Summary
Dit protocol biedt gedetailleerde experimentele stappen om een driedimensionale in vitro cultuur van blaastumororganoïden afgeleid van kankerverwekkende murineblaaskanker vast te stellen. Cultuurmethoden zoals passaging, genetische manipulatie en orthotopische transplantatie van tumororganoïden worden beschreven.
Abstract
De ontwikkeling van geavanceerde tumormodellen is al lang aangemoedigd omdat de huidige kankermodellen beperkingen hebben aangetoond, zoals het ontbreken van driedimensionale (3D) tumorarchitectuur en een lage relevantie voor menselijke kanker. Onderzoekers hebben onlangs een 3D in vitro kanker model aangeduid als tumor organoïden die de kenmerken van een inheemse tumor in een kweekschaal kan nabootsen. Hier worden experimentele procedures in detail beschreven voor de oprichting van blaastumororganoïden van een kankerverwekkende murineblaastumor, inclusief kweek, passage en onderhoud van de resulterende 3D-tumororganoïden in vitro. Daarnaast worden protocollen beschreven om de gevestigde blaastumororganoïde lijnen voor genetische manipulatie te manipuleren met behulp van lentivirus-gemedieerde transductie, inclusief geoptimaliseerde voorwaarden voor de efficiënte introductie van nieuwe genetische elementen in tumor organoïden. Ten slotte wordt de procedure voor orthotopische transplantatie van blaastumororganoïden in de wand van de murineblaas voor verdere analyse uiteengezet. De methoden beschreven in dit artikel kan vergemakkelijken de oprichting van een in vitro model voor blaaskanker voor de ontwikkeling van betere therapeutische opties.
Introduction
Blaaskanker is de meest voorkomende urinewegkanker, met ongeveer 165.000 patiënten sterven jaarlijks1. Onder de verschillende vormen van blaaskanker vertoont spier-invasieve urotheliale carcinoma een agressief fenotype, en de overlevingskans van 5 jaar is lager dan 50%2. Nieuwe therapeutische opties voor invasieve urotheliale tumoren zijn niet uitgebreid in de afgelopen decennia1.
Kanker cellijnen zijn op grote schaal gebruikt voor drug screening3. Hoewel gunstige resultaten zijn waargenomen in tal van kandidaat-geneesmiddelen in kankercellen, slechte resultaten worden gemeld in klinische studies4. Na een verhoogde aanpassing aan in vitro tweedimensionale (2D) cultuuromgevingen, is het steeds moeilijker geworden om inheemse tumoren in cellijnen te recapituleren. Dierkanker modellen of patiënt afgeleide tumor xenografts kan worden gebruikt om de beperkingen waargenomen in blaaskanker cellijnen aan te pakken. Echter, dierlijke kanker modellen zijn tijd en resource intensief. Daarom zijn er al jaren verbeterde ziektemodellen op aanvraag en is er een nieuw modelsysteem ontwikkeld, organoïden, om de tekortkomingen van bestaande modellen5te overwinnen.
Een organoïde is een meercellige 3D-constructie die in vitro de fysiologische kenmerken van het overeenkomstige in vivo orgaan kan samenvatten. Normale en tumororganoïden kunnen worden afgeleid uit pluripotente of volwassen stamcellen, en primaire tumorcellen, respectievelijk5,6. In de afgelopen jaren zijn tumororganoïden vastgesteld uit een groot aantal verschillende tumorweefsels7, waaronder dikke darm8,9, blaas10,alvleesklier11,12, prostaat13, lever14, en borst15 tumorweefsels. Dergelijke tumororganoïden bootsen hun oorspronkelijke tumoren fenotypisch en genetisch na. Vanwege hun gelijkenis met in vivo tumorweefsels en hun talrijke praktische toepassingen, hebben onderzoekers ze aangenomen als nieuwe ziektemodellen in de studie van kankerpathogenese.
