यह प्रोटोकॉल कार्सिनोजन-प्रेरित मूत्राशय के कैंसर से प्राप्त मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड की त्रि-आयामी इन विट्रो संस्कृति स्थापित करने के लिए विस्तृत प्रयोगात्मक कदम प्रदान करता है। ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के पासिंग, जेनेटिक इंजीनियरिंग और ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण सहित संस्कृति विधियों का वर्णन किया गया है।
उन्नत ट्यूमर मॉडल के विकास को लंबे समय से प्रोत्साहित किया गया है क्योंकि वर्तमान कैंसर मॉडलों ने तीन आयामी (3 डी) ट्यूमर वास्तुकला की कमी और मानव कैंसर के लिए कम प्रासंगिकता जैसी सीमाएं दिखाई हैं। शोधकर्ताओं ने हाल ही में एक 3डी इन विट्रो कैंसर मॉडल विकसित किया है जिसे ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के रूप में संदर्भित किया गया है जो संस्कृति पकवान में देशी ट्यूमर की विशेषताओं की नकल कर सकता है । यहां, प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को एक कैंसरजन-प्रेरित मूत्रमूत्र ट्यूमर से मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड की स्थापना के लिए विस्तार से वर्णित किया गया है, जिसमें संस्कृति, मार्ग और विट्रो में परिणामस्वरूप 3डी ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के रखरखाव शामिल हैं। इसके अलावा, लेंटिवायरस-मध्यस्थता ट्रांसड्यूक्शन का उपयोग करके जेनेटिक इंजीनियरिंग के लिए स्थापित मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड लाइनों में हेरफेर करने के लिए प्रोटोकॉल वर्णित हैं, जिसमें ट्यूमर में नए आनुवंशिक तत्वों की कुशल शुरूआत के लिए अनुकूलित स्थितियां शामिल हैं ऑर्गेनोइड। अंत में, आगे के विश्लेषण के लिए मूत्राशय मूत्राशय की दीवार में मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण की प्रक्रिया रखी जाती है। इस लेख में वर्णित विधियां बेहतर चिकित्सीय विकल्पों के विकास के लिए मूत्राशय के कैंसर के लिए इन विट्रो मॉडल की स्थापना की सुविधा प्रदान कर सकती हैं।
मूत्राशय कैंसर सबसे प्रचलित मूत्र पथ कैंसर है, लगभग १६५,००० रोगियों को सालाना मरने के साथ1। मूत्राशय के कैंसर के विभिन्न प्रकारों में, मांसपेशियों-आक्रामक यूरोथेलियल कार्सिनोमा एक आक्रामक फेनोटाइप प्रदर्शित करता है, और इसकी 5 वर्ष जीवित रहने की दर 50%2से कम है। पिछले कुछ दशकों में आक्रामक यूरोथेलियल ट्यूमर के लिए उपन्यास चिकित्सीय विकल्पों का विस्तार नहीं किया गयाहै।
कैंसर सेल लाइनों बड़े पैमाने पर दवा स्क्रीनिंग3के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि अनुकूल परिणाम कैंसर सेल लाइनों में कई दवा उंमीदवारों में देखा गया है, खराब परिणाम नैदानिक परीक्षणों में सूचित कर रहे है4। इन विट्रो दो आयामी (2 डी) संस्कृति वातावरण के लिए अनुकूलन में वृद्धि के बाद, सेल लाइनों में देशी ट्यूमर को फिर से दोहराना तेजी से मुश्किल हो गया है। पशु कैंसर मॉडल या रोगी से व्युत्पन्न ट्यूमर विद्वेष मूत्राशय कैंसर सेल लाइनों में मनाया सीमाओं को संबोधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, पशु कैंसर मॉडल समय और संसाधन गहन हैं । इसलिए, बेहतर रोग मॉडल वर्षों से मांग पर हैं और मौजूदामॉडल5की कमियों को दूर करने के लिए एक उपन्यास मॉडल प्रणाली, ऑर्गेनॉइड विकसित किया गया है ।
