Summary
캄필로박터의 대변 문화는 부정확하지만, 여전히 식별의 금본위제로 간주됩니다. 인간 대변에서 C. jejuni의 수송 매체에서 검출 및 생존의 한계를 결정하는 방법은 더 나은 정확도로 새로운 면역 분석과 비교하여 기술된다.
Abstract
Campylobacter의진단을위한 인간의 대변에서 문화 - 기반 장 질환은 의사와 환자의 불굴의 세금을 부과하는 며칠이 걸립니다. 문화는 또한 표본 취급 도중 생존의 무작위 손실, 그밖 배설물 식물의 과잉 성장 및 전통적인 매체에 몇몇 병원성 Campylobacter 종의 나쁜 성장에서 거짓 부정적인 결과가 경향이 있습니다. 이러한 문제는 환자 치료에 대한 임상 적 결정을 혼동하고 Campylobacter 성장과 감염에 대한 근본적인 질문에 대답에서 필드를 제한 할 수 있습니다. 우리는 배양에 의해 검출될 수 있는 세균 수의 하한을 추정하는 절차와 이 연약한 유기체의 수송에 사용되는 배지에서 C. jejuni의 생존을 정량화하는 방법을 설명한다. 이 정보를 알고, 진단 테스트에 대 한 임상적으로 관련 된 검출 임계값을 설정 하 고 비 증상 식민지 가 만연 여부의 연구 되지 않은 문제를 해결 하는 것이 가능 해진다, 다른 장 병원 체와 공동 감염은 일반적인 경우, 또는 세균 성 부하 증상 또는 심각한 후유증과 상관 관계 하는 경우. 연구 결과는 또한 전통적인 문화에 의해 처음에 분류되고 새로운 효소 면역검환자에 의해 추가 시험된 1,552명의 미래집합된 참을성 있는 설사 대변 견본의 시험을 포함했습니다. 양성 및 불일치 시편은 4개의 분자 방법으로 스크리브하여 참양성 또는 참음성 상태를 할당했습니다. 5개의 비배양방법은 48개의 양성 및 불일치 표본 모두에 대한 완전한 합의를 보였으며, 배양은 14개(28%)를 잘못 식별하였다. 배양으로 잘못 확인된 표본에는 13개의 거짓 음성 및 1개의 거짓 양성 샘플이 포함되었습니다. 이 기본 프로토콜은 여러 Campylobacter spp. 및 결정 될 인간에서 위장염의 증상을 생산 하는 Campylobacter 박테리아의 수를 허용 하 고 보급 속도 대 한 업데이트.
Introduction
미국 질병통제센터(CDC)는 최근 식인성 질병 활성 감시 네트워크(FoodNet) 감시 프로그램이 2018년에 실험실 진단된 캄필로박터 감염의 9,723건을 보고했다고 발표했습니다 1. 이는 2015-2017년1건에비해 캄필로박터 사례 보고서가 12% 증가한 것을 나타냅니다. 전 세계적으로, 캄필로박터 종은 가장 흔한 세균성 장 감염 중 하나입니다2. 그럼에도 불구하고 매년 발생하는 캄필로박터-기반장 질환의 수는 과소보고된 것으로 의심됩니다3. 대부분의 환자는 온건한 불편및 아무 의학적 처리도 없이 복구할 수 있기 때문에 이 과소 평가는 예측가능합니다. 그러나, 더 가혹한 현상을 가진 환자 또는 심각한 질병을 위한 고위험에, 그리고 그 때 치료를 찾는 사람에 대하여, 발판 문화는 Campylobacter가 그들의 고민을 일으키는 원인이 되는 병원체인지 평가하기 위한 일반적인 방법입니다4.
Campylobacter spp., 대변 문화는 특히 번거롭습니다. 가장 흔한 병원성 유기체는 C. jejuni, C. 대장균, C. upsaliensis 및 C. lari는 미세 항공 성5입니다. 이것은 박테리아가 공기에 일단 노출되면 무작위로, 알려지지 않은 비율로 정지한다는 것을 의미합니다. 표본 수집과 배양 설정 사이의 시간은 따라서 생존 가능한 Campylobacter 종을 검출하는 능력에 통제되지 않는 변수가된다.