Hier worden de procedures voor de oprichting van tumororganoïden van een kankerverwekkende murine invasieve urotheliale tumor16 aangelegd. N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (BBN) wordt gebruikt als kankerverwekkend om invasieve urotheliale carcinoom bij muizen17 en de tumororganoïden, die de pathologische kenmerken van muis spier-invasieve blaastumoren vertonen, worden vastgesteld uit de BBN-geïnduceerde murineblaaskanker16. De methode om de tumororganoïden genetisch te manipuleren wordt geïllustreerd met behulp van lentivirus-gemedieerde transductie om een modelsysteem te ontwikkelen voor het bestuderen van de moleculaire basis van de ontwikkeling van blaaskanker. Daarnaast wordt een methode beschreven voor het transplanteren van organoïden orthotopically in een blaas om de rol van de inheemse blaasomgeving bij blaaskanker te onderzoeken.
Protocol
Alle procedures zijn goedgekeurd en uitgevoerd in het kader van de richtlijnen van het Institutioneel Comité voor dierenverzorging en -gebruik van POSTECH (IACUC-nummer: POSTECH-2019-0055).
1. In vitro cultuur van blaastumor organoïden
- Vaststellen blaastumor organoïden van de murine blaastumor (Figuur 1A).
OPMERKING: De procedure voor het genereren van BBN-geïnduceerde muisblaastumoren wordt beschreven in Shin et al.17.- Zorg 6 maanden lang voor 0,1% BBN-bevattend water in een donkere fles aan muisad libitum. Wijzig 2x per week BBN-bevattend water.
OPMERKING: Er werd een C57BL/6 mannelijke muis met een lichaamsgewicht van ongeveer 25 g bij 8-10 weken oud gebruikt. BBN-bevattend water kan worden toegediend aan maximaal vijf muizen in één kooi. - Na 6 maanden, euthanaseren van de muis met behulp van kooldioxide inademing en isoleren van de gehele blaastumor. Breng het naar een 90 mm petrischaal.
- Verwijder niet-kankerachtige delen en necrotische gebieden met behulp van steriele chirurgische schaar en was de blaastumorfragmenten 2-3 keer met koude 1x Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS). Verzamel de fragmenten en breng ze naar een nieuwe 90 mm Petrischaal.
- Voeg 1 mL van Dulbecco's gemodificeerde minimale essentiële medium (DMEM) toe met 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfoonzuur (HEPES).
- Hak het tumorweefsel zo klein mogelijk in stukken (0,5–1 mm3)met behulp van een gesteriliseerd scheermesje.
- Voeg 9 mL DMEM toe met 10 mM HEPES, 250 μg/mL collagenase type I, 250 μg/mL collagenase type II en 250 U/mL thermolysine. Incubeer het gehakte tumorweefsel gedurende 1,5-2 uur op een orbitale shaker in een couveuse (37 °C, 5% CO2) om de fragmenten te scheiden in de celsuspensie. Breng de celvering over in een buis van 50 mL.
OPMERKING: Als de grootte van de tumor geoogst van de muis groter is dan 1 cm3,behandelen met 2x de hoeveelheid thermolysine of verhoging van de incubatietijd. - Centrifugeer de buis op 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C en zuig de supernatant aan.
- Resuspend de pellet met behulp van 5 mL ammoniumchloride-kalium (ACK) lysing buffer om eventuele rode bloedcellen lyse. Incubeer de buis gedurende 3-5 min bij kamertemperatuur (RT) tot de volledige lyse van rode bloedcellen.
OPMERKING: Als de rode bloedcellen niet worden waargenomen, laat het lysingproces weg. - Voeg 20 mL DMEM toe aan de buis. Centrifugeer de buis op 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C en zuig de supernatant aan.
- Zet de pellet opnieuw op met 1 mL van 0,25% Trypsin-EDTA en 10 μM Y-27632 dihydrochloride (Y-27632) om de pellet te scheiden in enkele cellen. Incubeer de buis gedurende 5 min in een waterbad van 37 °C.
OPMERKING: Observeer de tumor onder een microscoop om volledige dissociatie in enkele cellen te bevestigen. Als er stukjes cellen aanhouden, pipeter de suspensie verder. - Neutraliseer trypsine met 10 mL DMEM met 10% foetaal runderserum (FBS). Filtreer de celvering door een 100 μm celzeef op een nieuwe buis van 50 mL om het onverteerd puin te verwijderen.
