JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biology

Genetisk modifisering av cyanobakterier av Bøyning bruke CyanoGate Modular kloning Toolkit

Published: October 31, 2019
doi:
10.3791/60451
, , , ,
1Institute of Molecular Plant Sciences, School of Biological Sciences,University of Edinburgh, 2Centre for Synthetic and Systems Biology,University of Edinburgh, 3Institute of Quantitative Biology, Biochemistry and Biotechnology, School of Biological Sciences,University of Edinburgh

Summary

Her presenterer vi en protokoll som beskriver hvordan jeg) monterer en selv-replikere vektor bruker CyanoGate modulære kloning Toolkit, II) innføre vektoren i en cyanobacterial vert ved Bøyning, og III) karakterisere transgene cyanobakterier stammer ved hjelp av en plate leser eller strømnings flowcytometri.

Abstract

Cyanobakterier er en mangfoldig gruppe av prokaryote fotosyntetiske organismer som kan være genetisk modifisert for fornybar produksjon av nyttige industrielle varer. Nylige fremskritt i syntetisk biologi har ført til utvikling av flere kloning verktøysett som CyanoGate, et standardisert modulært kloning system for å bygge plasmider vektorer for påfølgende transformasjon eller ekteskapelige overføring til cyanobakterier. Her skisserer vi en detaljert metode for montering av en selv-replikere vektor (f. eks, bærer en fluorescerende markør uttrykk kassett) og ekteskapelige overføring av vektoren inn i cyanobacterial stammer Synechocystis Sp. PCC 6803 eller Synechococcus elongatus UTEX 2973. I tillegg skisserer vi hvordan å karakterisere ytelsen til en genetisk del (for eksempel en promoter) ved hjelp av en plate leser eller flow flowcytometri.

Introduction

Cyanobakterier er autotrofe bakterier som kan brukes for biosyntesen av et bredt utvalg av naturlige og heterologous høy verdi metabolske produkter1,2,3,4,5, 6i den. Flere hekk må fortsatt overvinnes for å utvide sin kommersielle levedyktighet, spesielt, den relativt dårlige rentene sammenlignet med heterotrofe bio-plattformer (f. eks, Escherichia coli og gjær)7. Den nylige utvidelse av tilgjengelige genetisk engineering verktøy og opptak av syntetisk biologi paradigmet i cyanobacterial forskning bidrar til å overvinne slike utfordringer og videreutvikle cyanobakterier som effektiv biofactories8, 9,10.

De viktigste tilnærmingene for å innføre DNA i cyanobakterier er transformasjon, bøyning og electroporation. Vektorer overføres til cyanobakterier ved transformasjon eller electroporation er “selvmord” vektorer (dvs. integrerende vektorer som letter homologe rekombinasjon), mens selv replikere vektorer kan overføres til cyanobakterier av transformasjon, Bøyning eller electroporation. For det første er en protokoll tilgjengelig for Engineering modell arter mottagelig for naturlig transformasjon11. Flere i den seneste tid, en Modular Klon (MoClo) verktøyet for cyanobakterier alarmert CyanoGate er blitt bebygget det ansette en standardisert gylden gate vektor montering metoden for ingeniørvitenskap benytter naturlig transformasjon, electroporation eller Bøyning12.

Golden Gate-type montering teknikker har blitt stadig mer populært de siste årene, og montering standarder og del bibliotekene er nå tilgjengelig for en rekke organismer13,14,15,16 ,17. Golden Gate bruker type IIS begrensning enzymer (f. eks BsaI, BpiI, BsmBI, BtgZI og AarI) og en drakt av aksept Orer og unike overheng å lette retningsbestemt hierarkisk montering av flere sekvenser i en “One pot” montering reaksjon. Type IIS restriksjon enzymer gjenkjenne en unik asymmetrisk sekvens og kutte en definert avstand fra deres anerkjennelse nettsteder for å generere en forskjøvet, “klebrig ende” cut (vanligvis en 4 nukleotid [NT] overheng), som senere kan utnyttes til å kjøre bestilte DNA monterings reaksjoner15,18. Dette har muliggjort utviklingen av store biblioteker av modulære nivå 0 deler (for eksempel arrangører, åpne lese RAM mer og terminatorer) definert av en felles syntaks, for eksempel PhytoBricks standard19. Nivå 0 deler kan deretter lett monteres i nivå 1 uttrykks kassetter, som følger mer komplekse høyere rekkefølge samlinger (f. eks multigene uttrykk konstruksjoner) kan bygges i en Acceptor vektor av valget12,15. En viktig fordel med Golden Gate-type montering teknikker er deres amenability til automatisering ved høy gjennomstrømming fasiliteter, slik som DNA støperier20,21, som kan tillate for testing av komplekse eksperimentelle design som kan ikke lett oppnås ved manuell arbeidskraft.