배설물 표본의 직접적인 문화에 대 한, Campylobacter의 느린 성장도 문제. Campylobacter 식민지는 배양의 48 시간 후에도 아주 작고 쉽게 대변 매트릭스에 있는 경쟁 유기체에 의해 엄호될 수 있습니다. C. jejuni 및 C. coli의 대부분의 균주가 내성이 있는 항생제를 포함하는 플레이트는 항생제가 많은 (전부는 아님) 경쟁 배설물 박테리아의 성장을 억제하기 때문에 널리 사용되며, 캄필로박터 콜로니의 더 나은 시각화를 가능하게한다 6. 그러나, C. lari 와 C. upsaliensis와 같은 그밖 Campylobacter 종은 이 항생제의 몇몇에 민감하고, 가난하게 또는 전혀 증가하지 않습니다. 이것은 이 항생에 민감한 종7에서 Campylobacter 감염의 과소 보고에 기여합니다.
캄필로박터의 문화가 부정확할 수 있는 세 번째 이유가 있습니다. 박테리아, 스트레스 때, 실행 가능한 남아 있을 수 있습니다 하지만 될 수 있습니다 "비 컬터"8. 이것은 정의에 의하여 배양이 견본에 존재하는 박테리아를 검출하지 않을 것이라는 것을 의미한다. 이 발생 빈도는8.
문화권과 관련된 이러한 잠재적인 문제를 감안할 때 잘못된 문화권 결과가 단일 비교기 분석기 분석이 부정확하게 나타나지 않도록 여러 비교 참조 방법을 사용했습니다9. 사용되는 배양 방법(예를 들어, 캄필로박터-선택적플레이트, 수송 매체, 가스 발생 봉지)은 대변 시편 배양용 임상 실험실에서 널리 사용되기 때문에 선택되었다10.
여기서 설명된 배양 프로토콜은 인간 대변에서 배양에 의해 검출될 수 있는 캄필로박터 제주니의 수가 가장 적기 때문에 개발되었다. 비록 추정은 가금류 대변에 존재하는 식민지 형성 단위 (CFU)의 수에 대한 발표되었지만 (CFU) 가금류대변에존재, 이러한 결과는 인간의 대변에 동일시 될 수 없다, Campylobacter 종은 닭의 공용으로, 설사를 유발하지 않습니다. 이 기본 정보는 인간에서 위장염의 증상을 생성 하는 Campylobacter 박테리아의 수를 설정 하 고 긴장 또는 종 사이 독성을 비교 하는 데 필요한.
Protocol
1. 고안된 인간 배설물 표본에서 캄필로박터의 열거
참고: 모든 단계는 소독된 층류 안전 후드 내의 일회용 보호 시트에 멸균 기술과 재료를 사용하여 수행됩니다.
주의: 살아있는 캄필로박터는 전염성이 있으며 설사를 포함한 질병을 일으킬 수 있습니다. 박테리아를 다룰 때마다 장갑, 실험실 코트 및 안전 안경을 착용하십시오. 입 피펫을 하지 마십시오. 박테리아에 닿은 모든 물질을 적절한 생물학적 위험 용기에 버리십시오.
- 박테리아의 주식 문화의 성장
- 건조 또는 냉동 배양물로서 C. jejuni (ATCC-33560) 또는 C. coli (재료 표)의균주를 얻고 제조업체의 지침에 따라 박테리아를 수화또는 해동하십시오. 재수화 된 박테리아를 캄필로박터-특정 한천 접시에 줄무늬가 있어 배양을 시작합니다. 37°C에서 플레이트 48h를 미세호로분위기 가스 발생 봉지를 함유하는 혐기성 항아리에 배양한다.
- 다음날, 뇌-심장 주입 (BHI) 성장 국물 0.5% 트립티케이스, 0.5% 프로테아제 펩톤, 0.0125% 피루베이트 나트륨, 0.0125% 나트륨 비설핏을 준비합니다.
- 플라스크를 느슨하게 덮고 혐기성 항아리에 넣고 미세 항공 성 환경을 생성할 봉지로 BHI 국물을 미리 줄입니다. 국물을 37°C에서 하룻밤 동안 줄이도록 하십시오. 마찬가지로, 1.1.10 단계 와 1.2.2 단계에서 식민지 카운트에 사용되는 캄필로박터-특정 플레이트를 미리 줄입니다.