- Centrifugeer de buis op 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C en zuig de supernatant aan.
- Bestrijk een put in een 24 putplaat met 150 μL aan ijskoude groeifactor verminderde keldermembraanmatrix(Tabel met materialen)en plaats de 24 putplaat in een couveuse (37 °C, 5% CO2)gedurende 30 min om de keldermembraanmatrix te stollen.
LET OP: Ontdooi en onderhoud de matrix van het keldermembraan bij 4 °C om stolling voor gebruik te voorkomen. - Resuspend de pellet met behulp van 1 mL DMEM en tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Breng 3-4 x 104 tumorcellen over in een 1,5 mL microtube op ijs.
- Centrifugeer de microbuis op 400 x g gedurende 3 min bij 4 °C en gooi de supernatant voorzichtig weg.
- Zet de cellen opnieuw op met 500 μL voorverwarmd organoïde medium(tabel 1) en 10 μM Y-27632 en breng ze over in de gecoate put. Plaats de 24 putplaat in een couveuse (37 °C, 5% CO2).
- Extra blaastumorcellen kunnen worden gevuld met 1 mL DMEM met 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine en 10% dimethylsulfoxide (DMSO) in 1,5 mL cryovials. Plaats ze in een cryoviale vriescontainer en breng de container over naar een vrieskist van -80 °C. Na de opslag in de vriezer 's nachts, breng de cryovials in vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
- Verander het medium om de 2 dagen met 500 μL voorverwarmde organoïde medium (figuur 1B).
- Zorg 6 maanden lang voor 0,1% BBN-bevattend water in een donkere fles aan muisad libitum. Wijzig 2x per week BBN-bevattend water.
- Subcultuur blaastumor organoïden.
OPMERKING: Passage van blaastumororganoïden wanneer ze 100-150 μm in diameter bereiken wordt aanbevolen.- Voeg 500 μL collageenase/dispase toe aan het organoïde medium in de 24-putplaat met tumororganoïden. Pipetteer op en neer de kelder membraan matrix en het medium. Incubeer gedurende 20 min bij 37 °C en oogst de cellen in een buis van 15 mL.
OPMERKING: Onderzoek de organoïden geïsoleerd van de kelder membraan matrix onder een microscoop. Als de organoïden niet losstaan van de matrix van het keldermembraan, verhoogt u de incubatietijd of pipet vaker. - Voeg 5 mL voorverwarmde DMEM toe, centrifugeer de buis op 400 x g gedurende 3 min bij 4 °C en zuig de supernatant aan.
- Resuspend de pellet met behulp van 1 mL voorverwarmde 0,25% trypsin-EDTA en 10 μM Y-27632. Incubeer gedurende 5 min in een waterbad van 37 °C. Pipet de cellen krachtig op en neer en neutraliseer de trypsine met 5 mL DMEM met 10% FBS.
- Centrifugeer de buis op 400 x g gedurende 3 min bij 4 °C en zuig de supernatant aan.
- Resuspend de pellet met behulp van 1 mL van voorverwarmde organoïde medium en tel het aantal enkele tumorcellen.
- Herhaal stap 1.1.14−1.1.18.
- Voeg 500 μL collageenase/dispase toe aan het organoïde medium in de 24-putplaat met tumororganoïden. Pipetteer op en neer de kelder membraan matrix en het medium. Incubeer gedurende 20 min bij 37 °C en oogst de cellen in een buis van 15 mL.
2. Genetische manipulatie van blaastumororganoïden Met behulp van Lentivirus-gemedieerde transductie(figuur 2A)
- Produceer de GFP-uitdrukkende lentivirale deeltjes.
- Op dag 0, plaat HEK 293T cellen met een dichtheid van 5-6 x 106 cellen per 10 cm celkweekplaat in cellijn kweekmedium (d.w.z. DMEM met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine).
- Bereid op dag 1 de DNA-transfectionoplossing voor, inclusief overdrachtsplasmid met GFP (8 μg), lentivirale verpakkingsplasmid (10 μg pCMVR 8,74 en 3 μg pMD2.G) en 1 mL verlaagd serummedium(Tabel met materialen).
