (اي السيطرة السلبية التي تفتقر إلى كاسيت التعبير eyfp) إلى نمو ما يصل إلى عده مئات من المستعمرات علي الغشاء للحصول علي ال6803 S. الونجاتوس utex 2973 بعد 7 − 14 يوما و 3 − 7 أيام علي التوالي (الشكل 5). انتقيت مستعمرات فرديه كان و[ستريمل] علي طازجه BG11 + Kan50 أجار لوحات; 2 − 3 وكانت هناك حاجه إلى أعاده الشرائط لتوليد الثقافات اكسرينوس.

كما هو متوقع لقويه Pcpc560 المروج51، وقيم لتطبيع eyfp الفلورية من قارئ لوحه والفلورية eyfp لكل خليه من تدفق المضخم الخلوي كانت عاليه بالمقارنة مع السيطرة السلبية (الشكل 6 و الشكل 7). وكانت القيم الفلورية اعلي في s. الونجاتوس utex 2973 من في Synechocystis 680312.

Figure 1
الشكل 1: نظره عامه علي عمليه تجميع البوابة الذهبية في السيسونات. يتم عرض تجميع كاسيت التعبير الجيني ، بدءا من تضخيم تسلسل الفائدة من الحمض النووي للقالب إلى التجميع في متجه المستوي T (لا يتم سحب الأجزاء إلى الحجم). (ا) تصميم الإشعال الامامي والخلفي لتضخيم جزء CDS1 من الحمض النووي القالب (علي سبيل المثال ، الجينات الجينية أو الحمض النووي البلازميد). ويسلط الضوء باللونين الأحمر والأزرق ، علي التوالي ، علي مواقع التقييد والتعليقات الزائدة اللازمة لادراجها في ناقل المتقبل (اي 5 ′ و 3 ′ من تسلسل القالب). الحرف "n" يدل علي ان اي NT يمكن استخدامها في هذا المنصب. أشرت المناطق صلبه من الإشعال مع ال [دنا] قالب وهم يوصي انصهار درجه حرارة ([ت]). (B) مستوي الجمعية 0 من المنتج PCR في المستوي 0 CDS1 متقبل ناقلات pICH41308. يتم تمييز التسلسل الذي سيتم بواسطة BpiI وربطه في ناقل متقبل باللون الأزرق. (ج) المستوي الأول من التجميع لشريط التعبير الجيني الذي يحتوي علي ثلاثه أجزاء من المستوي 0 (Pro + 5U و CDS1 و 3U + Ter) في الموضع 1 من المستوي 1 (إلى الامام) المتجه متقبل pICH47732 باستخدام bsai. (د) المستوي t الجمعية من المستوي 1 الجمعية ونهاية الارتباط 1 (pICH50872 ، ودعا "المستوي M نهاية الارتباط 1" في engler وآخرون15) في المستوي t المتجات متقبل (علي سبيل المثال ، PPMQAK1) باستخدام bpii. (ه) الناقل النهائي المجمع من المستوي T. الاختصارات: AmpR ، ampr المقاومة كاسيت ؛ CarbR ، carbenسلين المقاومة كاسيت. CDS1 ، تسلسل الترميز في بناء الجملة مستوي 015; EL1 ، نهاية الارتباط 1 جزء ؛ KanR ، كانامايسين المقاومة كاسيت. Laczα، β-غالاكتوزيداز التعبير كاسيت. SpecR ، spectinomمايسين المقاومة كاسيت. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: استراتيجية المحلية المستندة إلى PCR لأزاله موقع تقييد IIS نوع غير قانوني. (ا) رسم تخطيطي يوضح اثنين من أزواج التمهيدي (باللونين الأخضر والبرتقالي ، علي التوالي) لتعديل موقع BPII (gaagac) إلى gaggac في تسلسل الحمض النووي لترميز البروتين المخصص للتجميع في متجه CDS1 المستوي 0 (pICH41308). لاحظ ان التعديل يحفظ كودون لحمض الجلوتاميك (غلو) (اي ، غا إلى هفوة). علي الرغم من ان يتم عرض موقع BpiI في اطار مع codon البداية ، وهذا النهج سوف تعمل حتى لو كان الموقع ليس في اطار (اي ، طالما تعطل الموقع ، وتسلسل البروتين الحفاظ علي). ويسلط الضوء باللونين الأحمر والأزرق علي مواقع مواقع تقييد BpiI والتعليقات الزائدة في الإشعال ، علي التوالي. يتم تمييز قالب الحمض النووي وتسلسل البروتين المترجمة باللون الأصفر. أشرت المناطق صلبه من الإشعال مع ال [دنا] قالب وهم يوصي انصهار درجه حرارة ([ت]). ويستخدم الزوج البرتقالي لتضخيم نهاية 5 ′ من التسلسل مع يتدلى و tgaa (قطعه 1) ، في حين يتم استخدام الزوج الأخضر لتضخيم نهاية 3 مع يتدلى الفوقية و gctt (جزء 2). قبل يامر الإشعال, الإخلاص من ال [تجغا] انصهار بروز لشظية 1 و 2 كان بعناية يفحص52. ويمكن ان يؤدي الانصهار المفرط المصمم بشكل رديء إلى فشل التجميع (اي لا توجد مستعمرات بعد التحويل ؛ الشكل 5) أو الإيجابيات الزائفة (علي سبيل المثال ، التجميعات المقتطعة أو الخاطئة). ويمكن حل هذه الاخيره بفحص عدد أكبر من المستعمرات البيضاء للتعرف علي البناء المجمع بشكل صحيح. (ب) رموز الشظايا 1 و 2 بعد التقييد باستخدام