- 캄필로박터는 공기에 민감하기 때문에 국물을 접종하기 전에 모든 재료를 수집하고 문화를 처리하는 동안 어리둥절하지 마십시오. 예방 접종을 할 준비가 되면 태아 소 혈청 (FBS)을 총 부피의 4 %로 미리 줄인 국물에 추가하십시오. 600 nm (OD 600)에서 광학 밀도의 측정에서 공백역할을하기 위해 미리 감소 된 국물의 1mL을유지하십시오.
- FBS를 함유한 미리 줄어든 국물 3 mL을 제거하고 국물을 사용하여 캄필로박터 배양물을 함유한 스타터 플레이트를 긁어냅니다. 접종 루프로 플레이트를 부드럽게 긁어 낸 다음 세균 성 슬러리를 멸균 튜브로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김시원으로 옮김을 제거합니다.
- 100 mL의 미리 환린된 국물을 약 3 mL의 세균 성 슬러리로 접종하고 가스 발생 봉지를 함유하는 혐기성 항아리에서 37 °C에서 115 rpm에서 적당한 떨림으로 배양합니다.
- OD600에서탁도에 의해 분광광도적으로 박테리아의 성장을 모니터링합니다. 예약된 국물을 공백으로 사용합니다. 혐기성 항아리가 열리면 가스 발생 봉지를 교체하십시오.
- 48-72 시간 후 또는 OD600 값이 ~0.4에 도달하기 전에 국물 배양을 중지하십시오.
참고: 이 OD600은 일반적으로 107 ~ 108 CFU/mL과 동일합니다. 일반적인 결과는 표 1을 참조하십시오. - 순수한 육수 배양에서 박테리아의 수를 확립하기 위해 희석 완충제의 900 μL에서 100 μL의 8 개의 10 배 희석 시리즈를 수행하십시오(재료 표). 첫 번째 희석을 위해 100 μL의 국물을 제거한 후, 플라스크를 신선한 가스 생성 봉지가 있는 혐기성 항아리로 돌려 보내 서 대변 풀에서 사용을 기다립니다.
- 멸균 도금 비드를 사용하여10-5 ~ 10-7 희석물의 100 μL을 1.1.3 단계에서 중복 된 사전 축소 된 Campylobacter-특정 플레이트에 확산시다. 희석이 사용되는 라벨 플레이트를 가스 발생 봉지가있는 두 번째 혐기성 항아리에 놓고 37 °C에서 48-72 시간 동안 배양하십시오.
참고: 희석 계획 및 식민지 사진에 대한 그림 1 및 그림 2를 참조하십시오. - 성장 후, 계산 할 30-300 식민지 사이의 접시를 선택합니다. 카운트를 활용하여 방정식 1을 사용하여 주식 국물 배양의 CFU/mL을 결정합니다.
재고 CFU/mL = 선택한(중복) 분석 플레이트에 대한 식민지의 평균 # (mL 도금 x 플레이트 희석) [방정식 1]
- 고안된 임상 배설물 표본의 준비 및 열거
- 분석 카운트에 대한 플레이트가 1.1.10 단계에서 제조 된 직후, 주식 국물에서 10 개의 직렬 2 배 희석을 준비하고 Campylobacter-음수 배설물 풀 (NFP)을 준비하여 두 번째 주식 국물 희석세트를 만듭니다. 예를 들어, 동일한 양의 국물과 NFP(예: 0.1 mL)를 혼합하여 첫 번째 희석을 준비하고 지정된 양의 국물 및 NFP 혼합물을 동일한 지정된 부피 NFP로 튜브로 옮겨 후속 희석을 합니다. 배설물 풀에 캄필로박터가 들어 있지 않은 국물을 사용하여 대조판을 추가하여캄필로박터가 아닌 식민지를 식별할 수 있도록 합니다.
- NFP를 이전에 테스트하고 캄필로박터효소 면역 분석 및 16S rRNA qPCR과 같은 방법에 의해 음성으로 밝혀진 비식별, 설사 환자 감시 표본 또는 건강한 기증자 의자에서 확인하십시오.