एक ऑर्गेनोइड एक बहुकोशिकीय 3 डी निर्माण है जो वीवो अंग में इसके अनुरूप की शारीरिक विशेषताओं को विट्रो में फिर से पेश कर सकता है। सामान्य और ट्यूमर ऑर्गेनॉइड क्रमशः5,6,प्लीरिटेंट या वयस्क स्टेम कोशिकाओं और प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं से प्राप्त किए जा सकते हैं। पिछले कई वर्षों में, ट्यूमर ऑर्गेनॉइड को बड़ी संख्या में विविध ट्यूमरऊतकोंसे स्थापित किया गया है, जिसमें पेट8,9,मूत्राशय10,अग्न्याशय11,12,प्रोस्टेट13,जिगर14और स्तन15 ट्यूमर ऊतक शामिल हैं। इस तरह के ट्यूमर ऑर्गेनॉइड अपने मूल ट्यूमर की नकल करते हैं। वीवो ट्यूमर ऊतकों और उनके कई व्यावहारिक अनुप्रयोगों में उनकी समानता के कारण, शोधकर्ताओं ने उन्हें कैंसर रोग के अध्ययन में उपन्यास रोग मॉडल के रूप में अपनाया है।
यहां, एक कैंसरजन प्रेरित मूत्र आक्रामक मूत्रसे ट्यूमर ऑर्गेनॉइड की स्थापना के लिए प्रक्रियाओं को बाहर रखा जाता है । एन-ब्यूटिल-एन-(4-हाइड्रोक्सीब्यूटिल) नाइट्रोसामाइन (बीबीएन) का उपयोग चूहों17 में आक्रामक यूरोथेलियाल कार्सिनोमा को प्रेरित करने के लिए कार्सिनोजन के रूप में किया जाता है और ट्यूमर ऑर्गेनॉइड, जो माउस मांसपेशियों-आक्रामक मूत्राशय ट्यूमर की रोगविशेषताओं का प्रदर्शन करते हैं, बीबीएन-प्रेरित मूत्रमूत्र कैंसर16से स्थापित किए जाते हैं। ट्यूमर ऑर्गेनॉइड में आनुवंशिक रूप से हेरफेर करने की विधि मूत्राशय के कैंसर के विकास के आणविक आधार का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली विकसित करने के लिए लेंटिवायरस-मध्यस्थता ट्रांसड्यूक्शन का उपयोग करके सचित्र है। इसके अलावा, मूत्राशय के कैंसर में देशी मूत्राशय के वातावरण की भूमिका की जांच करने के लिए ऑर्गेनोइड ऑर्थोटोटोपरिक रूप से मूत्राशय में प्रत्यारोपण के लिए एक विधि वर्णित है।
यह प्रोटोकॉल कार्सिनोजन-प्रेरित मूत्राशय ट्यूमर से प्राप्त मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड को संस्कृति और बनाए रखने के लिए प्रायोगिक प्रक्रियाओं का वर्णन करता है।
इस प्रोटोकॉल में, कई प्रयोगात्मक कदम हैं जिनमें प्रक्रियाओं को कुछ समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती है। सबसे पहले, ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या है कि शुरू में वरीयता प्राप्त कर रहे है एक महत्वपूर्ण कारक है क्योंकि संस्कृति में ट्यूमर कोशिकाओं की कम संख्या (<2 x 104 कोशिकाओं) ज्यादातर ट्यूमर कोशिकाओं के बीच बातचीत की कमी के कारण सेल मौत के लिए सीसा । इसके विपरीत, सीडिंग में बहुत अधिक कोशिकाओं (>5 x 104 कोशिकाओं) के साथ शुरुआत करने से अधिक भीड़ वाले ऑर्गेनॉइड हो जाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप प्रत्येक ऑर्गेनॉइड के खराब विकास के साथ संस्कृतियों को संभालने में कठिनाई होती है। यह दृढ़ता से सुझाव दिया जाता है कि प्रयोगात्मक स्थितियों को अनुकूलित करने के लिए शुरुआत में विभिन्न संख्याओं वाली कई प्लेटें स्थापित की जाएं। प्रारंभिक ट्यूमर कोशिकाओं की सही संख्या की पहचान उच्चतम कोशिका व्यवहार्यता प्राप्त करने और सफल मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, 2 सप्ताह से अधिक की दीर्घकालिक संस्कृति में बिना किसी कमी के, अधिकांश ट्यूमर ऑर्गेनॉइड बढ़ना बंद कर देते हैं, संभावित रूप से ऑर्गेनोइड के केंद्र में पोषक तत्वों की अपर्याप्त आपूर्ति और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में विकास कारक की कमी के कारण। इसलिए, ट्यूमर ऑर्गेनॉइड संस्कृति को बनाए रखने के लिए समय पर ऑर्गेनॉइड को समय पर प्रमाणित करना एक महत्वपूर्ण कदम है।