- Voeg 3 μL transfection reagens (Tabel van materialen) per 1 μg van totale plasmid volgens de instructies van de fabrikant en meng zachtjes door pipetteren. Incubeer voor 20 min bij RT en voeg 9 mL DMEM toe met 10% FBS.
- Aanzuigen van de cultuur medium in de cel cultuur plaat met HEK 293T cellen. Breng 10 mL van de DNA-transfection-oplossing voorzichtig over op de HEK 293T-cellen en incubeer in een celkweekincubator bij 37 °C.
- Op dag 3, observeer de cellen onder een fluorescentiemicroscoop (opwinding op 488 nm en emissie bij 512 nm) om de transfection-efficiëntie te bepalen. Bijna 90%–100% van de cellen in de gehele celpopulatie moet GFP uitdrukken.
- Verzamel de supernatant (met het virus) en filtraat de supernatant met een 0,45 μm polyethersulfon (PES) filter.
OPMERKING: Gebruik een eiwitarm filter, zoals een PES-filter. - Om het virus te concentreren centrifugeer het virus supernatant op 98.768 x g in een ultracentrifuge gedurende 2 uur bij 4 °C in een swingende emmerrotor (Tabel met materialen) en gooi het supernatant zorgvuldig weg.
- Resuspend de pellet in 2,5 mL koud organoïde medium.
- Voor langdurige opslag, aliquot 250 μL lentiviraal medium in cryogene flacons en snap-vries ze met behulp van vloeibare stikstof. Bewaar de bevroren virale voorraden in een vrieskist van -80 °C.
- Voer lentivirus-gemedieerde transductie van de blaastumor organoïden.
- Op dag 2 splitste u de hierboven beschreven tumororganoïden (stap 1.2) 12 uur vóór de lentivirus-gemedieerde transductie.
- Ontdooi op dag 3 snel een aliquot (stap 2.1.9) met virus in een waterbad van 37 °C en voeg de 250 μL organoïde medium toe met 10 μM Y-27632 en 8 μg/mL hexadimethrine bromide.
- Vervang het organoïde medium in de 24-putplaat door tumororganoïden door 500 μL virushoudend medium en incubeer gedurende 12-16 uur in een couveuse (37 °C, 5% CO2).
- Op dag 4 wijzig je het medium met 500 μL vers organoïde medium.
OPMERKING: Na 12-16 uur incubatie moet het medium worden vervangen, omdat het medium dat lentivirus en hexadimethrine bromide bevat, cytotoxisch is. - Monitor op dag 6 het GFP-signaal van de tumororganoïden 3 dagen na transductie onder een fluorescentiemicroscoop (figuur 2B).
- Op dag 10, passage en voorraad van de organoïden 7 dagen na transductie zoals beschreven in stap 1.2, om de genetisch gemodificeerde tumor organoïde lijnen te handhaven.
3. Orthotopische transplantatie van blaasorganoïde(figuur 3A)
- Bereid de blaastumor organoïden voor orthotopische transplantatie.
- Voor transplantatie kweekt de blaastumororganoïden gedurende 5-7 dagen, zoals hierboven beschreven (stap 1.2).
- Voeg 500 μL collageenase/dispase toe aan organoïde medium in een 24-putplaat met de tumororganoïden. Pipetteer op en neer de kelder membraan matrix en medium. Incubeer gedurende 20 min bij 37 °C en verzamel de cellen in een buis van 15 mL.
- Voeg 5 mL voorverwarmde DMEM toe, centrifugeer de buis op 400 x g gedurende 3 min bij 4 °C en zuig de supernatant aan.
- Zet de pellet opnieuw op met 1 mL DMEM en breng de oplossing over in een petrischaal van 90 mm.
- Onder een microscoop, pick-up van de 10-100 tumor organoïden met behulp van een p200 micropipette en verzamel ze in een microtube op ijs.
- Centrifugeer de buis op 400 x g gedurende 3 min bij 4 °C en gooi de supernatant voorzichtig weg.
- Onderhoud de celpellet op ijs totdat de muizen klaar zijn voor een operatie.