- T-줄무늬 각 캄필로박터/대변희석의 중복 미리 감소된 캄필로박터-특정한천 플레이트. 혐기성 항아리에 가스 발생 봉지와 함께 플레이트를 놓고 48 ± 2 h동안 37 °C에서 배양합니다.
- 순수한 캄필로박터 문화의 식민지를 시각적으로 검사하십시오.
참고: 세 번째 사분면은 일반적으로 이러한 사분면을 찾을 수 있는 위치입니다. 희석 방식 및 콜로니 크기, 색상 및 형태에 대한 이미지는 그림 1 및 그림 2를 참조하십시오. - 여러 개의 캄필로박터를선택하십시오 -같은 식민지와 그램 얼룩. 오일 침지 렌즈로 현미경 검사법을 사용하여 그람 음성 곡선, 나선형 또는 시가 모양의 작은 박테리아에 대해 얇게 줄무늬 영역을 검사합니다.
참고 : 캄필로 박터는 그람 음성이며, 카운터 스테인으로 기본 자홍을 필요로 (대신 전형적인 사프라닌의) 정확하게 시각화 할 수 있습니다. 고전적인 갈매기 날개 박테리아를 볼 수 있습니다 하지만 요구 사항은 아닙니다. 대표적인 현미경은 그림 2를 참조하십시오. - 특정 희석에서 중복 플레이트 중 하나가 1 개 이상의 Campylobacter 콜로니가 존재하는 경우, 희석 배설물 배양 양성 고려.
- 가시적 인 캄필로박터-같은 그람 음성 식민지 배양 검출의 한계를 포함하는 마지막 희석을 고려하십시오. 방정식 2를 사용하여 고안된 임상 배설물 표본에서 양성 희석의 CFU/mL을 계산합니다.
배설물 샘플의 CFU/mL = 마지막 포지티브 콜로니가 있는 분석 CFU/mL ∞ 희석 [방정식 2]
참고: 일반적인 결과는 표 2를 참조하십시오.
- 분석 카운트에 대한 플레이트가 1.1.10 단계에서 제조 된 직후, 주식 국물에서 10 개의 직렬 2 배 희석을 준비하고 Campylobacter-음수 배설물 풀 (NFP)을 준비하여 두 번째 주식 국물 희석세트를 만듭니다. 예를 들어, 동일한 양의 국물과 NFP(예: 0.1 mL)를 혼합하여 첫 번째 희석을 준비하고 지정된 양의 국물 및 NFP 혼합물을 동일한 지정된 부피 NFP로 튜브로 옮겨 후속 희석을 합니다. 배설물 풀에 캄필로박터가 들어 있지 않은 국물을 사용하여 대조판을 추가하여캄필로박터가 아닌 식민지를 식별할 수 있도록 합니다.
2. 전송 매체에 저장된 캄필로박터의 생존 력 결정
- 캄필로박터 국물 배양 1mL(1.1.8단계)를 NFP 1 mL과 혼합하고 NFP에서 10개의 중복 된 2중 시리얼 희석을 준비합니다. 추가로 각 희석을 캐리-블레어 매체에서 추가로 1:4희석하고, 수송 매체에서 제조된 임상 시편이 처리되는 것과 마찬가지로.
- 20개의 희석튜브와 마이너스 대조군을 캐리-블레어 배지에 2-8°C에서 96시간 동안 캡핑된 튜브에 저장하고, 0시간마다 매 24시간마다 발생하는 각 희석으로부터 콜로니를 계산한다. 식민지 계산을 위해, 각 희석의 식민지 계산을 위한 배설물 튜브 및 설치 배설물 배양을 중복으로 샘플링합니다.
- 매일 판 10 μL 부분 캄필로박터상에서배설물 희석-선택적 한천 및 단계 1.1.9-1.2.7에서 전술한 바와 같이 48시간 동안 37°C에서 배양한다.
- 위에서 설명한 대로 원래 세균 성 육수 (단계 1.1.8 또는 갓 재배 된 국물 주식)의 동시 분석 플레이트 수를 수행하십시오 (단계 1.1.9-1.1.11). 원래 세균 스톡의 CFU/mL을계산하여 수송 매설 샘플및 그 희석물에서 박테리아의 농도를 계산합니다(수학식2).
