このプロトコルは、発癌性癌誘発性マウス膀胱癌に由来する膀胱腫瘍オルガノイドの三次元体内培養を確立するための詳細な実験ステップを提供する。腫瘍オルガノイドの受動法、遺伝子工学、および正体移植を含む培養方法が記載されている。
現在のがんモデルは、3次元(3D)腫瘍アーキテクチャの欠如やヒト癌との関連性の低さなどの限界を示しているため、高度な腫瘍モデルの開発は長い間奨励されてきました。研究者たちは最近、培養皿の在来腫瘍の特徴を模倣できる腫瘍オルガノイドと呼ばれる3D体外癌モデルを開発した。ここで、実験手順は、発癌性物質誘発性マウス膀胱腫瘍からの膀胱腫瘍オルガノイドの確立に関して詳述されているが、結果として生じる3D腫瘍オルガノイドの培養、通過、および維持を含むインビトロで。さらに、レンチウイルス媒介性形容積を用いた遺伝子工学のための確立された膀胱腫瘍オルガノイドラインを操作するためのプロトコルが記載されており、腫瘍への新しい遺伝子要素の効率的な導入のための最適化された条件が含まれるオルガノイド。最後に、更なる分析のために膀胱の壁に膀胱腫瘍オルガノイドの正所移植のための手順がレイアウトされている。この記事で説明する方法は、より良い治療オプションの開発のための膀胱癌のためのインビトロモデルの確立を促進することができる。
膀胱癌は最も一般的な尿路癌であり、年間約165,000人の患者が死亡している。種々の膀胱癌の中で、筋浸潤性尿路上皮癌は積極的な表現型を示し、その5年生存率は50%2より低い。侵襲性尿路上皮腫瘍の新しい治療オプションは、過去数十年にわたって拡大されていません1.
癌細胞株は、薬物スクリーニング3に広く使用されている。好ましい結果は癌細胞株の多数の薬剤候補で観察されているが、臨床試験4で悪い結果が報告される。in vitro2次元(2D)培養環境への適応が増加した後、細胞株における天然腫瘍の再現がますます困難になっている。動物癌モデルまたは患者由来腫瘍異種移植片は、膀胱癌細胞株で観察される限界に対処するために使用することができる。しかし、動物癌モデルは時間と資源集約的です。したがって、改良された疾患モデルは長年にわたって需要に応じて行われ、新しいモデルシステム、オルガノイドは、既存モデル5の欠点を克服するために開発されている。
オルガノイドは、インビボ器官の生理学的特性をin vitroで再現できる多細胞3Dコンストラクトです。正常および腫瘍オルガノイドは、多能性幹細胞または成体幹細胞、および原発性腫瘍細胞、それぞれ5、6のいずれかに由来することができる。過去数年間にわたり、腫瘍オルガノイドは、大腸8、9、膀胱10、膵臓11、12、前立腺13、肝臓14、および乳房15腫瘍組織を含む多数の多様な腫瘍組織7から確立されてきた。このような腫瘍オルガノイドは、元の腫瘍を典型的かつ遺伝的に模倣する。インビボ腫瘍組織との類似性と数多くの実用的な応用により、研究者は癌病因の研究において新しい疾患モデルとしてそれらを採用している。
ここでは、発癌性泌尿器科腫瘍16から腫瘍オルガノイドを確立するための手順がレイアウトされている。N-ブチル-N-(4-ヒドロキシブチル)ニトロソミン(BBN)は、マウス17に侵襲性尿路上皮癌を誘導する発癌物質として使用され、マウスの筋肉浸潤性膀胱腫瘍の病理学的特徴を示す腫瘍オルガノイドは、BBN誘発性のマウス膀胱癌16から確立される。腫瘍オルガノイドを遺伝的に操作する方法は、レンチウイルス媒介性形容変を用いて、膀胱癌の発症の分子基盤を研究するためのモデルシステムを開発する方法を示している。また、オルガノイドを結体的に膀胱に移植して膀胱癌における在来膀胱環境の役割を調べる方法が記載されている。
このプロトコルは、発癌性腫瘍誘発性マウス膀胱腫瘍に由来する膀胱腫瘍オルガノイドを培養および維持するための実験的手順を記述する。
このプロトコルでは、いくつかの手順でトラブルシューティングが必要ないくつかの実験的な手順があります。まず、最初に播種される腫瘍細胞の数は、培養中の腫瘍細胞の数が少ないため(<2 x 104細胞)、腫瘍細胞間の相互作用の欠如のために細胞死を引き起こします。対照的に、播種時にあまりにも多くの細胞(>5 x 104細胞)から始まり、過剰なオルガノイドを引き起こし、各オルガノイドの生育不良の培養を扱う際に困難が生じる。実験条件を最適化するために、細胞数が異なる複数のプレートを最初に確立することが強く示唆されている。初期腫瘍細胞の適切な数を特定することは、最高の細胞生存率を達成し、成功した膀胱腫瘍オルガノイドを確立するために重要です。また、2週間以上の長期培養では、ほとんどの腫瘍オルガノイドは成長を止め、オルガノイドの中心にある栄養素の供給が不十分であり、基細胞膜マトリックスにおける成長因子の枯渇に起因する可能性がある。したがって、オルガノイドを適時に覆い、腫瘍オルガノイド培養を維持する重要なステップとなる。