bpii اثناء تجميع البوابة الذهبية. (ج) التسلسل المدجنه تجميعها في المستوي 0 CDS1 متقبل متجه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: فحص المستعمرة الزرقاء-البيضاء لترانسفورمانتس التي تلي الجمعية الذهبية للبوابة الكترونيه . تحتوي اللوحات المعروضة علي أجار LB (1% [w/v]) مكمله مع X-غال و IPTG والمضادات الحيوية بتركيزات مناسبه. (ا) لا مستعمرات ، مما يوحي بفشل رد فعل الجمعية و/أو التحول e. كولاي . (B) المستعمرات الزرقاء في الغالب ، مشيرا إلى نجاح الجمعية ، ولكن كفاءه الانزيم تقييد المستخدمة في رد فعل الجمعية كانت منخفضه. (ج) المستعمرات البيضاء في معظمها ، مما يدل علي رد فعل التجميع النموذجي والناجح. (د) لا مستعمرات زرقاء ، مما يدل علي كفاءه التجمع. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التحقق من ناقلات المستوي T المجمعة عن طريق الهضم تقييد. تم هضم المتجات مع الهندية الثانية و BamHI. (ا) خريطة تسلسل لناقل الpPMQAK1 الفارغ (CT. 0) وتجميع المستوي t (cpcba-eyfp) الذي يظهر مكونات كاسيت التعبير eyfp (PCpc560-eyfp-trr). ويشار إلى مواقع التقييد الخاصة بالمركزين المذكورين. بعد الهضم المزدوج ، يتم الاشاره إلى الاحجام المتوقعة لشظايا الحمض النووي: (1) 5,847 bp ، (2) 2,004 bp ، (3) 30 bp ، (4) 374 bp ، (5) 1,820 bp ، (6) 1,289 bp ، و (7) 156 bp. (ب) هلام اجبرز (0.8 ٪ [ث/ف]) تشغيل في 125 v ل 60 دقيقه محمله مع مستوي هضم الجمعية T (Cpcba-eyfp) التي تظهر النطاقات 1 و 5 و 6 ، والتي تم هضمها pPMQAK1 المتجات الفارغة (CT 0) التي تظهر النطاقين 1 و 2 وسلم الحمض النووي (جدول المواد). لاحظ ان العصابات 3 و 4 و 7 كانت صغيره جدا لتصور علي الهلام. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: نمو المستعمرات المعدلة وراثيا 6803 التي تتبع الاقتران الناجح. وتظهر أمثله من الاغشيه التالية الحاضنة علي لوحات أجار BG11 + Kan50. (ا) فرط النمو بعد الاقتران المتسم بالكفاءة الشديدة-طورت مستعمرات ال6803 التابعة لهذه المستعمرات إلى حديقة لا توجد بها مستعمرات فرديه. (ب) كفاءه تصريف جيده تبين عده مئات من المستعمرات الفردية بعد 12 يوما. (ج) نمو سلاله الإبط بعد 14 يوما بعد عده جولات من أعاده النثر علي لوحه أجار BG11 + Kan50 جديده. وأشار غياب التلوث البكتيري إلى ان المحول ال6803 الذي تم التحويل اليه كان axenhёsti . يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: بيانات النمو التمثيلي وقيم الفلورية الطبيعية باستخدام قارئ اللوحة. (ا) مقارنه النمو للسلالات التي تحمل cpcba-eyfp أو المتجه PPMQAK1 الفارغ (CT. 0 ، التحكم السلبي) في Synechcrots الصوت ال6803 المتوسط و s. الونجاتوس utex 2973. القيم هي الوسائل ± SE من أربعه نسخ متماثلة البيولوجية. Synechocystis وقد تم استزراع الشركة 6803 و s. الونجاتوس utex 2973 ل72 h عند 30 درجه مئوية مع الضوء المستمر (100 ميكرومول الفوتونات m-2s-1) و 40 درجه مئوية مع 300 ميكرومول الفوتونات m-2s-1، علي التوالي. (ب) تطبيع القيم الفلورية eyfp ل Synechcctts ال6803ه الموحدة أو s. الونجاتوس Utex 2973 مترافق مع كبكبا-eyfp في 72 ح. القيم هي الوسائل ± SE من أربع نسخ متماثلة البيولوجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: قيم الفلورية eYFP التمثيلية باستخدام مقياس التدفق الخلوي. (ا) إلى الامام (FSC-h) والجانب (SSC-h) المؤامرة مبعثر من الحل "فارغه" المتوسطة (BG11 وتلفزيوني). (ب) مؤامرة مبعثرة لعينه من ال6803 ( اليمين). وتشير الدائرة إلى المنطقة المحددة التي يتم فيها السكان البكتيريا الزرقاء من ما تبقي من اشاره العينة. (ج) الرسم البياني للمنطقة المسورة لسلاله تحمل ناقل pPMQAK1 الفارغ (CT. 0 ، التحكم السلبي). (د) الرسم البياني للمنطقة المسورة لسلاله تحمل cpcba-eyfp. (ه) القيم الفلورية لكل خليه في synechالونجاتوس sti الوحدة الخاصة بالوحدات ال6803ه وال2973 في 72 ح. وقد طرح الفلورية من السيطرة السلبية. القيم هي الوسائل ± SE من أربعه نسخ متماثلة البيولوجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