- Submucosale blaaswandtransplantatie
OPMERKING: Deze procedure wordt gewijzigd uit het protocol gepubliceerd door Fu etal. 18.- Bereid een 8 tot 10 week oude mannelijke naakt muis (CAnN.Cg-Foxn1nu / Crl) ten minste 1 week voor het experiment om het mogelijk te maken om te acclimatiseren aan een nieuwe omgeving. Injecteer enrofloxacine (5 mg/kg) onderhuids 24 uur voor de operatie.
- Maak het bankoppervlak schoon door zeep en water. Autoclave de chirurgische instrumenten voorafgaand aan de chirurgische ingreep en het uitvoeren van een operatie met behulp van steriele instrumenten.
- Houd de 29 G insulinespuit, pipettips en keldermembraanmatrix op ijs. Toedienen ketoprofen (5 mg/kg) onderhuids vóór toediening van anesthesie.
- Verdoven de muis met 4% isoflurane in een inductiekamer. Zodra de algemene anesthesie bereikt, leg de muis in een supine positie en handhaven anesthesie door masker inademing van 2% verdampte isoflurane.
OPMERKING: Als de verdovingstijd meer dan 30 min is, breng dan oogzalf aan op beide ogen met behulp van een wattenstaafje om hoornvliesdrogen te voorkomen. - Breng povidone-jodium aan met een steriel gaas en veeg het af met 70% ethanol. Herhaal 3x met een nieuw gaas of een wattenstaafje elke keer.
- Bedek de anus en het chirurgische veld met behulp van wegwerp, steriele chirurgische gordijnen.
- Met behulp van een ontledenmicroscoop voor vergroting, maak een kleine transversale incisie (kleiner dan 1,5 cm) in de huid en gespierde wand van de onderste middellijn buik met steriele chirurgische schaar. Stel de blaas uit de buikholte bloot en steun deze met zoutgedrenkswatten.
OPMERKING: Als de blaas vol urine zit, druk dan voorzichtig op de blaas om deze iets te decomprimeren. - Resuspend de organoïde pellets (stap 3.1.7) in 80 μL organoïde medium met 50% hoge concentratie keldermembraanmatrix(Tafel van Materialen).
- Injecteer de organoïde suspensie in het voorste aspect van de blaaskoepel met behulp van de 29 G insulinespuit onder een ontledende microscoop.
- Sluit de binnenste laag van de buikwand met antibacteriële absorberende hechting en sluit de buitenste laag met 4-0 nylon hechting. Desinfecteer de chirurgische site met povidone-jodium en 70% ethanol.
- Laat de muis herstellen onder een infrarood irradiator 10-15 min. Monitor de muis totdat hij weer bij bewustzijn en beweeglijkheid.
- Controleer een dag na de operatie de algemene toestand van de muis en anastomotische lekkage. Beheer ketoprofen (5 mg/kg) eenmaal daags per dag gedurende 3 dagen postoperatief en behandel enrofloxacine (5 mg/kg) eenmaal per dag gedurende 10 dagen postoperatief.
- Wanneer incisie plaats is genezen (10-14 dagen na de operatie), verwijder de hechtingen. Monitor de groei van de muisblaastumor gedurende 2-3 weken na de tumor organoïde injectie.
- Als de groei van de blaastumor wordt waargenomen, euthanaseren de muis met behulp van kooldioxide inademing, en oogst de hele blaastumor. Was het met koude DPBS (figuur 3B)16.
- Om de blaastumor histologie te analyseren, vlek de paraffine-ingebedde sectie van het weefsel met behulp van hematoxyline en eosine (H en E) kleuring(figuur 3B)16.
Representative Results
In vitro cultuur van muisblaastumororganoïden
Het aantal tumorcellen gescheiden van een ~ 1 cm3 BBN-geïnduceerde tumor is ten minste 4 x 105 cellen. Wanneer de cellen in eerste instantie worden gezaaid in de kelder membraan matrix, niet-kankercellen en puin kan worden waargenomen. Puin werd geleidelijk verdund door de voortzetting van de subcultuur. Figuur 1B toont beelden van de gekweekte organoïden op verschillende tijdspunten. Als de tumorcellen geen tumororganoïden vormen, zijn de cellen mogelijk dood tijdens de dissociatiestap. In een dergelijk geval moeten de dissociatieprocedures, waaronder incubatietijd met het enzym, worden aangepast om de levensvatbaarheid van de cellen te verhogen.
