Denne protokollen gir detaljerte eksperimentelle skritt for å etablere en tredimensjonal in vitro kultur av blære tumor organoider avledet fra kreftfremkallende murine blærekreft. Kulturmetoder inkludert passaging, genteknologi, og ortopisk transplantasjon av tumor organoider er beskrevet.
Utviklingen av avanserte tumormodeller har lenge blitt oppmuntret fordi dagens kreftmodeller har vist begrensninger som mangel på tredimensjonal (3D) tumorarkitektur og lav relevans for menneskelig kreft. Forskere har nylig utviklet en 3D in vitro kreft modell referert til som tumor organoider som kan etterligne egenskapene til en innfødt svulst i en kulturrett. Her er eksperimentelle prosedyrer beskrevet i detalj for etablering av blæretumororganoider fra en kreftfremkallende murineblæresvulst, inkludert kultur, passasje og vedlikehold av de resulterende 3D-tumororganoidene in vitro. I tillegg beskrives protokoller for å manipulere de etablerte blæretumororganoide linjene for genteknologi ved hjelp av lentivirusmediert transduksjon, inkludert optimaliserte forhold for effektiv innføring av nye genetiske elementer i svulst organoider. Til slutt er prosedyren for ortopisk transplantasjon av blæretumororganoider inn i veggen av murineblæren for videre analyse lagt ut. Metodene som er beskrevet i denne artikkelen kan lette etableringen av en in vitro-modell for blærekreft for utvikling av bedre terapeutiske alternativer.
Blærekreft er den mest utbredte urinveiskreft, med ca 165.000 pasienter som dør årlig1. Blant de ulike typer blærekreft viser muskelindetoll eominom en aggressiv fenotype, og dens 5 års overlevelse er lavere enn 50%2. Nye terapeutiske alternativer for invasive uroteltumorer har ikke blitt utvidet i løpet av de siste tiårene1.
Kreftcellelinjer har blitt mye brukt til legemiddelscreening3. Selv om gunstige resultater har blitt observert hos mange legemiddelkandidater i kreftcellelinjer, rapporteres dårlige resultater i kliniske studier4. Etter økt tilpasning til in vitro todimensjonale (2D) kulturmiljøer, har det blitt stadig vanskeligere å rekapitulere innfødte svulster i cellelinjer. Dyrekreftmodeller eller pasientavledede tumorxenografts kan brukes til å håndtere begrensningene som observeres i blærekreftcellelinjer. Men dyrekreftmodeller er tids- og ressurskrevende. Derfor har forbedrede sykdomsmodeller vært på forespørsel i årevis, og et nytt modellsystem, organoider, er utviklet for å overvinne manglene til eksisterende modeller5.
En organoid er en flercellet 3D-konstruksjon som kan rekapitulere in vitro de fysiologiske egenskapene til det tilsvarende in vivo-organet. Normale og tumororganoider kan avledes fra enten pluripotente eller voksne stamceller, og primære tumorceller, henholdsvis5,6. I løpet av de siste årene har tumororganoider blitt etablert fra et stort antall forskjellige tumorvev7, inkludert kolon8,9, blære10, bukspyttkjertel11,12, prostata13, lever14, og bryst15 tumorvev. Slike tumororganoider etterligner sine opprinnelige svulster fenotypisk og genetisk. På grunn av deres likhet med in vivo tumorvev og deres mange praktiske anvendelser, har forskere adoptert dem som nye sykdomsmodeller i studiet av kreftpatogenese.
Her er prosedyrene for etablering av tumororganoider fra et kreftfremkallende-indusert murineininvasiv uroteliv tumor16 lagt ut. N-butyl-N-(4-hydroksybutyl) nitrosamin (BBN) brukes som kreftfremkallende for å indusere invasiv urothelial karsinom hos mus17 og tumororganoider, som viser de patologiske egenskapene til musmuskelinvasiv blæresvulster, er etablert fra BBN-indusert murine blærekreft16. Metoden for å genetisk manipulere tumororganoider er illustrert ved hjelp av lentivirus-mediert transduksjon for å utvikle et modellsystem for å studere det molekylære grunnlaget for utviklingen av blærekreft. I tillegg er en metode for transplantasjon av organoider ortotoppisk inn i en blære for å undersøke rollen til det innfødte blæremiljøet i blærekreft beskrevet.