لا. معرف المتجه اسم وصف 5 ' المتراكمة 3 ' المتراكمة
1 pICH41233 برو المروج GGAG براعه
2 pICH41295 برو + 5U المروج و 5 ˈ المنطقة غير المترجمة GGAG أجل مساعده غامبيا
3 pAGM1251 برو + 5U (f) المروج و 5 ˈ غير المترجمة تسلسل لمحطه N اندماج GGAG في الانجليزيه
4 pICH41246 5U 5 ˈ المنطقة غير المترجمة براعه في الانجليزيه
5 pAGM1263 5U (و) 5 ′ تسلسل غير مترجمه ل N محطه اندماج براعه في الانجليزيه
6 pICH41246 5U + NT1 5 ˈ منطقه غير مترجمه ومنطقه الترميز N الطرفية براعه في الانجليزيه
7 pAGM1276 NT1 علامة المحطة الطرفية N أو اشاره التعريب في الانجليزيه أجل مساعده غامبيا
8 pICH41258 Sp اشاره الببتيد أجل مساعده غامبيا AGGT
9 pICH41258 NT2 علامة المحطة الطرفية N أو اشاره التعريب أجل مساعده غامبيا AGGT
10 pAGM1287 CDS1 ns الترميز المنطقة دون توقف كودون أجل مساعده غامبيا TTCG
11 pICH41308 CDS1 توقف الترميز المنطقة مع وقف كودون أجل مساعده غامبيا GCTT
12 pAGM1299 CDS2 ns الترميز المنطقة-دون بدء ووقف كودون AGGT TTCG
13 pICH41264 CDS2 توقف الترميز المنطقة-دون البدء ومع التوقف كودون AGGT GCTT
14 pAGM1301 Ct علامة المحطة C أو اشاره التعريب TTCG GCTT
15 pICH53388 3U 3 ˈ المنطقة غير المترجمة GCTT GGTA
16 pICH53399 ثالثا فاصل GGTA في التونسية
17 pICH41276 3U + Ter 3 ˈ المنطقة غير المترجمة ومنهي GCTT في التونسية
18 pICH41331 Cgm متقبل لأشرطه الجينات الكاملة GGAG في التونسية
19 الانيسول الخماسي الكلور 0.002 برو (نسخه منخفضه) المروج ، عدد منخفض نسخه متقبل (pSC101 ori) GGAG براعه
20 الانيسول الخماسي الكلور 0.001 خدمات المساندة اقتطاع المروج إلى موقع بدء النسخ GGAG TAGC
21 مباشره إلى المستوي 1 srRNA [رنا] صغيره تنظيميه (ل يسكت [ترانسايشنل]) TAGC GTTT
22 مباشره إلى المستوي 1 sgRNA دليل واحد RNA (ل CRISPRi) TAGC GTTT
23 pICH41295 الجناح الأعلى [فلكينغ] تسلسل منبع من هدف متماثلة [ركمايشن] موقعه GGAG أجل مساعده غامبيا
24 pICH41276 الجناح الأسفل الجمع بين تسلسل المصب من الموقع الهدف المتماثل أعاده الدمج GCTT في التونسية

الجدول 1: قائمه بالمتجات متقبل المستوي 0 المتوفرة والتعليق الزائد. المتجات 1 − 18 هي من المصنع MoClo طقم15. المتجات 19 − 22 من المجموعة12من السيسونات. بالنسبة لأجزاء srRNA و sgRNA ، يتم تجميع التسلسلات التجميعية أو منتجات PCR مباشره في متجات متقبل المستوي 1. المتجات 23 − 24 هي من مجموعه MoClo النباتية التي تم أعاده الغرض منها للتحول من خلال أعاده التركيب الذاتي باستخدام مجموعه سيانوكوبالامين.