Expressie van GFP in blaastumororganoïden met lentivirus-gemedieerde genetische manipulatie
Blaastumororganoïden vertoonden sterke GFP-signalen met succesvolle lentivirale infectie(figuur 2B). Na concentratie was in totaal 250 μL virushoudende media voldoende om 3 x 104 enkele tumorcellen op de matrix van het keldermembraan te infecteren, met behoud van 90%-100% infectieefficiëntie. GFP-signalen kunnen worden gedetecteerd van de blaastumororganoïden 3 dagen na lentivirale transductie. Als de fluorescentiesignalen laag zijn, is de efficiëntie van virale infectie potentieel laag. Dit kan te wijten zijn aan tal van factoren, zoals lage virale titer, en de procedures moeten dienovereenkomstig worden aangepast.
Orthotopische transplantatie van blaastumororganoïden
Een blaastumor allograft verkregen uit BBN-geïnduceerde blaastumor organoïden wordt gepresenteerd in figuur 3B16. Blaastumor allografts werden geoogst 3 weken na orthotopische transplantatie. De histologie van de getransplanteerde blaastumor werd geanalyseerd met behulp van H en E vlekken. Orthotopische transplantaties van tumororganoïden kunnen groeien als blaastumoren gedurende 2-3 weken.
Figuur 1: In vitro cultuur van muisblaastumororganoïden. (A) Schematisch diagram voor de oprichting van muisblaas tumor organoïden. (B) Representatieve beelden voor de cultuur van blaastumororganoïden op verschillende tijdspunten. Muis blaas tumor organoïden werden vastgesteld en gekweekt over 9 dagen. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Expressie van GFP in blaastumororganoïden met behulp van lentivirus-gemedieerde genetische manipulatie. (A) Schematisch diagram van lentivirale transfection en transductie van blaastumororganoïden. (B) Representatieve beelden van blaastumororganoïden die GFP uitdrukken. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Orthotopische transplantatie van blaastumororganoïden. (A) Schematisch diagram van orthotopische transplantatie van blaastumororganoïden aan een naakte muis. (B) Representatieve beelden van blaasblazen en H en E bevlekte secties van muizen orthotopically getransplanteerd met blaastumor organoïden. Vergrote weergaven van de boxed regions in de middelste panelen worden weergegeven in de linkerpanelen. Schaalbalk = 500 μm. Dit cijfer werd gereproduceerd uit figuur 1-figuur supplement 1, Kim et al.16, gepubliceerd onder de Creative Commons Attribution 4.0 International Public License (CC BY 4.0; https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Muis blaas tumor organoïden medium | |
| Geavanceerde DMEM/F-12 (basismedium) | 10 mM HEPES(pH 7.4) |
| 10 mM Nicotinamide | 0,5x Serumvrij supplement |
| 2 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide | 1% Penicilline/Streptomycine |
| 1 mM N-acetyl-L-cysteïne | 50 ng/mL Murine epidermale groeifactor |
| 1 μM A 83-01 | |
Tabel 1: Samenstelling van blaastumor organoïde medium.
Discussion
Dit protocol beschrijft de experimentele procedures voor de kweek en het behoud van blaastumororganoïden afkomstig van kankerverwekkende murineblaastumoren.