CyanoGate bygger på det etablerte anlegget MoClo system12,15. Å innlemme en ny del i CyanoGate, delen sekvensen må først være tamme, dvs., “ulovlig” anerkjennelse nettsteder for BsaI og BpiI må fjernes. I tilfelle av en del koding for en åpen lesning ramme (dvs. en koding sekvens, CDS), kan anerkjennelse nettsteder bli forstyrret ved å generere synonymt mutasjoner i sekvensen (dvs. endre en Codon til et alternativ som koder for samme aminosyre rester). Dette kan oppnås ved en rekke tilnærminger, alt fra DNA-syntese til polymerase kjedere reaksjon (PCR) forsterkning-baserte strategier som Gibson forsamlingen22. Avhengig av uttrykket vert som brukes, bør det utvises forsiktighet for å unngå innføringen av sjeldne kodon som kan hemme effektiviteten av oversettelsen23. Fjerne anerkjennelse nettsteder i promoter og Terminator sekvenser er vanligvis en risikofylt forsøke, som modifikasjoner kan påvirke funksjon og delen kan ikke utføre som forventet. For eksempel kan endringer i antatte transkripsjon faktor bindende nettsteder eller ribosom bindende nettsted innen en promoter endre styrke og respons til induksjon/undertrykkelse. Likeledes modifikasjoner til viktige Terminator strukturelle funksjoner (f. eks GC rike stammen, loop og Poly-U Tail) kan endre oppsigelse effektivitet og virkning gen Expression24,25. Selv om flere elektroniske ressurser er tilgjengelige for å forutsi aktiviteten til promoter og Terminator sekvenser, og informere om en foreslått mutasjon vil påvirke ytelsen26,27, disse verktøyene er ofte dårlig prediktorer av ytelse i cyanobakterier28,29,30.. Som sådan, in vivo karakterisering av modifiserte deler er fortsatt anbefalt å bekrefte aktivitet. Å bistå med kloning av gjenstridige sekvenser, CyanoGate inneholder en lav kopi kloning Acceptor vektor basert på BioBrick vektor pSB4K512,16,31. Videre, en “design og bygge” Portal er tilgjengelig gjennom Edinburgh Genova Foundry å hjelpe til med vektor design (dab.genomefoundry.org). Til slutt, og viktigst, inkluderer CyanoGate to Level T Acceptor vektor design (tilsvarende Level 2 Acceptor vektorer)15 for innføring av DNA i cyanobakterier bruker selvmords vektorer, eller bred Host-Range vektorer i stand til selv-replikering i flere cyanobacterial arter32,33,34.