مكونات التجميع BpiI (المستوي 0 ، T) مكونات الجمعية BsaI (المستوي 1)
50 − 100 نانوغرام من المتجات المتقبلة 50 − 100 نانوغرام من المتجات المتقبلة
لكل متجه/جزء لادراج ، استخدم نسبه 2:1 من ادراج: المتجه متقبل. لكل متجه/جزء لادراج ، استخدم نسبه 2:1 من ادراج: المتجه متقبل.
2 μL 10 مم ATP (جدول المواد) 2 μL 10 مم ATP (جدول المواد)
2 μL المخزن المؤقت G (المخزن المؤقت ل BpiI/BsaI) 2 μL المخزن المؤقت G (المخزن المؤقت ل BpiI/BsaI)
2 μL بوسنيا (10x) (جدول المواد) 2 μL بوسنيا (10x) (جدول المواد)
10 وحدات BpiI (1 ميكروl10 U/μL BpiI ، جدول المواد) 10 وحدات BsaI (1 μL 10 U/μL BsaI ، جدول المواد)
جلب إلى 20 μL مع dH2س. جلب إلى 20 μL مع dH2س.
200 وحدات الحمض النووي T4 يغاز (1 μl 200 U/μl ، جدول المواد) 200 وحدات الحمض النووي T4 يغاز (1 μl 200 U/μl ، جدول المواد)
بروتوكول ثيرموسيكلير (المستوي 0 ، T) بروتوكول ثيرموسيكلير (المستوي 1)
37 درجه مئوية لمده 10 دقائق دوره x 5 37 درجه مئوية لمده 10 دقائق دوره x 5
16 درجه مئوية لمده 10 دقائق 16 درجه مئوية لمده 10 دقائق
37 درجه مئوية لمده 20 دقيقه 37 درجه مئوية لمده 20 دقيقه
65 درجه مئوية لمده 10 دقائق 65 درجه مئوية لمده 10 دقائق
16 درجه مئوية (احتجاز) 16 درجه مئوية (احتجاز)

الجدول 2: بروتوكولات لجمعيات البوابة الذهبية في المستويات 0 و 1 و T. الجمعية في المستوي 0 والمتجات متقبل المستوي T يستخدم انزيم التقييد BpiI (يسار). الجمعية في المستوي 1 المتجات متقبل يستخدم تقييد الانزيم BsaI (يمين). وقد تم تكييف هذا الجدول من Vasudevan وآخرون12.

رقم التمهيدي تسلسل (5 '-3 ') الطول (bp) وصف
L0T إلى الامام جتكتكاتجاجكجاتاكاتا
المجموعة الثالثة
28 لتضخيم من المستوي 0 والمستوي T
L1 عكس في الجامعية
ACATAC
26 لتضخيم من المستوي 1
L1 إلى الامام كتجتجكاجاتاتاتجت
GGTG
24 لتضخيم من المستوي 1
L0T عكس الاتحاد التونسي للجرف 20 لتضخيم من المستوي 0 والمستوي T

الجدول 3: قائمه الإشعال للتحقق من صحة PCR أو تسلسل المتجات من المستوي 0 و 1 و T.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

البوابة الذهبية الجمعية لديها العديد من المزايا مقارنه مع غيرها من وسائل التجميع ناقلات, لا سيما من حيث قابليه20,21. ومع ذلك ، يتطلب إنشاء نظام البوابة الذهبية في المختبر وقتا لتطوير إلمام بالأجزاء المختلفة والمكتبات المتجهة المتقبلة وعمليات التجميع الشاملة. غالبا ما تكون هناك حاجه للتخطيط الدقيق لتجميعات أكثر تعقيدا أو عند تنفيذ عدد كبير من التجميعات المعقدة بشكل متواز (علي سبيل المثال ، جعل مجموعه من ناقلات المستوي T تحتوي علي شرائط متعددة للتعبير الجيني). نوصي أولا بادراج جميع تركيبات كاسيت التعبير الجيني المطلوبة ثم تعيين سير العمل من المستوي 0 إلى المستوي T في silico. خلال هذه العملية ، يجب علي المستخدمين النظر في المستوي 1 "دميه" أجزاء المتاحة في مجموعه MoClo النباتية التي تسمح للتجميع غير متسلسلة متجات المستوي 1 في المستوي T (علي سبيل المثال ، المستوي 1 الموقف 1 والموضع 3 ويمكن تجميع المتجات مع "دميه" جزء المستوي 1 الموقف 2) ، والتي يمكن ان تقلل من العدد الإجمالي لردود فعل الجمعية والاستنساخ الخطوات المطلوبة15.