दूसरा, ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के कुशल आनुवंशिक हेरफेर के लिए उच्च-टिटर लेंटिवायरल कणों का उत्पादन महत्वपूर्ण है। वायरस टिटर से संबंधित मुद्दों को परेशान करने के लिए, यह दृढ़ता से सुझाव दिया जाता है कि वायरस टिटर हर बार वायरल ट्रांसड्यूक्शन से पहले निर्धारित किए जाते हैं क्योंकि लेंटिवायरल निर्माण अलग दक्षता के साथ वायरल कणों का उत्पादन करते हैं। यदि ट्यूमर ऑर्गेनॉइड वायरल संक्रमण के बाद कम व्यवहार्यता प्रदर्शित करते हैं, तो यह संभावना है कि वायरल टिटर संभावित रूप से बहुत अधिक हैं। इस मामले में वायरस की कम मात्रा का उपयोग करने का पुरजोर सुझाव दिया गया है। तीसरा, बीबीएन-प्रेरित मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण के दौरान, मूत्राशय की दीवार की अखंडता को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। यदि इंजेक्शन मूत्राशय की दीवार परत को भेदने से मूत्राशय के लुमेन तक पहुंचता है, तो प्रयोग को समाप्त कर दिया जाना चाहिए और छोड़ दिया जाना चाहिए। यदि संभव हो, तो अल्ट्रासाउंड इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके मूत्राशय ट्यूमर विकास की निगरानी की सिफारिश की जाती है।
वर्तमान तकनीकों की एक सीमा इन ऑर्गेनॉइड में ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट या स्ट्रोमा की अनुपस्थिति है। इस मुद्दे को दूर करने के लिए, यह दृढ़ता से सुझाव दिया जाता है कि ट्यूमर ऑर्गेनॉइड का ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण देशी ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट की नकल करने के लिए वीवो सिस्टम में उपयोग करता है। भविष्य में, ट्यूमर स्ट्रोमा के अन्य घटकों के साथ ट्यूमर ऑर्गेनॉइड से बने 3डी इन विट्रो ऑर्गेनॉइड सिस्टम विकसित करना आवश्यक होगा।
हमारी तकनीक के प्रमुख निहितार्थों में से एक यह है कि, ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण में, केवल 10 मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड मूत्राशय में ट्यूमर के विकास को प्रेरित कर सकते हैं। पारंपरिक ट्यूमर प्रत्यारोपण प्रयोगों की तुलना में जिन्हें 5 x 105-1x 106 एकल मूत्राशय ट्यूमर कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, हमारे तरीके बहुत अधिक कुशल और मजबूत हैं। एक और महत्वपूर्ण अंतर यह है कि ऑर्गेनॉइड को विभिन्न लेंटिवायरल वैक्टर का उपयोग करके विविध रूप से हेरफेर किया जा सकता है, जैसे कि लेंटिवायरल निर्माण जिसमें शॉर्ट-हेयरपिन आरएनए, CRISPR-Cas9 सिस्टम, या रुचि के जीन होते हैं। ये वर्तमान ऑर्गेनॉइड प्रौद्योगिकी को जोड़ने के लिए शक्तिशाली उपकरण होंगे। कुल मिलाकर, यहां प्रस्तुत प्रायोगिक दृष्टिकोण इन विट्रो ट्यूमर मॉडल की स्थापना की सुविधा प्रदान कर सकते हैं जो 2डी मूत्राशय कैंसर कोशिका रेखाओं का उपयोग करने के बजाय मूत्राशय के कैंसर के रोगजनकों की हमारी समझ में सुधार कर सकते हैं।
यह विधि कार्सिनोजन-प्रेरित मूत्राशय ट्यूमर से प्राप्त मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड स्थापित करने में सक्षम थी। लेख लेंटिवायरस-मध्यस्थता प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का वर्णन प्रदान करता है जिसके माध्यम से आनुवंशिक संशोधनों को पेश किया जाता है और मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड में स्थिर रूप से बनाए रखा जाता है। इसके अलावा, ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण के लिए एक प्रक्रिया शामिल है। वीवो कैंसर मॉडल में वर्तमान के साथ संयोजन में, यह तकनीक मूत्राशय ट्यूमर के आणविक आधार का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण होगी।
The authors have nothing to disclose.