3. 문화결과 검증을 위한 비문화적 어세이
- 최소한의 거짓 양성 결과12를 제공하는 효소 면역 분석(EIA)을 사용하고 패키지 삽입 지침에 따라 수행하여 배양 결과를 확인합니다.
- 16S rRNA 유전자 또는 광범위한 캄필로박터 종13의다른 유전자를 검출할 수 있는 분자 분석법을 사용한다. 분자 분석이 표준 항생제 함유 한천14에제대로 자라는 C. upsaliensis 또는 C. lari와 같은 종과 반응하는지 확인하십시오. 대변 샘플에서 DNA를 추출하고 테스트를 수행하기위한 제조업체의 지침을 따르십시오.
참고 : 16S 앰플리컨의 양방향 DNA 염기서열 분석은 양성 표본에서 캄필로박터의 종을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 종별 PCR(표적 유전자에 대한 표 3 참조)은 또한 불연속 또는 양성표본(15)에존재하는 종을 식별하는데 사용될 수 있다.
Representative Results
경쟁 배설물 식물 중 Campylobacter spp. 식민지를 식별 하는 날카로운 시력과 상당한 판단을 필요 합니다. 배양에 의해 검출될 수 있는 콜로니의 가장 낮은 수는 연구되지 않았습니다, 환자에게서 견본은 106-109 CFU/mL16,17를항구하기 위하여 추정되었더라도. 그러나 정확한 세균 수를 확립하는 독립적인 방법이 없기 때문에 환자 샘플은 정량적으로 사용할 수 없습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 하나의 세균 성 스톡으로 두 가지 동시 측정이 이루어집니다. 한 테스트는 대변 매트릭스에서 주식 박테리아의 직렬 희석으로부터 Campylobacter 콜로니의 시각적 검출에 사용되어 임상 표본을 시뮬레이션합니다. 다른 하나는 스파이크에 사용되는 세균 성 스톡 배양에 존재하는 CFU/mL을 정량화하기 위해 공언적으로 사용된다(도2A).
Campylobacter에 대한 검색 임계값은 정의되지 않습니다. 이것은 각 배설물 매트릭스가 복잡하고 독특하기 때문에 예상될 것이고, 박테리아의 성장은 가변적입니다. 성공을위한 핵심 매개 변수는 경쟁 배설물 식물군 사이에 정확한 크기 식민지를 식별하는 것입니다. 도 2C 및 도 2D에도시된 스파이크 대변 배양의 대표적인 플레이트. 추가 Campylobacter 없이 부정적인 제어 플레이트는 다른 배설물 식물을 식별 하는 데 중요 하다. 그램 염색 많은 후보는 또한 자홍색 염색 그람 음성 박테리아의 정확한 광택 콜로니 및 중간 분홍색 색을 구별하기 위해 눈을 훈련하고 선택된 콜로니에서 박테리아의 형태를 확인합니다(그림 2B). 7개의 독립적인 실험을 수행하였고, 5C. jejuni 및 2 C. coli 국물을 사용하여, 0.3-5 x 106 CFU/mL에서 중첩되고 스팬된 임계값을 주었다. 일반적인 데이터는 표 2를 참조하십시오. 검출 한계는 C. jejuni의 경우 평균 2 x 106, C. 대장균의경우 1.2 x 106 CFU/mL입니다. 이것은 배양이 많은 임상 실험실에서 사용하는 표준 항생제 함유 캄필로박터-특이적한천에 대변 시편의 그램당 ~1-2 x 106C. jejuni 또는 C. coli를 검출할 가능성이 있음을 나타낸다. 식민지 탐지를 위한 다른 임계값을 줄 수 있는 다른 항생제를 가진 다중 전문화한 한천이 있습니다. 여기에 설명된 방법은 문화의 정확성을 향상시키고 새로운 미디어의 다양성을 넓히기 위해 보다 양적 및 비교 연구를 장려해야 합니다. 예를 들어, 152개의 콜로니가제10-5플레이트및 144개의 콜로니에 2차10-5플레이트에 계수되었다. 두 판 사이의 평균은 148 식민지입니다. 플레이트는 0.1 mL (100 μL)의10-5 희석으로 접종하였고, 이는 수학식 1에 의해 148 x 106 (14.8 x 107)CFU/mL에 해당합니다. 배설물 희석이 만들어졌을 때, 배양은 1:1 비율로 음의 배설물 풀로 급증했습니다. 따라서 방정식 2에의해 배설곡선의 제1 점(플레이트 "a")은 14.8 x 107을 2로 나누고 7.4 x 107 CFU/mL에 해당합니다. 이 "a"튜브는 9 개의 추가 희석을 만드는 데 사용됩니다. 그림 1에서, 캄필로박터-유사형태와 함께 하나의 가시적인 그람 음성 콜로니를 가진 마지막 희석은 플레이트 "g"에 있다. 이는 이 예에서 검출의 배설물 배양 임계값에 대해 1.1 x 106 CFU/mL과 동일합니다.