توليف الحمض النووي هو عاده ابسط طريقه لبناء أجزاء جديده من المستوي 0. ومع ذلك ، عندما يكون الاستنساخ مطلوبا (علي سبيل المثال ، من الحمض النووي البلازميدات أو الجيني) ، فان تحسين تصميم الإشعال المستخدم لتضخيم الصوت مهم لتعظيم كفاءه تجميع ناقلات المستوي 0 اللاحق. الخطوتين الأكثر اهميه في تصميم التمهيدي هي: 1) التحقق من ان يتم تضمين الفوقية الصحيحة وهي في الاتجاه المناسب للامام وعكس الإشعال (الشكل 1 والجدول 1) ، و 2) ضمان ان طول التمهيدي تسلسل ان انالس إلى القالب طويلة بما فيه الكفاية (18 − 30 bp) وان قيمه Tm لهذا التسلسل (من الناحية المثالية 58 − 62 درجه مئوية) مماثله لزوج التمهيدي (الشكل 1ا). إذا كان التسلسل يتطلب التوطين ، فهناك العديد من الاستراتيجيات المتاحة. لمتواليات قصيرة (علي سبيل المثال ، < 200 bp) ، ويمكن تصميم زوج من الإشعال طويلة إلى الامام والعكس في الذي 3 ′ نهايات اننيل لبعضها البعض (اي تراكب من > 20 bp) وتشكل تسلسل مزدوج تقطعت بهم السبل بعد التضخيم. النسبة للتسلسلات الأطول ، يمكن تضخيم أجزاء منفصلة من التسلسل لأزاله مواقع التقييد غير القانونية ثم تجميعها باستخدام نهج تجميع البوابة الذهبية (الشكل 2). إذا كانت كفاءه التجميع مع منتجات PCR رديئه ، يمكن استنساخ الأجزاء الفردية من تسلسل المستوي 0 إلى متجه المستوي 1 العالمي (pAGM1311) ، الذي تم التحقق من صحته ، ثم تجميعه معا في متجه المستوي 0 متقبل المناسب15. A 2:1 ادراج: ويوصي نسبه المولي المتجهة متقبل لكفاءة الجمعية البوابة الذهبية. ومع ذلك ، بالنسبة للتجميعات فقط 2-3 ناقلات (علي سبيل المثال ، اثنين من مستوي 0 أجزاء ومتجه متقبل المستوي 1) ، الجمع بين ~ 100 ng من كل بانتظام ينتج عاده في الجمعيات الناجحة. وتميل كفاءه التجمعات إلى التناقص مع تزايد عدد النواقل المستخدمة لكل رد فعل ، مما يؤدي إلى انخفاض في مجموع عدد المستعمرات البيضاء بعد التحول (الشكل 3).

قبل الاقتران ، يوصي بالتحقق من صحة ناقلات المستوي T النهائية بواسطة خلاصه التقييد و PCR. نقل الحمض النووي الزوجي هو تقنيه أقاموا جيدا لسلالات ترتبط ، بما في ذلك تلك التي لا يمكن تحويلها بشكل طبيعي41،45. وتشمل الخطوات الهامه في بروتوكول الاقتران: 1) التعامل بعناية من المساعد e. كولاي سلاله بعد النمو بين عشيه وضحيها (علي سبيل المثال ، تجنب vortexing)35، 2) مع الحرص علي أزاله اثار تماما من المضادات الحيوية المستخدمة لتنمو المساعد البضائع e. القولونية سلالات ، 3) فتره حضانة مناسبه لخليط من سلالات البضائع والمساعد والبكتيريا الزرقاء (علي سبيل المثال ، فتره حضانة أطول كانت حاسمه ل s. الونجاتوس utex 2973) ، و 4) فتره النقل الاولي للخلية خليط علي الاغشيه في لوحات أجار BG11 التي تفتقر إلى المضادات الحيوية لمده 24 ساعة.

وينبغي ان تتطور المستعمرات ترتبط المعزولة علي الغشاء في غضون أسبوعين ل Synech sti الجهاز ال6803 و s. الونجاتوس utex 2973 ، والا فانه من المرجح ان الاقتران قد فشلت. ويمكن بعد ذلك اختبار العديد من التعديلات علي البروتوكول ، بما في ذلك 1) باستخدام ثقافة ترتبط ذات كثافة بداية اعلي (علي سبيل المثال ، OD750 = 1.5 − 2) ؛ 2) زيادة فتره الحضانة قبل نقلها إلى الغشاء ؛ و 3) تمديد فتره الحضانة الاوليه علي الغشاء من 24 h إلى 48 h (اي ، للسماح لمزيد من الوقت للتعبير عن الجينات المقاومة للمضادات الحيوية علي ناقل نقل). إذا كان الاقتران لا يزال يفشل ، يمكن ان يحاكم طرق بديله مثل الكهرباء53. تاكيد سلاله ترتبط المحورة وراثيا هو اكسرينوس مهم قبل المزيد من التجارب. وأخيرا ، فانه من الممارسات الجيدة لتاكيد حجم المتجات غير المتجانسة في سلاله ترتبط المحورة وراثيا. ويتطلب هذا الأخير استخراج الحمض النووي (المادة 5) ، والتحول إلى كولاي والاختيار (القسم 2.1) ، والتحقق من صحة النواقل (القسم 2.4).

يستخدم بروتوكول توصيف المروج المحدد كميات صغيره من الثقافة (اي 2 مل) كوسيلة لتحقيق منهجيه فحص عاليه الانتاجيه. ويمكن استخدام احجام أكبر اعتمادا علي المساحة البيولوجية الضوئية المتاحة ، والتي من شانها ان تساعد علي التخفيف من قضايا تبخر الثقافة. إذا كانت هناك حاجه لفحص الانتاجيه العالية مع حجم الثقافة الصغيرة ، فمن الضروري ان يكون الرطوبة العالية داخل غرفه النمو لكبح التبخر. يمكن ان يكون التبخر اثناء تجربه النمو ضارا بدقه قياسات العينة وصلاحيتها. قم بالتحقق من وحدات تخزين الثقافة اثناء التجربة وبعدها لتاكيد مقدار التبخر الذي حدث.