In dit protocol zijn er verschillende experimentele stappen waarin de procedures mogelijk enige probleemoplossing nodig hebben. Ten eerste is het aantal tumorcellen dat in eerste instantie ingezaaid wordt een kritische factor omdat lage aantallen tumorcellen in de cultuur (<2 x 104 cellen) meestal leiden tot celdood door gebrek aan interacties tussen tumorcellen. In tegenstelling, beginnenmet te veel cellen (>5 x 104 cellen) bij het zaaien leidt tot overvolle organoïden, wat resulteert in moeilijkheden bij het hanteren van culturen met een slechte groei van elke organoïde. Er wordt sterk gesuggereerd dat meerdere platen met verschillende aantallen cellen worden vastgesteld aan het begin om de experimentele omstandigheden te optimaliseren. Het identificeren van het juiste aantal initiële tumorcellen is cruciaal om de hoogste cellevensvatbaarheid te bereiken en om succesvolle blaastumororganoïden vast te stellen. Ook in de lange termijn cultuur van meer dan 2 weken zonder passaging, de meeste tumor organoïden stoppen met groeien, mogelijk te wijten aan onvoldoende aanbod van voedingsstoffen in het centrum van de organoïden en de uitputting van de groeifactor in de kelder membraan matrix. Daarom is het tijdig onderdompelen van organoïden een cruciale stap om de tumororganoïdecultuur te behouden.
Ten tweede is de productie van hoog-titer lentivirale deeltjes van cruciaal belang voor de efficiënte genetische manipulatie van tumororganoïden. Om problemen met virustiterop op te lossen, wordt sterk gesuggereerd dat de virustiters worden bepaald vóór virale transductie elke keer omdat lentivirale constructies de neiging hebben om virale deeltjes te produceren met verschillende efficiëntie. Als tumororganoïden vertonen lage levensvatbaarheid na virale infectie, is het waarschijnlijk dat de virale titers zijn potentieel te hoog. Het wordt sterk voorgesteld om lagere hoeveelheid virus in dit geval te gebruiken. Ten derde, tijdens orthotopische transplantatie van BBN-geïnduceerde blaastumor organoïden, is het van cruciaal belang om de integriteit van de blaaswand te behouden. In het geval dat de injectie het lumen van de blaas bereikt door de blaaswandlaag te penetreren, moet het experiment worden beëindigd en weggegooid. Indien mogelijk wordt de monitoring van de groei van blaastumoren aanbevolen met behulp van een echografiesysteem.
Een beperking van de huidige technieken is de afwezigheid van de tumor micro-omgeving of stroma in deze organoïden. Om dit probleem te overwinnen, wordt sterk gesuggereerd dat de orthotopische transplantatie van tumororganoïden een in vivo systeem gebruiken om de inheemse tumormicroomgeving na te bootsen. In de toekomst zal het nodig zijn om 3D-in-vitro organoïde systemen te ontwikkelen die bestaan uit tumororganoïden met andere componenten van tumorstroma.
Een van de belangrijkste implicaties van onze techniek is dat bij orthotopische transplantatie van tumororganoïden slechts 10 blaastumororganoïden tumorgroei in de blaas kunnen veroorzaken. Vergeleken met de conventionele tumortransplantatie-experimenten die 5 x 105–1 x 106 enkele blaastumorcellen vereisen, zijn onze methoden veel efficiënter en robuuster. Een ander belangrijk verschil is dat de organoïden divers kunnen worden gemanipuleerd met behulp van verschillende lentivirale vectoren, zoals lentivirale constructies met kortharige RNA, het CRISPR-Cas9-systeem of genen van belang. Dit zouden krachtige instrumenten zijn om toe te voegen aan de huidige organoïde technologie. Over het algemeen kunnen de hier gepresenteerde experimentele benaderingen de oprichting vergemakkelijken van in vitro tumormodellen die ons begrip van de pathogenese van blaaskanker kunnen verbeteren in plaats van 2D-blaaskankercellen te gebruiken.