Her vil vi fokusere på å beskrive en protokoll for å generere Level T selv replikering vektorer og genetisk modifisering av Synechocystis PCC 6803 og Synechococcus elongatus UTEX 2973 (Synechocystis PCC 6803 og S. elongatus UTEX 2973 heretter) av Bøyning (også kjent som Tri-Parental paring). Ekteskapelige overføring av DNA mellom bakterielle celler er en godt beskrevet prosess og har vært tidligere brukt for Engineering cyanobacterial arter, spesielt de som ikke er naturlig kompetente, slik som S. elongatus UTEX 297335, 36,37,38,39,40,41. I korte trekk, cyanobacterial kulturer er inkubert med en E. coli stamme bærer vektoren skal overføres (den “lasten” vektor) og vektorer (enten i samme E. coli belastning eller i flere stammer) for å aktivere Bøyning (“mobiliserer” og “Helper” vektorer). Det er nødvendig med fire nøkkel vilkår for ekteskapelige overføring: 1) direkte kontakt mellom cellene som er involvert i DNA-overføring, 2) laste vektoren må være kompatibelt med Bøyning (dvs. den må inneholde en passende opprinnelse for overføring (oriT), også kjent som en bom (grunnlaget for mobilitet) nettsted), 3) et DNA skår protein (f. eks, kodet av Mob GENET) som Nicks DNA ved oriT å INITIERE enkelt-strandet overføring av DNA i cyanobacterium må være til stede og uttrykt fra enten lasten eller Helper vektorer, og 4) den overførte DNA må ikke ødelegges i mottaker cyanobacterium (dvs. må være motstandsdyktig mot degradering av for eksempel restriksjon endonuclease aktivitet)35,42. For lasten vektoren å vedvare, opprinnelsen til replikering må være kompatibel med mottakeren cyanobacterium å tillate for selv-replikering og spredning i datter celler innlegg divisjon. Å hjelpe med vilkårene 3 og 4, adskillige hjalp vektorer er anvendelig igjennom Addgene og annet reklamen kilder det omsette til kode for Mob likeledes idet adskillige methylases å beskytte fra innfødt endonucleases inne det vert cyanobacterium43. I denne protokollen, ble Bøyning tilrettelagt av en MC1061 E. coli stamme bærer mobiliserer og hjelper vektorer pRK24 (www. addgeneorg/51950) og pRL528 (www.addgene.org/58495), henholdsvis. Forsiktighet må utvises ved valg av vektorer som skal brukes til ekteskapelige overføring. For eksempel, i CyanoGate Kit den selv-replikere lasten vektor pPMQAK1-T koder for en Mob protein12. Men pSEVA421-T ikke44, og som sådan, må Mob uttrykkes fra en passende hjelper vektor. De vektorer som brukes bør også være hensiktsmessig å målet organisme. For eksempel, effektiv ekteskapelige overføring i Anabaena Sp. PCC 7120 krever en hjelper vektor som beskytter mobiliserer vektor mot fordøyelsen (f. eks pRL623, som koder for de tre methylases AvaiM, Eco47iiM og Ecot22iM)45, i 46.

I denne protokollen vi ytterligere skissere hvordan å karakterisere utførelsen av deler (dvs. arrangører) med et fluorescerende markør ved hjelp av en plate leser eller en flyt flowcytometer. Flow cytometers er i stand til å måle fluorescens på en enkelt celle basis for en stor befolkning. Videre Flow cytometers tillate brukere å “gate” de ervervet data og fjerne bakgrunnsstøy (f. eks, fra partikler i kultur eller forurensning). I kontrast, plate lesere erverve en samlet fluorescens måling av et gitt volum av kultur, vanligvis i flere replikere brønner. Viktige fordeler av plate lesere over cytometers inkluderer lavere kostnader, høyere tilgjengelighet og vanligvis ingen krav til spesialist programvare for nedstrøms dataanalyser. De viktigste ulempene med plate lesere er relativt lavere følsomhet i forhold til cytometers og potensielle problemer med den optiske tettheten av målte kulturer. For sammenlignende analyser, plate leser prøver må være normalisert for hver brønn (for eksempel til en måling av kultur tetthet, vanligvis tatt som absorbansen ved optisk tetthet ved 750 NM [OD750]), som kan føre til unøyaktigheter for prøver som er for tett og/eller ikke godt blandet (f. eks, når utsatt for aggregering eller flokk ule Rings).

Som en oversikt, her viser vi i detalj prinsippene for å generere nivå 0 deler, etterfulgt av hierarkisk montering ved hjelp av CyanoGate Kit og kloning til en vektor egnet for ekteskapelige overføring. Vi viser deretter ekteskapelige overføringsprosessen, utvalg av axenic transconjugant stammer uttrykker en fluorescerende markør, og påfølgende oppkjøp av fluorescens data ved hjelp av en flyt flowcytometer eller en plate leser.

Protocol

1. Vector montering ved hjelp av Plant MoClo og CyanoGate verktøysett Merk: før du fortsetter med vektor montering, anbefales det sterkt at brukerne gjør seg kjent med vektoren nivå strukturer av anlegget og CyanoGate MoClo systemer12,15. Bygging av nivå 0 delerMerk: nivå 0-deler kan bli syntetisert som komplette vektorer eller som lineære sekvenser for montering med nivå 0-aksept Orer (for eksempel gBlocks, IDT)….