第二に、高刺激レンチウイルス粒子の産生は、腫瘍オルガノイドの効率的な遺伝子操作に不可欠である。ウイルスの反復子関連の問題をトラブルシューティングするために、レンチウイルス構築物は様々な効率でウイルス粒子を産生する傾向があるため、ウイルスの誘導前にウイルスの反復物を毎回決定することが強く示唆されている。腫瘍オルガノイドがウイルス感染後に生存率が低い場合、ウイルス力価が高すぎる可能性がある。この場合、ウイルスの量を減らすと強く推奨されます。第3に、BBN誘発膀胱腫瘍オルガノイドの正体移植の際に、膀胱壁の完全性を維持することが重要である。注射が膀胱壁層を貫通して膀胱の内腔に達した場合、実験は終了し、廃棄されるべきである。可能であれば、超音波画像システムを用いた膀胱腫瘍増殖のモニタリングが推奨される。
現在の技術の1つの制限は、これらのオルガノイドにおける腫瘍微小環境または間質の欠如である。この問題を克服するために、腫瘍オルガノイドの正体移植は、インビボシステムを用い、ネイティブの腫瘍微小環境を模倣することが強く示唆されている。今後は、腫瘍間質の他の成分を有する腫瘍オルガノイドから構成される3D in vitroオルガノイド系を開発する必要があります。
我々の技術の主な意味の1つは、腫瘍オルガノイドの正体移植において、膀胱内の腫瘍増殖を誘導できるのは10個の膀胱腫瘍オルガノイドだけである。5 x 105–1 x 106単一膀胱腫瘍細胞を必要とする従来の腫瘍移植実験と比較して、我々の方法ははるかに効率的で堅牢です。もう一つの大きな違いは、オルガノイドは、短いヘアピンRNA、CRISPR-Cas9系、または関心のある遺伝子を含むレンチウイルス構造など、様々なレンチウイルスベクターを使用して多様に操作できることです。これらは、現在のオルガノイド技術に追加する強力なツールになります。全体として、ここで提示された実験的アプローチは、2D膀胱癌細胞株を使用するのではなく、膀胱癌の病因に関する理解を向上させることができるインビトロ腫瘍モデルの確立を促進することができる。
この方法は、発癌性物質誘発性マウス膀胱腫瘍に由来する膀胱腫瘍オルガノイドを確立することができた。この記事では、遺伝子組み換えが導入され、膀胱腫瘍オルガノイドで安定に維持されるレンチウイルス媒介実験手順の説明を提供する。また、腫瘍オルガノイドの正体移植の手順も含まれる。現在の生体内癌モデルと組み合わせて、この技術は膀胱腫瘍形成の分子基盤を研究するのに有用なツールとなるであろう。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、韓国国立研究財団からK.S.への助成金によって支えられました:NRF-2017R1A2B4006043、NRF-2017M3C7A1047875、NRF-2017R1A5A101010101066、クリエイティブエコノミーリーディング技術開発プログラム(SF31701A)、および2018年BK21プラスリサーチフェローシップ。
0.45 µm syringe filter (PES membrane) | Millipore | SLHP033RS | |
10 cm culture plate | Eppendorf | 0030-702-115 | |
90 mm Petri dish | SPL | 10090 | |
100 µm cell strainer | Corning | 352360 | |
15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
24-well plate | Corning | 3526 | |
29 G 1/2 insulin syringe | SHINA | B299473538 | |
3 mL syringe | Norm-ject | N7.A03 | |
50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
A8301 | Tocris | 2939 | stock concentration: 25 mM |
Absolute ethanol | Daejung | 4023-2304 | |
Absorbable suture | Henry Schein | 039010 | |
Advanced DMEM/F-12 | Thermo | 12634028 | |
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Thermo | A1049201 | |
B-27 | Gibco | 17504-044 | stock concentration: 50X |
BBN(N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine) | Tokyo Chemical Industry | B0938 | |
Blue nylon 5/0-13mm | AILEE | NB521 | |
C57BL Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | |
CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (nude mouse) | Charles River | 194 | |
Collagenase type I | Thermo | 17100017 | stock concentration: 20 mg/mL |
Collagenase type II | Thermo | 17100015 | stock concentration: 20 mg/mL |
Collagenase/dispase | Sigma | 10269638001 | stock concentration: 1 mg/mL |
Cyrovial | Corning | 430488 | |
DMEM(Dulbecco's modified minimum essential media) | Gibco | 11965-118 | |
DMSO(Dimethyl sulfoxide) | Sigma | D8418 | |
DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline) | Welgene | LB 001-02 | |
Enrofloxacin (Baytril) | Bayer Healthcare | DIN: 02169428 | |
FBS(Fetal bovine serum) | Millipore | ES009B-KC | |
Glutamax | Gibco | 35050061 | 100X |
HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Welgene | BB001-01 | |
Isoflurane | Hana Pharm Co., Ltd. | ||
Ketoprofen (Anafen) | Merial | DIN: 02150999 | |
Matrigel growth factor reduced (GFR) Growth Factor Reduced (GFR) |
Corning | 354230 | use for organoid culture in plate |
Matrigel high concentration (HC) | Corning | 354248 | use for organoid transplantation |
1.5 mL microtube | Axygen | MCT-150-C | |
LT1 transfection reagent | Mirus Bio | MIR 2300 | |
murine EGF(epidermal growth factor) | Peprotech | 315-09 | stock concentration: 100 µg/mL |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | stock concentration: 200 mM |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | stock concentration: 1M |
Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
pCMV.R 8.74 | Addgene | 22036 | Packaging plasmid |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | 100X |
pMD2.G | Addgene | 12259 | Envelope plasmid |
Polybrene(hexadim ethrine bromide) | Sigma | H9286 | stock concentration: 2 µg/mL |
pSiCoR | Addgene | 11579 | Lentiviral plasmid |
Razor blade | |||
Saline buffer | JW Pharmaceutical | ||
SW41Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
Thermolysin, Bacillus thermoproteolyticus | Millipore | 58656-2500KUCN | stock concentration: 250 KU/mL |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | |
Ultracentrifugation tube | Beckman Coulter | 331372 | |
Y-27632 dihydrochloride | Abmole | M1817 | stock concentration: 10 mM |