지속적인 생존력은 문화의 정확성의 핵심이지만, 환자에서 클리닉에서 참조 실험실로 표본을 처리하고 선적하는 동안 Campylobacter spp. 생존력의 유지는 문제가 됩니다. 일반적인 저장은 공기 노출과 특별한 분위기없이 일반 캡 튜브의 표본을 냉장하는 것입니다. 수송 매체 (또한 보존된 견본이라고도 함)에 있는 견본은 더 나은 생존이 있기 위하여 생각됩니다, 그러나 정량적인 데이터를 제공하는 몇몇 보고가있습니다 18.
상기에 나타난 분석 및 고안된 샘플 방법의 조합은 수송 매체에서 C. jejuni의 생존 가능성 및 생존 시간 추정치를 얻기 위해 다시 사용되었다. 세균성 육수 국물을 배설물 매트릭스에서 10개의 중복 2배에서 1024배의 샘플 희석물을 준비하는 데 사용되었다. 초기 국물은 분석 카운트에 의해 4.8 x 107 CFU/mL의 농도를 가지는 것으로 나타났습니다. 0일째에 만들어진 플레이트에서, C. jejuni는 1.5 x 106 CFU/mL에 해당하는 32배 희석으로 줄무늬가 있는 플레이트에서(2일 후) 검출되었다. 그러나 24 시간 동안 Cary Blair 배설물 샘플을 냉장 한 후 만든 접시에 2 배 희석 (2.4 x 107 CFU / mL에 해당)만 눈에 띄는 식민지가 증가했습니다. 생존력의 더 이상 손실은 96 시간, 연구가 중단되었을 때 밖으로 보이지 않았습니다. 이러한 생존력 상실은 16배(94%)에 해당합니다. 24시간 이내에 배양가능한 유기체의 손실은 냉장이 있더라도,107 CFU/mL C. jejuni 미만의 캐리 블레어 배지의 대변이 배양에 의해 놓칠 수 있음을나타낸다.
배양 결과와는 대조적으로, EIA는 초기 시점 및 4일 간의 시험 기간 동안 256배 희석에서 C. jejuni의 존재를 검출했다. 스파이크 배설물 샘플을 사용하는 이 EIA에 대한 C. jejuni 검출 임계값은 8.4 x 104 CFU/mL입니다. 이 임계값은 배설물 배양보다 낮으며 C. jejuni의보다 민감하고 안정적인 검출을 허용한다.
실제 임상 환경에서 Campylobacter spp. 를 검출하는 배양의 능력을 시험하기 위하여는, 1,552의 임상 발판 견본은 6개의 절차에 의해 특징지어졌습니다: 대변 배양, Campylobacter spp를 위한 새로운 면역 분석, 및 4개의 분자 방법. 모든 견본은 미국에 있는 3개의 실험실에서 전통적인 문화에 의해 예비적으로 집합되고 처음에 분류되고, 그 때 EIA에 의해 교차 검사되었습니다. 임의의 배양 양성 또는 EIA/배양-배양-이산표본을 분자 방법12에의해 스크리브시켰다. 시편은 5가지 비배양 방법의 결과에 기초하여 참양성 또는 참-음성 상태를 할당했다. 5개의 비배양방법은 48개의 양성 및 불일치 표본 모두에 대한 완전한 합의를 보였으며, 배양은 14개(28%)를 잘못 식별하였다. 배양으로 잘못 확인된 표본에는 13개의 거짓 음성 및 1개의 거짓 양성 샘플이 포함되었습니다.