لقياسات قارئ لوحه ، من المهم لقياس الثقافات في الكثافات المنخفضة ، من الناحية المثالية OD750 < 1 ، لضمان الحصول علي النمو موثوقه وقابله للتكرار والبيانات مضان. لوحظ وجود علاقة خطيه بين رقم الخلية و OD750 فقط ضمن نطاق محدد54. لإنشاء هذا النطاق ، نوصي باجراء تخفيف تسلسلي (علي سبيل المثال ، من OD750 = 0.1 − 1.0) باستخدام التحويلية المعروفة حيث تم تاكيد الفلورية eyfp. التامر مضان المطلقة ضد الفلورية تطبيع (eYFP الفلوري/OD750) سوف تساعد علي تحديد نطاق العمل الخطي لكثافة الثقافة. وتشمل عده قراء لوحه ميزه "كسب" لتعديل حساسية كاشف الفلورية. في هذه الحالة ، يجب تعيين قيمه الكسب إلى مستوي مناسب قبل بدء التجربة وعدم تغييرها بين التشغيلات التجريبية المختلفة أو لن تكون البيانات قابله للمقارنة مباشره.

علي الرغم من ان تشغيل مختلف التدفقات الخلوية سوف تختلف بين الشركات المصنعة ، فمن المهم ان تاخذ قراءه فارغه من الحل المتوسط لتسهيل تحديد والنابضة من السكان ترتبط الهدف من اي اشاره الخلفية في المتوسط (الشكل 7ا ، ب). وبعد ذلك ، فان طرح القيمة الفلورية لعينه التحكم السالبة (مثل سلاله النوع البري) سيساعد علي أزاله الفلورية الاصليه (الشكل 7ج ، د). الأنبوب مضخم (pmt) الجهد المعلمة في تدفق المضخم لديه وظيفة مماثله لتحقيق مكاسب في لوحه القارئ ، اي زيادة أو تقليل حساسية للكشف عن كثافة الاشاره الفلورية. كما هو الحال مع قارئ لوحه ، وينبغي تعيين الجهد PMT إلى مستوي مناسب قبل البدء في التجربة55. بمجرد تعيين ، يجب الحفاظ علي قيمه PMT الجهد بين أشواط تجريبية مختلفه أو البيانات لن تكون قابله للمقارنة مباشره.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