Representative Results

For å demonstrere Golden Gate montering arbeidsflyt, en uttrykks kassett ble montert i nivå 1 posisjon 1 (Forward) Acceptor vektor (pICH47732) som inneholder følgende nivå 0 deler: arrangøren av C-phycocyanin operon Pcpc560 (PC 0.005), kodingen sekvensen for eYFP (pC 0.008) og den doble Terminator TrrnB (PC 0.082)12. Etter transformasjon av monterings reaksjonen ble vellykkede forsamlinger identifisert ved bruk av standa…

Discussion

Golden Gate forsamlingen har flere fordeler sammenlignet med andre vektor montering metoder, spesielt i form av skalerbarhet20,21. Likevel, å sette opp Golden Gate-systemet i et laboratorium krever tid til å utvikle en fortrolighet med de ulike delene og Acceptor vektor biblioteker og generelle monteringsprosesser. Nøye planlegging er ofte nødvendig for mer komplekse forsamlinger eller når du utfører et stort antall komplekse forsamlinger parallelt (for eks…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne er takknemlige for PHYCONET bioteknologi og biologisk vitenskap Research Council (BBSRC) nettverk i Industrial bioteknologi og bioenergi (NIBB) og Industrial bioteknologi Innovation Centre (IBioIC) for økonomisk støtte. GARG, AASO og AP erkjenner finansiering støtte fra BBSRC EASTBIO CASE PhD-programmet (gi nummer BB/M010996/1), Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) PhD-programmet, og IBioIC-BBSRC Collaborative Training Partnership (CTP) PhD-programmet, Henholdsvis. Vi takker Conrad Mullineaux (Queen Mary University of London), og Poul Eric Jensen og Julie Annemarie Zita Zedler (Universitetet i København) for plasmider vektor og protokoll bidrag og råd.