그림 1: 분석 및 스파이크 배설물 시료의 동시 준비를 위한 계획. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 순수하고 배설물 배양물에서 C. jejuni 식민지의 식별. (A)72시간 배양 후 순수한 세균 배양으로부터 C. 제주니 식민지의 사진. (B)순수한 세균 배양, 오일 침지 400 배율에서 C. jejuni의 그람 얼룩. (C) C. 제주니-포지티브스파이크 배설물 배양 48시간 배양 후 사진. (D)상자에 있는 확대 된 영역(C),10 배 율. 흰색 화살표는 핀 포인트 크기 그람 음수 C. jejuni 식민지를 나타냅니다. 검은 색 화살촉은 약간 더 크고, 그람 양성이며, C. jejuni가아닌 식민지를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 문화 | OD600 @ T0 | OD600 @ T 파이널1 | 최종 CFU/mL |
| C. 제주니 | 0.146 | 0.321 | 1.28 x 107 |
| C. 대장균 | 0.245 | 0.508 | 4.50 x 108 |
표 1: C. jejuni 및 C. 대장균 주식의 전형적인 성장 및 CFU/mL. 1C. jejuni 배양은 48시간 의 배양 후에 중단되었다. C. 대장균 배양은 54시간 배양 후에 중단되었다.
| 스파이크 배설물 시료용 희석튜브 | 캄필로박터-같은식민지의 수 | 그람 음성 식민지 수1 | 문화 긍정적? | 스파이크 샘플의 계산된 CFU/mL | |
| C. jejuni (1.28 x 108 CFU /mL 재고) | (2 배) | 밀도 | nd2 | 예 | 6.40 x 107 |
| (4 배) b | 20세 이상 | Nd | 예 | 3.20 x 107 | |
| (8 배) c | 4-10 | Nd | 예 | 1.60 x 107 | |
| (16 배) d | Nd | 예 | 8.00 x 106 | ||
| (32 배) 전자 | Nd | 예 | 4.00 x 106 | ||
| (64 배) f | 1-3 | 2개 중 1개 | 예 | 2.00 x 106 | |
| (128 배) g | 2 /3 | 예 | 1.00 x 106 | ||
| 3(256 배) h | 2개 중 1개 | 예 | 5.00 x 105 | ||
| (512 배) i | 0/1 | 아니요 | 2.50 x 105 | ||
| (1024 배) j | 0 | Nd | 아니요 | Nfp | |
| C. 대장균 (4.50 x 108 CFU /mL 재고) | (2 배) | 밀도 | Nd | 예 | 2.25 x 108 |
| (4 배) b | Nd | 예 | 1.13 x 108 | ||
| (8 배) c | 50세 이상 | Nd | 예 | 5.63 x 107 | |
| (16 배) d | 30세 이상 | Nd | 예 | 2.81 x 107 | |
| (32 배) 전자 | 10세 이상 | Nd | 예 | 1.41 x 107 | |
| (64 배) f | 3-8 | Nd | 예 | 7.03 x 106 | |
| (128 배) g | Nd | 예 | 3.52 x 106 | ||
| 3(256 배) h | 1-3 | 3개 중 1개 | 예 | 1.76 x 106 | |
| (512 배) i | 0/1 | 아니요 | 8.79 x 105 | ||
| (1024 배) j | 0 | Nd | 아니요 | Nfp |
표 2: 스파이크 배설물 샘플 접시에 식민지의 전형적인 숫자. 1 캄필로박터중 음수 콜로니 -like 콜로니, 2nd = 결정되지 않음, 굵은형의 3 데이터는 마지막 양수 희석을 나타냅니다.
| 종 | 유전자 표적 |
| C. 제주니 | hipO |
| C. 대장균 | cadF |
| C. 업세일시스 | cpn60 |
| C. 라리 | cpn60 |
| C. 헬베티쿠스 | cpn60 |
| C. 태아 | cpn60 |
| C. 효인테날리스 | cpn60 |
| C. 간결한 | cpn60 |
표 3: 개별 캄필로박터 종 qPCR의 검출에 유용한 유전자.