ويعرب أصحاب البلاغ عن امتنانهم لشبكه التكنولوجيا الحيوية والبيولوجية الصناعية ومركز الابتكار في مجال التكنولوجيا الحيوية الصناعية (IBioIC) للدعم المالي. GARG, AASO و AP الاعتراف بالدعم التمويلي من برنامج الدكتوراه الحالة المالية BBSRC EASTBIO (منحه رقم BB/M010996/1), Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) برنامج الدكتوراه, و IBioIC-BBSRC شراكه التدريب التعاوني (CTP) برنامج الدكتوراه, التوالي. نشكر كونراد موليليفو (جامعه الملكة ماري في لندن) ، وبول اريك جينسن ، وجولي Annemarie يتا زيسلر (جامعه كوبنهاجن) للحصول علي ناقلات البلازميد والمساهمات والمشورة في البروتوكول.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) Thermo Fisher Scientific R0404 Used in 2.1.3.
Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt Sigma-Aldrich A2383 Used in Table 2.
Agar (microbiology tested) Sigma-Aldrich A1296-500g Used in 8.3.
Agarose Bioline BIO-41026 Used in 6.
Attune NxT Flow Cytometer Thermo Fisher Scientific - Used in 4.3.1.
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153 Used in Table 2.
BpiI (BbsI) Thermo Fisher Scientific ER1011 Used in Table 2.
BsaI (Eco31I) Thermo Fisher Scientific ER0291 Used in Table 2.
Carbenicillin disodium VWR International A1491.0005 Used in 2.1.3.
Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates Sigma-Aldrich CLS3527 Used in 4.1.3.
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Thermo Fisher Scientific BP231-100 Used in 3.6.2.
DNeasy Plant Mini Kit Qiagen 69104 DNA extraction kit. Used in 5.
FLUOstar Omega Microplate reader BMG Labtech - Used in 4.2.2.
GeneJET Plasmid Miniprep Kit Thermo Fisher Scientific K0503 Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2.
Glass beads (0.5 mm diameter) BioSpec Products 11079105 Used in 5.2.
Glycerol Thermo Fisher Scientific 10021083 Used in 2.3.1, 3.6.2.
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Thermo Fisher Scientific 10356553 Used in 2.1.3.
Kanamycin sulphate (Gibco) Thermo Fisher Scientific 11815-024 Used in 2.1.3.
Membrane filters (0.45 μm) MF-Millipore HAWP02500 Used in 3.3.7
Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEAR Greiner Bio-One 655096 Used in 4.2.1.
Monarch DNA Gel Extraction Kit New England Biolabs T1020S Used in 1.1.2.2.
Monarch PCR DNA Cleanup Kit New England Biolabs T1030 DNA purification kit. Used in 1.1.2.3.
Multitron Pro incubator with LEDs Infors HT - Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4.
MyTaq DNA Polymerase Bioline BIO-21108 Used in 7.1.
NanoDrop One Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W Used in 2.3.3.
One Shot TOP10 chemically competent E. coli Thermo Fisher Scientific C404010 Used in 2.1.1.
Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate) VWR International K813 Used in 4.3.2.
Q5High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0491S Used in 1.1.2.1.
Quick-Load 1 kb DNA Ladder New England Biolabs N0468S Used in Figure 4.
Screw-cap tubes (1.5 ml) Starstedt 72.692.210 Used in 3.6.3
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate VWR International J61820.06 Used in 2.1.3.
Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates Thermo Fisher Scientific 612U96 Used in 4.3.1.
T4 DNA ligase Thermo Fisher Scientific EL0011 Used in Table 2.
TissueLyser II Qiagen 85300 Bead mill. Used in 5.2.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luan, G., Lu, X. Tailoring cyanobacterial cell factory for improved industrial properties. Biotechnology Advances. 36, (2), 430-442 (2018).
  2. Madsen, M. A., Semerdzhiev, S., Amtmann, A., Tonon, T. Engineering mannitol biosynthesis in Escherichia coli and Synechococcus sp. PCC 7002 using a green algal fusion protein. ACS Synthetic Biology. 7, (12), 2833-2840 (2018).
  3. Menin, B., et al. Non-endogenous ketocarotenoid accumulation in engineered Synechocystis sp. PCC 6803. Physiologia Plantarum. 166, (1), 403-412 (2019).
  4. Varman, A. M., Yu, Y., You, L., Tang, Y. J. Photoautotrophic production of D-lactic acid in an engineered cyanobacterium. Microbial Cell Factories. 12, (1), 1-8 (2013).
  5. Vavitsas, K., et al. Responses of Synechocystis sp. PCC 6803 to heterologous biosynthetic pathways. Microbial Cell Factories. 16, 140 (2017).
  6. Yang, G., et al. Photosynthetic production of sunscreen shinorine using an engineered cyanobacterium. ACS Synthetic Biology. 7, (2), 664-671 (2018).
  7. Nielsen, A. Z., et al. Extending the biosynthetic repertoires of cyanobacteria and chloroplasts. Plant Journal. 87, (1), 87-102 (2016).
  8. Nielsen, J., Keasling, J. D. Engineering cellular metabolism. Cell. 164, (6), 1185-1197 (2016).
  9. Stensjö, K., Vavitsas, K., Tyystjärvi, T. Harnessing transcription for bioproduction in cyanobacteria. Physiologia Plantarum. 162, (2), 148-155 (2018).
  10. Santos-Merino, M., Singh, A. K., Ducat, D. C. New applications of synthetic biology tools for cyanobacterial metabolic engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 1-24 (2019).
  11. Lea-Smith, D. J., Vasudevan, R., Howe, C. J. Generation of marked and markerless mutants in model cyanobacterial species. Journal of Visualized Experiments. 111, e54001 (2016).
  12. Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180, (1), 39-55 (2019).
  13. Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile golden-gate framework towards universal DNA assembly. PLoS ONE. 13, (1), 1-18 (2018).
  14. Crozet, P., et al. Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo toolkit enabling synthetic biology in the microalga Chlamydomonas reinhardtii. ACS Synthetic Biology. 7, (9), 2074-2086 (2018).
  15. Engler, C., et al. A Golden Gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3, (11), 839-843 (2014).
  16. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5, (10), 1059-1069 (2016).
  17. Pollak, B., et al. Loop assembly: a simple and open system for recursive fabrication of DNA circuits. New Phytologist. 222, (1), 628-640 (2019).
  18. Werner, S., Engler, C., Weber, E., Gruetzner, R., Marillonnet, S. Fast track assembly of multigene constructs using golden gate cloning and the MoClo system. Bioengineered Bugs. 3, (1), 38-43 (2012).
  19. Patron, N. J., et al. Standards for plant synthetic biology: a common syntax for exchange of DNA parts. New Phytologist. 208, (1), 13-19 (2015).
  20. Chao, R., Mishra, S., Si, T., Zhao, H. Engineering biological systems using automated biofoundries. Metabolic Engineering. 42, 98-108 (2017).