Materials

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) Thermo Fisher Scientific R0404 Used in 2.1.3.
Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt Sigma-Aldrich A2383 Used in Table 2.
Agar (microbiology tested) Sigma-Aldrich A1296-500g Used in 8.3.
Agarose Bioline BIO-41026 Used in 6.
Attune NxT Flow Cytometer Thermo Fisher Scientific – Used in 4.3.1.
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153 Used in Table 2.
BpiI (BbsI) Thermo Fisher Scientific ER1011 Used in Table 2.
BsaI (Eco31I) Thermo Fisher Scientific ER0291 Used in Table 2.
Carbenicillin disodium VWR International A1491.0005 Used in 2.1.3.
Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates Sigma-Aldrich CLS3527 Used in 4.1.3.
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Thermo Fisher Scientific BP231-100 Used in 3.6.2.
DNeasy Plant Mini Kit Qiagen 69104 DNA extraction kit. Used in 5.
FLUOstar Omega Microplate reader BMG Labtech – Used in 4.2.2.
GeneJET Plasmid Miniprep Kit Thermo Fisher Scientific K0503 Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2.
Glass beads (0.5 mm diameter) BioSpec Products 11079105 Used in 5.2.
Glycerol Thermo Fisher Scientific 10021083 Used in 2.3.1, 3.6.2.
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Thermo Fisher Scientific 10356553 Used in 2.1.3.
Kanamycin sulphate (Gibco) Thermo Fisher Scientific 11815-024 Used in 2.1.3.
Membrane filters (0.45 μm) MF-Millipore HAWP02500 Used in 3.3.7
Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEAR Greiner Bio-One 655096 Used in 4.2.1.
Monarch DNA Gel Extraction Kit New England Biolabs T1020S Used in 1.1.2.2.
Monarch PCR DNA Cleanup Kit New England Biolabs T1030 DNA purification kit. Used in 1.1.2.3.
Multitron Pro incubator with LEDs Infors HT – Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4.
MyTaq DNA Polymerase Bioline BIO-21108 Used in 7.1.
NanoDrop One Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W Used in 2.3.3.
One Shot TOP10 chemically competent E. coli Thermo Fisher Scientific C404010 Used in 2.1.1.
Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate) VWR International K813 Used in 4.3.2.
Q5High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0491S Used in 1.1.2.1.
Quick-Load 1 kb DNA Ladder New England Biolabs N0468S Used in Figure 4.
Screw-cap tubes (1.5 ml) Starstedt 72.692.210 Used in 3.6.3
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate VWR International J61820.06 Used in 2.1.3.
Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates Thermo Fisher Scientific 612U96 Used in 4.3.1.
T4 DNA ligase Thermo Fisher Scientific EL0011 Used in Table 2.
TissueLyser II Qiagen 85300 Bead mill. Used in 5.2.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luan, G., Lu, X. Tailoring cyanobacterial cell factory for improved industrial properties. Biotechnology Advances. 36 (2), 430-442 (2018).
  2. Madsen, M. A., Semerdzhiev, S., Amtmann, A., Tonon, T. Engineering mannitol biosynthesis in Escherichia coli and Synechococcus sp. PCC 7002 using a green algal fusion protein. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2833-2840 (2018).
  3. Menin, B., et al. Non-endogenous ketocarotenoid accumulation in engineered Synechocystis sp. PCC 6803. Physiologia Plantarum. 166 (1), 403-412 (2019).
  4. Varman, A. M., Yu, Y., You, L., Tang, Y. J. Photoautotrophic production of D-lactic acid in an engineered cyanobacterium. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-8 (2013).
  5. Vavitsas, K., et al. Responses of Synechocystis sp. PCC 6803 to heterologous biosynthetic pathways. Microbial Cell Factories. 16, 140 (2017).
  6. Yang, G., et al. Photosynthetic production of sunscreen shinorine using an engineered cyanobacterium. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 664-671 (2018).
  7. Nielsen, A. Z., et al. Extending the biosynthetic repertoires of cyanobacteria and chloroplasts. Plant Journal. 87 (1), 87-102 (2016).
  8. Nielsen, J., Keasling, J. D. Engineering cellular metabolism. Cell. 164 (6), 1185-1197 (2016).
  9. Stensjö, K., Vavitsas, K., Tyystjärvi, T. Harnessing transcription for bioproduction in cyanobacteria. Physiologia Plantarum. 162 (2), 148-155 (2018).
  10. Santos-Merino, M., Singh, A. K., Ducat, D. C. New applications of synthetic biology tools for cyanobacterial metabolic engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 1-24 (2019).
  11. Lea-Smith, D. J., Vasudevan, R., Howe, C. J. Generation of marked and markerless mutants in model cyanobacterial species. Journal of Visualized Experiments. 111, e54001 (2016).
  12. Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
  13. Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile golden-gate framework towards universal DNA assembly. PLoS ONE. 13 (1), 1-18 (2018).
  14. Crozet, P., et al. Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo toolkit enabling synthetic biology in the microalga Chlamydomonas reinhardtii. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2074-2086 (2018).
  15. Engler, C., et al. A Golden Gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
  16. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  17. Pollak, B., et al. Loop assembly: a simple and open system for recursive fabrication of DNA circuits. New Phytologist. 222 (1), 628-640 (2019).
  18. Werner, S., Engler, C., Weber, E., Gruetzner, R., Marillonnet, S. Fast track assembly of multigene constructs using golden gate cloning and the MoClo system. Bioengineered Bugs. 3 (1), 38-43 (2012).
  19. Patron, N. J., et al. Standards for plant synthetic biology: a common syntax for exchange of DNA parts. New Phytologist. 208 (1), 13-19 (2015).
  20. Chao, R., Mishra, S., Si, T., Zhao, H. Engineering biological systems using automated biofoundries. Metabolic Engineering. 42, 98-108 (2017).
  21. Chambers, S., Kitney, R., Freemont, P. The Foundry: the DNA synthesis and construction Foundry at Imperial College. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 687-688 (2016).