Deze methode was in staat om blaastumor organoïden afgeleid van een kankerverwekkende murine blaastumor vast te stellen. Het artikel geeft een beschrijving van de lentivirus-gemedieerde experimentele procedures waardoor de genetische modificaties worden geïntroduceerd en stabiel onderhouden in blaastumor organoïden. Daarnaast is een procedure voor orthotopische transplantatie van tumororganoïden opgenomen. In combinatie met de huidige in vivo kankermodellen zal deze techniek een nuttig hulpmiddel zijn om de moleculaire basis van blaastumorigenese te bestuderen.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de National Research Foundation of Korea aan K.S: NRF-2017R1A2B4006043, NRF-2017M3C7A1047875, NRF-2017R1A5A1015366, Creative Economy Leading Technology Development Programme (SF317001A), POSCO (2018Y060) en de BK21 Plus Research Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm syringe filter (PES membrane) | Millipore | SLHP033RS | |
| 10 cm culture plate | Eppendorf | 0030-702-115 | |
| 90 mm Petri dish | SPL | 10090 | |
| 100 µm cell strainer | Corning | 352360 | |
| 15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 29 G 1/2 insulin syringe | SHINA | B299473538 | |
| 3 mL syringe | Norm-ject | N7.A03 | |
| 50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
| A8301 | Tocris | 2939 | stock concentration: 25 mM |
| Absolute ethanol | Daejung | 4023-2304 | |
| Absorbable suture | Henry Schein | 039010 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo | 12634028 | |
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Thermo | A1049201 | |
| B-27 | Gibco | 17504-044 | stock concentration: 50X |
| BBN(N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine) | Tokyo Chemical Industry | B0938 | |
| Blue nylon 5/0-13mm | AILEE | NB521 | |
| C57BL Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (nude mouse) | Charles River | 194 | |
| Collagenase type I | Thermo | 17100017 | stock concentration: 20 mg/mL |
| Collagenase type II | Thermo | 17100015 | stock concentration: 20 mg/mL |
| Collagenase/dispase | Sigma | 10269638001 | stock concentration: 1 mg/mL |
| Cyrovial | Corning | 430488 | |
| DMEM(Dulbecco's modified minimum essential media) | Gibco | 11965-118 | |
| DMSO(Dimethyl sulfoxide) | Sigma | D8418 | |
| DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline) | Welgene | LB 001-02 | |
| Enrofloxacin (Baytril) | Bayer Healthcare | DIN: 02169428 | |
| FBS(Fetal bovine serum) | Millipore | ES009B-KC | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | 100X |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Welgene | BB001-01 | |
| Isoflurane | Hana Pharm Co., Ltd. | ||
| Ketoprofen (Anafen) | Merial | DIN: 02150999 | |
| Matrigel growth factor reduced (GFR) Growth Factor Reduced (GFR) |
Corning | 354230 | use for organoid culture in plate |
| Matrigel high concentration (HC) | Corning | 354248 | use for organoid transplantation |
| 1.5 mL microtube | Axygen | MCT-150-C | |
| LT1 transfection reagent | Mirus Bio | MIR 2300 | |
| murine EGF(epidermal growth factor) | Peprotech | 315-09 | stock concentration: 100 µg/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | stock concentration: 200 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | stock concentration: 1M |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
| pCMV.R 8.74 | Addgene | 22036 | Packaging plasmid |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | 100X |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Envelope plasmid |
| Polybrene(hexadim ethrine bromide) | Sigma | H9286 | stock concentration: 2 µg/mL |
| pSiCoR | Addgene | 11579 | Lentiviral plasmid |
| Razor blade | |||
| Saline buffer | JW Pharmaceutical | ||
| SW41Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
| Thermolysin, Bacillus thermoproteolyticus | Millipore | 58656-2500KUCN | stock concentration: 250 KU/mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | |
| Ultracentrifugation tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Abmole | M1817 | stock concentration: 10 mM |
References
- Sanli, O., et al. Bladder cancer. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17022 (2017).
- Stenzl, A., et al. Treatment of muscle-invasive and metastatic bladder cancer: update of the EAU guidelines. European Urology. 59 (6), 1009-1018 (2011).
- Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603 (2012).
- Caponigro, G., Sellers, W. R. Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 179 (2011).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407 (2018).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246 (2016).
- Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-517 (2018).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell-and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364 (2015).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer–derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424 (2017).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Kim, S., et al. Epigenetic regulation of mammalian Hedgehog signaling to the stroma determines the molecular subtype of bladder cancer. eLife. 8, 43024 (2019).
- Shin, K., et al. Cellular origin of bladder neoplasia and tissue dynamics of its progression to invasive carcinoma. Nature Cell Biology. 16 (5), 469 (2014).
- Fu, C. L., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. Mouse bladder wall injection. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (53), e2523 (2011).