  21. Chambers, S., Kitney, R., Freemont, P. The Foundry: the DNA synthesis and construction Foundry at Imperial College. Biochemical Society Transactions. 44, (3), 687-688 (2016).
  22. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, (5), 343-345 (2009).
  23. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Rare codon content affects the solubility of recombinant proteins in a codon bias-adjusted Escherichia coli strain. Microbial Cell Factories. 8, 1-9 (2009).
  24. Cambray, G., et al. Measurement and modeling of intrinsic transcription terminators. Nucleic Acids Research. 41, (9), 5139-5148 (2013).
  25. Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nature Methods. 10, (7), 659-664 (2013).
  26. Münch, R., et al. Virtual Footprint and PRODORIC: An integrative framework for regulon prediction in prokaryotes. Bioinformatics. 21, (22), 4187-4189 (2005).
  27. Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nature Biotechnology. 27, (10), 946-950 (2009).
  28. Englund, E., Liang, F., Lindberg, P. Evaluation of promoters and ribosome binding sites for biotechnological applications in the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Scientific Reports. 6, 36640 (2016).
  29. Heidorn, T., et al. Synthetic biology in cyanobacteria engineering and analyzing novel functions. Methods in Enzymology. 497, 539-579 (2011).
  30. Thiel, K., et al. Translation efficiency of heterologous proteins is significantly affected by the genetic context of RBS sequences in engineered cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Microbial Cell Factories. 17, 34 (2018).
  31. Liu, Q., Schumacher, J., Wan, X., Lou, C., Wang, B. Orthogonality and burdens of heterologous and gate gene circuits in E. coli. ACS Synthetic Biology. 7, (2), 553-564 (2018).
  32. Ferreira, E. A., et al. Expanding the toolbox for Synechocystis sp. PCC 6803: Validation of replicative vectors and characterization of a novel set of promoters. Synthetic Biology. (August), 1-39 (2018).
  33. Liang, F., Lindblad, P. Synechocystis PCC 6803 overexpressing RuBisCO grow faster with increased photosynthesis. Metabolic Engineering Communications. 4, 29-36 (2017).
  34. Taton, A., et al. Broad-host-range vector system for synthetic biology and biotechnology in cyanobacteria. Nucleic Acids Research. 42, (17), e136 (2014).
  35. Elhai, J., Wolk, C. P. Conjugal transfer of DNA to cyanobacteria. Methods in Enzymology. 167, (1984), 747-754 (1988).
  36. Gormley, E. P., Davies, J. Transfer of plasmid RSF1010 by conjugation from Escherichia coli to Streptomyces lividans and Mycobacterium smegmatis. Journal of Bacteriology. 173, (21), 6705-6708 (1991).
  37. Huang, H. H., Camsund, D., Lindblad, P., Heidorn, T. Design and characterization of molecular tools for a synthetic biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucleic Acids Research. 38, (8), 2577-2593 (2010).
  38. Huang, H. H., Lindblad, P. Wide-dynamic-range promoters engineered for cyanobacteria. Journal of Biological Engineering. 7, 10 (2013).
  39. Li, S., Sun, T., Xu, C., Chen, L., Zhang, W. Development and optimization of genetic toolboxes for a fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Metabolic Engineering. 48, 163-174 (2018).
  40. Pansegrau, W., Balzer, D., Kruft, V., Lurz, R., Lanka, E. In vitro assembly of relaxosomes at the transfer origin of plasmid RP4. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 87, (17), 6555-6559 (1990).
  41. Song, K., Tan, X., Liang, Y., Lu, X. The potential of Synechococcus elongatus UTEX 2973 for sugar feedstock production. Applied Microbiology and Biotechnology. 100, (18), 7865-7875 (2016).
  42. Waters, V. L., Guiney, D. G. Processes at the nick region link conjugation, T-DNA transfer and rolling circle replication. Molecular Microbiology. 9, (6), 1123-1130 (1993).
  43. Elhai, J., Vepritskiy, A., Muro-Pastor, A. M., Flores, E., Wolk, C. P. Reduction of conjugal transfer efficiency by three restriction activities of Anabaena sp. strain PCC 7120. Journal of Bacteriology. 179, (6), 1998-2005 (1997).
  44. Silva-Rocha, R., et al. The Standard European Vector Architecture (SEVA): A coherent platform for the analysis and deployment of complex prokaryotic phenotypes. Nucleic Acids Research. 41, (D1), D666-D675 (2013).
  45. Mandakovic, D., et al. CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization. Frontiers in Microbiology. 7, (FEB), 1-11 (2016).
  46. Masukawa, H., Inoue, K., Sakurai, H., Wolk, C. P., Hausinger, R. P. Site-directed mutagenesis of the Anabaena sp. strain PCC 7120 nitrogenase active site to increase photobiological hydrogen production. Applied and Environmental Microbiology. 76, (20), 6741-6750 (2010).
  47. Yu, J., et al. Synechococcus elongatus UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Scientific Reports. 5, (1), 8132 (2015).
  48. Ungerer, J., Wendt, K. E., Hendry, J. I., Maranas, C. D., Pakrasi, H. B. Comparative genomics reveals the molecular determinants of rapid growth of the cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 115, (50), E11761-E11770 (2018).
  49. Lepesteur, M., Martin, J. M., Fleury, A. A comparative study of different preservation methods for phytoplankton cell analysis by flow cytometry. Marine Ecology Progress Series. 93, (1-2), 55-63 (1993).
  50. Day, J. G. Cryopreservation of cyanobacteria. Cyanobacteria: An Economic perspective. Wiley Blackwell. New York. 319-327 (2014).
  51. Zhou, J., et al. Discovery of a super-strong promoter enables efficient production of heterologous proteins in cyanobacteria. Scientific Reports. 4, 4500 (2014).
  52. Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7, (11), 2665-2674 (2018).
  53. Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66, 174-176 (2006).
  54. Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6, 38828 (2016).
  55. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69, (9), 1037-1042 (2006).
التحوير الجيني لبكتيريا السيانيد بالاقتران باستخدام مجموعه أدوات الاستنساخ النموذجية السيسونات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gale, G. A. R., Schiavon Osorio, A. A., Puzorjov, A., Wang, B., McCormick, A. J. Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit. J. Vis. Exp. (152), e60451, doi:10.3791/60451 (2019).More

Gale, G. A. R., Schiavon Osorio, A. A., Puzorjov, A., Wang, B., McCormick, A. J. Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit. J. Vis. Exp. (152), e60451, doi:10.3791/60451 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter