Здесь мы представляем протокол, описывающий, как i) собрать самовоспроизводящий вектор с помощью модульного инструментария клонирования CyanoGate, ii) ввести вектор в цианобактериальный хост путем спряжения, и iii) характеризуют трансгенные штаммы цианобактерий с помощью плита читателя или потока цитометрии.
Цианобактерии представляют собой разнообразную группу прокариотических фотосинтетических организмов, которые могут быть генетически модифицированы для возобновляемого производства полезных промышленных товаров. Последние достижения в области синтетической биологии привели к разработке нескольких наборов инструментов клонирования, таких как CyanoGate, стандартизированная модульная система клонирования для построения векторов плазмида для последующей трансформации или супружеской передачи в цианобактерии. Здесь мы намечаем детальный метод для сборки самовоспроизводящегося вектора (например, проведение флуоресцентной маркерной экспрессии) и супружеской передачи вектора в цианобактериальные штаммы Synechocystis sp. PCC 6803 или Synechococcus эллонгат UTEX 2973. Кроме того, мы описываем, как охарактеризовать производительность генетической части (например, промоутер) с помощью считывателя пластин или цитометрии потока.
Цианобактерии являются аутотрофными бактериями, которые могут быть использованы для биосинтеза широкого спектра природных и гетерологических продуктов высокой стоимости метаболических1,2,3,4,5 6. Несколько препятствий еще предстоит преодолеть, чтобы расширить свою коммерческую жизнеспособность, прежде всего, относительно низкие урожаи по сравнению с гетеротрофной био-платформ (например, Escherichia coli и дрожжей)7. Недавнее расширение доступных инструментов генной инженерии и поглощение парадигмы синтетической биологии в цианобактериальных исследованиях помогает преодолеть такие проблемы и дальнейшее развитие цианобактерий как эффективных биофабрик8, 9,10.
Основными подходами к внедрению ДНК в цианобактерии являются трансформация, спряжение и электропорация. Переносчики, передаваемые к цианобактериям путем трансформации или электропорации, являются «самоубийственные» векторами (т.е. интегративными векторами, способствующих гомологичной рекомбинации), в то время как самовоспроизводящиеся векторы могут быть перенесены на цианобактерии трансформация, спряжение или электропорация. Для первого, протокол доступен для инженерных видов модели поддаются естественной трансформации11. Совсем недавно был разработан модульный набор инструментов для клонирования (MoClo) для цианобактерий под названием CyanoGate, который использует стандартизированный метод векторной сборки Золотых ворот для проектирования с использованием естественной трансформации, электропорации или спряжения12.
Технологии сборки типа «Золотые ворота» становятся все более популярными в последние годы, а стандарты сборки и библиотеки частей теперь доступны для различных организмов13,14,15,16 ,17. Золотые ворота использует ферменты ограничения IIS типа (например, BsaI, BpiI, BsmBI, Btg’i и AarI) и костюм приемников и уникальные свесы для облегчения направленной иерархической сборки нескольких последовательностей в реакции сборки «одного горшка». Ферменты ограничения типа IIS распознают уникальную асимметричную последовательность и вырезают определенное расстояние от их сайтов распознавания, чтобы создать пошатнувшееся, «липкий конец» разреза (обычно 4 нуклеотида (nt) свеса), которые могут быть впоследствии использованы для привода упорядоченной ДНК сборки реакции15,18. Это способствовало развитию больших библиотек модульных частей уровня 0 (например, промоутеров, открытых кадров для чтения и терминаторов), определяемых общим синтаксисом, таким как стандарт PhytoBricks19. Части уровня 0 могут быть легко собраны в кассеты выражения уровня 1, после чего более сложные сборки более высокого порядка (например, многогенные конструкции выражения) могут быть построены в векторе принятия выбора12,15. Ключевым преимуществом методов сборки типа Golden Gate является их удобство автоматизации на высокопроизводительных объектах, таких как ДНК-литейные заводы20,21, которые могут позволить для тестирования сложных экспериментальных конструкций, которые не может быть легко достигнуто с помощью ручного труда.
CyanoGate строится на установленной системе Завода MoClo12,15. Для включения новой части в CyanoGate, часть последовательности должны быть сначала одомашнены, т.е. “незаконные” признания сайтов для BsaI и BpiI должны быть удалены. В случае кодирования детали для открытого кадра чтения (т.е. последовательности кодирования, CDS) сайты распознавания могут быть нарушены путем генерации синонимных мутаций в последовательности (т.е. изменение кодона на альтернативу, которая кодирует тот же остатками аминокислоты). Это может быть достигнуто с помощью различных подходов, начиная от синтеза ДНК полимеразы цепной реакции (PCR) усиления на основе стратегий, таких как Гибсон сборки22. В зависимости от используемого принимающего выражения следует позаботиться о том, чтобы избежать введения редких кодонов, которые могут препятствовать эффективности перевода23. Удаление сайтов распознавания в последовательности промоутера и терминатора, как правило, более рискованное усилие, так как изменения могут повлиять на функцию и часть может не выполнять, как ожидалось. Например, изменения в местах связывания фактора транскрипции или ribosome связывающий сайт внутри промоутера могут изменить силу и отзывчивость к индукции/репрессии. Аналогичным образом, изменения в ключевых структурных характеристиках терминатора (например, богатый стебель GC, петля и поли-U хвост) могут изменить эффективность прекращения и эффект экспрессии гена24,25. Хотя несколько интернет-ресурсов доступны для прогнозирования активности промотора и последовательности терминаторов, и сообщить, повлияет ли предлагаемая мутация на производительность26,27, эти инструменты часто являются плохими предикторами производительность у цианобактерий28,29,30.. Таким образом, in vivo характеристика модифицированных частей по-прежнему рекомендуется для подтверждения активности. Для оказания помощи в клонировании непокорных последовательностей, CyanoGate включает в себя низкий вектор клонирования копий на основе векторного bioBrick pSB4K512,16,31. Кроме того, портал “Дизайн и сборка” доступен через Эдинбургский геном литейный завод, чтобы помочь с векторным дизайном (dab.genomefoundry.org). Наконец, и самое главное, CyanoGate включает в себя два векторных конструкций приемного уровня T (эквивалент вектору приемного уровня 2)15 для введения ДНК в цианобактерии с использованием векторов самоубийств, или широких векторов диапазона, способных к самовоспроизводствам в нескольких видов цианобактерий32,33,34.
Здесь мы сосредоточимся на описании протокола для генерации самовоспроизводящих векторов уровня T и генетической модификации Synechocystis PCC 6803 и Synechococcus elongatus UTEX 2973(Synechocystis PCC 6803 и S. elongatus UTEX 2973 в дальнейшем) путем спряжения (также известный как три-родительских спаривания). Супружеская передача ДНК между бактериальными клетками является хорошо описанным процессом и ранее использовалась для инженерных цианобактериальных видов, в частности тех, которые не являются естественными компетентными, такими как S. elongatus UTEX 297335, 36,37,38,39,40,41. Короче говоря, цианобактериальные культуры инкубируются штаммом кишечной палочки, несущим переносчик (“грузовой” вектор) и векторами (либо в том же штамме кишечной палочки, либо в дополнительных штаммах), чтобы обеспечить спряжение (“мобилизатор” и векторы «помощника»). Для супружеской передачи требуется четыре ключевых условия: 1) прямой контакт между клетками, участвующими в передаче ДНК, 2) вектор груза должен быть совместим с системой спряжения (т.е. он должен содержать подходящее происхождение передачи(oriT), также известный как бом (основа мобильности) сайт), 3) ДНК nicking белка (например, кодируется моб гена), что ники ДНК на oriT инициировать одноцепочечную передачу ДНК в цианобактерий должны присутствовать и выражается от грузового или помощника векторов, и 4) переданная ДНК не должна быть уничтожена в цианобактериях цианобактерия (т.е. должна быть устойчива к деградации, например, ограничивая эндонуклеазией деятельности)35,42. Для того чтобы грузовой вектор сохранялся, происхождение репликации должно быть совместимо с цианобактерией получателя, чтобы обеспечить самовоспроизводство и распространение в дочерних ячеек после деления. Для помощи с условиями 3 и 4, несколько векторов помощника доступны через Addgene и другие коммерческие источники, которые кодируют для толпы, а также несколько метилаз, чтобы защитить от родной эндонуклизии в принимающей цианобактерий43. В этом протоколе спряжению способствовали штамм MC1061 E. coli, несущий мобилизатор и помощник векторов pRK24 (www.addgeneorg/51950) и pRL528 (www.addgene.org/58495), соответственно. Необходимо проявлять осторожность при выборе векторов, которые будут использоваться для супружеской передачи. Например, в комплекте CyanoGate самовоспроизводящий грузовой вектор pPM-AK1-T кодирует белок Mob12. Тем не менее, pSEVA421-T не44, и как таковой, толпа должна быть выражена из подходящего вектора помощника. Используемые векторы также должны соответствовать организму-мишеням. Например, эффективный супружеский перевод в Anabaena sp. PCC 7120 требует вектора помощника, который защищает вектор мобилизации от пищеварения (например, pRL623, который кодирует для трех метилазов AvaiM, Eco47iiM и Ecot22iM)45, 46.