इस शोध को कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन से केएस: एनआरएफ-2017R1A2B4006043 को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, एनआरएफ-2017M3C7A1047875, एनआरएफ-2017R1AAAA10153666, क्रिएटिव इकोनॉमी अग्रणी प्रौद्योगिकी विकास कार्यक्रम (SF317001A), पोस्को (2018Y060) और बीके21 प्लस रिसर्च फेलोशिप।
0.45 µm syringe filter (PES membrane) | Millipore | SLHP033RS | |
10 cm culture plate | Eppendorf | 0030-702-115 | |
90 mm Petri dish | SPL | 10090 | |
100 µm cell strainer | Corning | 352360 | |
15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
24-well plate | Corning | 3526 | |
29 G 1/2 insulin syringe | SHINA | B299473538 | |
3 mL syringe | Norm-ject | N7.A03 | |
50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
A8301 | Tocris | 2939 | stock concentration: 25 mM |
Absolute ethanol | Daejung | 4023-2304 | |
Absorbable suture | Henry Schein | 039010 | |
Advanced DMEM/F-12 | Thermo | 12634028 | |
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Thermo | A1049201 | |
B-27 | Gibco | 17504-044 | stock concentration: 50X |
BBN(N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine) | Tokyo Chemical Industry | B0938 | |
Blue nylon 5/0-13mm | AILEE | NB521 | |
C57BL Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | |
CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (nude mouse) | Charles River | 194 | |
Collagenase type I | Thermo | 17100017 | stock concentration: 20 mg/mL |
Collagenase type II | Thermo | 17100015 | stock concentration: 20 mg/mL |
Collagenase/dispase | Sigma | 10269638001 | stock concentration: 1 mg/mL |
Cyrovial | Corning | 430488 | |
DMEM(Dulbecco's modified minimum essential media) | Gibco | 11965-118 | |
DMSO(Dimethyl sulfoxide) | Sigma | D8418 | |
DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline) | Welgene | LB 001-02 | |
Enrofloxacin (Baytril) | Bayer Healthcare | DIN: 02169428 | |
FBS(Fetal bovine serum) | Millipore | ES009B-KC | |
Glutamax | Gibco | 35050061 | 100X |
HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Welgene | BB001-01 | |
Isoflurane | Hana Pharm Co., Ltd. | ||
Ketoprofen (Anafen) | Merial | DIN: 02150999 | |
Matrigel growth factor reduced (GFR) Growth Factor Reduced (GFR) |
Corning | 354230 | use for organoid culture in plate |
Matrigel high concentration (HC) | Corning | 354248 | use for organoid transplantation |
1.5 mL microtube | Axygen | MCT-150-C | |
LT1 transfection reagent | Mirus Bio | MIR 2300 | |
murine EGF(epidermal growth factor) | Peprotech | 315-09 | stock concentration: 100 µg/mL |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | stock concentration: 200 mM |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | stock concentration: 1M |
Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
pCMV.R 8.74 | Addgene | 22036 | Packaging plasmid |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | 100X |
pMD2.G | Addgene | 12259 | Envelope plasmid |
Polybrene(hexadim ethrine bromide) | Sigma | H9286 | stock concentration: 2 µg/mL |
pSiCoR | Addgene | 11579 | Lentiviral plasmid |
Razor blade | |||
Saline buffer | JW Pharmaceutical | ||
SW41Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
Thermolysin, Bacillus thermoproteolyticus | Millipore | 58656-2500KUCN | stock concentration: 250 KU/mL |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | |
Ultracentrifugation tube | Beckman Coulter | 331372 | |
Y-27632 dihydrochloride | Abmole | M1817 | stock concentration: 10 mM |