  22. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  23. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Rare codon content affects the solubility of recombinant proteins in a codon bias-adjusted Escherichia coli strain. Microbial Cell Factories. 8, 1-9 (2009).
  24. Cambray, G., et al. Measurement and modeling of intrinsic transcription terminators. Nucleic Acids Research. 41 (9), 5139-5148 (2013).
  25. Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nature Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
  26. Münch, R., et al. Virtual Footprint and PRODORIC: An integrative framework for regulon prediction in prokaryotes. Bioinformatics. 21 (22), 4187-4189 (2005).
  27. Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nature Biotechnology. 27 (10), 946-950 (2009).
  28. Englund, E., Liang, F., Lindberg, P. Evaluation of promoters and ribosome binding sites for biotechnological applications in the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Scientific Reports. 6, 36640 (2016).
  29. Heidorn, T., et al. Synthetic biology in cyanobacteria engineering and analyzing novel functions. Methods in Enzymology. 497, 539-579 (2011).
  30. Thiel, K., et al. Translation efficiency of heterologous proteins is significantly affected by the genetic context of RBS sequences in engineered cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Microbial Cell Factories. 17, 34 (2018).
  31. Liu, Q., Schumacher, J., Wan, X., Lou, C., Wang, B. Orthogonality and burdens of heterologous and gate gene circuits in E. coli. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 553-564 (2018).
  32. Ferreira, E. A., et al. Expanding the toolbox for Synechocystis sp. PCC 6803: Validation of replicative vectors and characterization of a novel set of promoters. Synthetic Biology. (August), 1-39 (2018).
  33. Liang, F., Lindblad, P. Synechocystis PCC 6803 overexpressing RuBisCO grow faster with increased photosynthesis. Metabolic Engineering Communications. 4, 29-36 (2017).
  34. Taton, A., et al. Broad-host-range vector system for synthetic biology and biotechnology in cyanobacteria. Nucleic Acids Research. 42 (17), e136 (2014).
  35. Elhai, J., Wolk, C. P. Conjugal transfer of DNA to cyanobacteria. Methods in Enzymology. 167 (1984), 747-754 (1988).
  36. Gormley, E. P., Davies, J. Transfer of plasmid RSF1010 by conjugation from Escherichia coli to Streptomyces lividans and Mycobacterium smegmatis. Journal of Bacteriology. 173 (21), 6705-6708 (1991).
  37. Huang, H. H., Camsund, D., Lindblad, P., Heidorn, T. Design and characterization of molecular tools for a synthetic biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2577-2593 (2010).
  38. Huang, H. H., Lindblad, P. Wide-dynamic-range promoters engineered for cyanobacteria. Journal of Biological Engineering. 7, 10 (2013).
  39. Li, S., Sun, T., Xu, C., Chen, L., Zhang, W. Development and optimization of genetic toolboxes for a fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Metabolic Engineering. 48, 163-174 (2018).
  40. Pansegrau, W., Balzer, D., Kruft, V., Lurz, R., Lanka, E. In vitro assembly of relaxosomes at the transfer origin of plasmid RP4. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 87 (17), 6555-6559 (1990).
  41. Song, K., Tan, X., Liang, Y., Lu, X. The potential of Synechococcus elongatus UTEX 2973 for sugar feedstock production. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (18), 7865-7875 (2016).
  42. Waters, V. L., Guiney, D. G. Processes at the nick region link conjugation, T-DNA transfer and rolling circle replication. Molecular Microbiology. 9 (6), 1123-1130 (1993).
  43. Elhai, J., Vepritskiy, A., Muro-Pastor, A. M., Flores, E., Wolk, C. P. Reduction of conjugal transfer efficiency by three restriction activities of Anabaena sp. strain PCC 7120. Journal of Bacteriology. 179 (6), 1998-2005 (1997).
  44. Silva-Rocha, R., et al. The Standard European Vector Architecture (SEVA): A coherent platform for the analysis and deployment of complex prokaryotic phenotypes. Nucleic Acids Research. 41 (D1), D666-D675 (2013).
  45. Mandakovic, D., et al. CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization. Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).
  46. Masukawa, H., Inoue, K., Sakurai, H., Wolk, C. P., Hausinger, R. P. Site-directed mutagenesis of the Anabaena sp. strain PCC 7120 nitrogenase active site to increase photobiological hydrogen production. Applied and Environmental Microbiology. 76 (20), 6741-6750 (2010).
  47. Yu, J., et al. Synechococcus elongatus UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Scientific Reports. 5 (1), 8132 (2015).
  48. Ungerer, J., Wendt, K. E., Hendry, J. I., Maranas, C. D., Pakrasi, H. B. Comparative genomics reveals the molecular determinants of rapid growth of the cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 115 (50), E11761-E11770 (2018).
  49. Lepesteur, M., Martin, J. M., Fleury, A. A comparative study of different preservation methods for phytoplankton cell analysis by flow cytometry. Marine Ecology Progress Series. 93 (1-2), 55-63 (1993).
  50. Day, J. G. Cryopreservation of cyanobacteria. Cyanobacteria: An Economic perspective. , 319-327 (2014).
  51. Zhou, J., et al. Discovery of a super-strong promoter enables efficient production of heterologous proteins in cyanobacteria. Scientific Reports. 4, 4500 (2014).
  52. Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
  53. Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66, 174-176 (2006).
  54. Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6, 38828 (2016).
  55. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).

Tags

Genetic ModificationCyanobacteriaConjugationCyanoGateModular CloningSynthetic BiologyRenewable BiotechnologyTriparental MatingTransformationSynechocystisSynechococcusE. ColiHelper StrainPlasmids

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gale, G. A. R., Schiavon Osorio, A. A., Puzorjov, A., Wang, B., McCormick, A. J. Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit. J. Vis. Exp. (152), e60451, doi:10.3791/60451 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image