В этом протоколе мы далее наметить, как охарактеризовать производительность частей (т.е. промоутеров) с флуоресцентным маркером с помощью считывателя пластин или цитометра потока. Цитометры потока способны измерять флуоресценцию на основе одной клетки для большой популяции. Кроме того, цитометры потока позволяют пользователям “загонять” полученные данные и удалять фоновый шум (например, от твердых частиц в культуре или загрязнении). В отличие от этого, считывательы пластин приобретают совокупное измерение флуоресценции данного объема культуры, как правило, в нескольких репликационных скважинах. Основные преимущества считывателей пластин над цитометрами включают более низкую стоимость, более высокую доступность и, как правило, отсутствие требований к специализированного программного обеспечения для анализа данных ниже по течению. Основными недостатками считывателей пластин являются относительно более низкая чувствительность по сравнению с цитометрами и потенциальные проблемы с оптической плотностью измеренных культур. Для сравнительного анализа образцы считывания пластин должны быть нормализированы для каждой скважины (например, для измерения плотности культуры, обычно в качестве абсорбции при оптической плотности в 750 нм, что может привести к неточностям для образцов, которые являются слишком плотной и/или не очень смешанной (например, при подверженности агрегации или флоккуляции).
В качестве обзора, здесь мы демонстрируем в деталях принципы генерации частей уровня 0, а затем иерархической сборки с использованием комплекта CyanoGate и клонирования в вектор, пригодный для супружеской передачи. Затем мы демонстрируем процесс конъюгальной передачи, выбор топорных трансконъюгантных штаммов, выражающих флуоресцентный маркер, и последующее получение данных флуоресценции с помощью цитометра потока или считывателя пластин.
Сборка Золотых ворот имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами векторной сборки, особенно с точки зрения масштабируемости20,21. Тем не менее, настройка системы «Золотые ворота» в лаборатории требует времени для того, чтобы ознакомиться с разли…
The authors have nothing to disclose.
Авторы признательны Сети БИОтехнологии и биологических наук PHYCONET (BBSRC) в области промышленной биотехнологии и биоэнергетики (NIBB) и Центру инноваций в области промышленной биотехнологии (IBioIC) за финансовую поддержку. GARG, AASO и AP признают финансовую поддержку программы BBSRC EASTBIO CASE PhD (грант bb/M010996/1), Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACYT) PhD программы, а также программы совместного обучения IBioIC-BBSRC (CTP) Соответственно. Мы благодарим Конрада Маллино (Лондонский университет Королевы Марии) и Поула Эрика Дженсена и Джули Аннемари Зита Зедлер (Копенгагенский университет) за плазмидный вектор и протокольные вклады и советы.
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Thermo Fisher Scientific | R0404 | Used in 2.1.3. |
Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt | Sigma-Aldrich | A2383 | Used in Table 2. |
Agar (microbiology tested) | Sigma-Aldrich | A1296-500g | Used in 8.3. |
Agarose | Bioline | BIO-41026 | Used in 6. |
Attune NxT Flow Cytometer | Thermo Fisher Scientific | – | Used in 4.3.1. |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Used in Table 2. |
BpiI (BbsI) | Thermo Fisher Scientific | ER1011 | Used in Table 2. |
BsaI (Eco31I) | Thermo Fisher Scientific | ER0291 | Used in Table 2. |
Carbenicillin disodium | VWR International | A1491.0005 | Used in 2.1.3. |
Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Used in 4.1.3. |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | Used in 3.6.2. |
DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | DNA extraction kit. Used in 5. |
FLUOstar Omega Microplate reader | BMG Labtech | – | Used in 4.2.2. |
GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K0503 | Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2. |
Glass beads (0.5 mm diameter) | BioSpec Products | 11079105 | Used in 5.2. |
Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 10021083 | Used in 2.3.1, 3.6.2. |
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | 10356553 | Used in 2.1.3. |
Kanamycin sulphate (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11815-024 | Used in 2.1.3. |
Membrane filters (0.45 μm) | MF-Millipore | HAWP02500 | Used in 3.3.7 |
Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEAR | Greiner Bio-One | 655096 | Used in 4.2.1. |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020S | Used in 1.1.2.2. |
Monarch PCR DNA Cleanup Kit | New England Biolabs | T1030 | DNA purification kit. Used in 1.1.2.3. |
Multitron Pro incubator with LEDs | Infors HT | – | Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4. |
MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21108 | Used in 7.1. |
NanoDrop One | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Used in 2.3.3. |
One Shot TOP10 chemically competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C404010 | Used in 2.1.1. |
Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate) | VWR International | K813 | Used in 4.3.2. |
Q5High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0491S | Used in 1.1.2.1. |
Quick-Load 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N0468S | Used in Figure 4. |
Screw-cap tubes (1.5 ml) | Starstedt | 72.692.210 | Used in 3.6.3 |
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | VWR International | J61820.06 | Used in 2.1.3. |
Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 612U96 | Used in 4.3.1. |
T4 DNA ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | Used in Table 2. |
TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Bead mill. Used in 5.2. |