Discussion
여기서 설명된 배양 방법은 대부분의 실험실에서 사용할 수 있는 간단하고 널리 사용되는 기술 및재료에 기초한다 10. 그것은 대변 문화를 위한 임상으로 관련있는 탐지 임계값의 새로운 정보를 제공하는 분석과 고안된 견본의 조합입니다. 추가적으로, 5개의 개별적인 검정을 가진 문화 결과의 판결은 Campylobacter 배설물 문화가 환자 견본의 상당 부분을 잘못 식별한다는 결론을 강화합니다. EIA 및 분자 분석은 각각 다른 원리 (항체와 DNA 증폭과의 항원 상호 작용)에 기초하기 때문에 대조군으로서 유용하며, 중요한 것은 박테리아의 생존 가능성에 의존하지 않는다는 것입니다. 이러한 연구에 사용되는 EIA 분석실험은 잘 검증되었으며 4개의 분자 검사12에완전히 동의하는 것으로 나타났습니다.
Campylobacter spp. 특히 귀찮은, 감도에서 범위에 보고 60-76%19,20,그리고 에서 분명 ~30% 실패의 속도 에서 참된 양성 표본을 검출 하는 여기. 인력은 제어 EIA 및 분자 테스트가 배양 데이터가 부정적일 때 종종 긍정적인 결과를 낳을 것으로 기대할 수 있습니다.
프로토콜에서 가장 중요한 단계는 경쟁 배설물 식물군 사이에서 핀 포인트 식민지의 식별이다. 검출 임계값 근처의 희석으로, 0 및 0이 아닌 콜로니 카운트 추정치(예: 2, 0, 1, 0, 0)를 번갈아 가며 사용하는 것은 드문 일이 아닙니다. 배양 임계값은 특정 CFU/mL이 아닌 농도의 범위가 될 것임을 인식하는 것이 중요합니다. 그럼에도 불구하고, 배양 검출을 위한 하한으로 ~1 x 10x 10 6 CFU/mL 대변의 추정치는 감염된 인간이 그램 대변 당 10 6~10°C9 캄필로박터를 흘렸다는 보고와 잘 비교한다21. 개별 배설물 표본에 있는 항생제 또는 한천 격판증 그리고 변이에 있는 변경은 의심할 여지없이 임계값을 바꿀 것입니다. 이 프로토콜은 성장 미디어를 개선할 수 있어야 합니다.
배양 검출에 대한 한계에 대한 이 첫 번째 정보는 진단 검사를 위한 임상적으로 관련 임계값을 설정하는 것을 가능하게 하고, Campylobacter에의하여 비증상 캐리지22,23, 또는 세균성 하중이 현상 또는 심각한 후유증과 상관되는 경우에 연구되지 않은 문제점을 해결하기 위하여 필요한 미생물학 기초를 놓습니다.
Disclosures
저자는 이 기사에서 비교자로 사용되는 QUIK CHEK™ 키트를 생산하는 TECHLAB, Inc.의 직원입니다.
Acknowledgments
이러한 연구는 TECHLAB, Inc.에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anaerobic 3.5L Jar | Thermo Fisher | HP0031A | |
| AnaeroGRO Campylobacter Selective Agar | Hardy Diagnostics | AG701 | |
| Bacto Brain Heart Infusion | BD Biosciences | 237500 | |
| Bacto Protease Peptone | Life Technologies Corp | 211684 | |
| Basic Fuchsin | Fisher Scientific | B12544 | |
| BBL Trypticase Peptone | Life Technologies Corp | 211921 | |
| C. coli Type strain | ATCC | 33559 | |
| C. jejuni Type strain | ATCC | 33560 | |
| CampyGen gas generating system sachet | Thermo Fisher | CN0025A | |
| Campylobacter QUIK CHEK | TechLab, Inc. | T5047 / T31025 | |
| Cary-Blair transport medium | Fisher Scientific | 23-005-47 | |
| Coli Roller Sterile plating beads | Millipore Sigma | 71013 | |
| Dilution Buffer | Anaerobe Systems | AS-908 | |
| Fetal bovine serum | Equitech-Bio, Inc | SFBM30 | |
| Sodium bisulfite | Sigma-Aldrich | 243973 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 |
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