Denne protokollen beskriver eksperimentelle prosedyrer for å kultur og opprettholde blære tumor organoider avledet fra kreftfremkallende murine blære svulster.
I denne protokollen er det flere eksperimentelle trinn der prosedyrene kanskje trenger litt feilsøking. For det første er antall tumorceller som i utgangspunktet seedes en kritisk faktor fordi lavt antall tumorceller i kultur (<2 x 104 celler) for det meste fører til celledød på grunn av mangel på interaksjoner mellom tumorceller. I motsetning, begynner med for mange celler (> 5 x 104 celler) på seeding fører til overbefolkede organoider, noe som resulterer i vanskeligheter når du håndterer kulturer med dårlig vekst av hver organoid. Det er sterkt foreslått at flere plater med forskjellige antall celler etableres i begynnelsen for å optimalisere de eksperimentelle forholdene. Identifisere riktig antall innledende tumorceller er avgjørende for å oppnå den høyeste celle levedyktighet og å etablere vellykket blære tumor organoider. Også i langsiktig kultur på over 2 uker uten å passere, slutter de fleste tumororganoider å vokse, potensielt på grunn av utilstrekkelig tilførsel av næringsstoffer i midten av organoider og uttømming av vekstfaktor i kjelleren membran matrise. Derfor er subculturing organoider i tide et kritisk skritt for å opprettholde tumor organoid kultur.
For det andre er produksjonen av høytiterlentivirale partikler avgjørende for effektiv genetisk manipulering av tumororganoider. For å feilsøke virustiterrelaterte problemer, er det sterkt foreslått at virustiters bestemmes før viral transduksjon hver gang fordi lentivirale konstruksjoner har en tendens til å produsere viruspartikler med varierende effektivitet. Hvis tumororganoider viser lav levedyktighet etter virusinfeksjon, er det sannsynlig at virustiterne potensielt er for høye. Det er sterkt foreslått å bruke lavere mengde virus i dette tilfellet. Tredje, under ortopisk transplantasjon av BBN-indusert blære tumor organoider, er det avgjørende å opprettholde integriteten til blæreveggen. I tilfelle injeksjonen når blærens lumen ved å trenge inn i blærevegglaget, bør eksperimentet avsluttes og kastes. Hvis mulig anbefales overvåking av blæretumorvekst ved hjelp av et ultralydbildesystem.
En begrensning av de nåværende teknikkene er fraværet av tumormikromiljøet eller stroma i disse organoidene. For å overvinne dette problemet, er det sterkt foreslått at ortopisk transplantasjon av tumororganoider bruker et in vivo-system for å etterligne det innfødte tumormikromiljøet. I fremtiden vil det være nødvendig å utvikle 3D in vitro organoid systemer som består av tumororganoider med andre komponenter av tumor stroma.
En av de store implikasjonene av vår teknikk er at i ortopisk transplantasjon av tumororganoider kan bare 10 blæretumororganoider indusere tumorvekst i blæren. Sammenlignet med de konvensjonelle tumortransplantasjonsforsøkene som krever 5 x 105–1 x 106 enkeltblæretumorceller, er metodene våre mye mer effektive og robuste. En annen betydelig forskjell er at organoidene kan manipuleres forskjellig ved hjelp av ulike lentivirale vektorer, for eksempel lentivirale konstruksjoner som inneholder korthårede RNA, CRISPR-Cas9-systemet eller opprinnelser av interesse. Dette ville være kraftige verktøy for å legge til dagens organoid teknologi. Samlet sett kan de eksperimentelle tilnærmingene som presenteres her lette etableringen av in vitro tumormodeller som kan forbedre vår forståelse av patogenesen av blærekreft i stedet for å bruke 2D blærekreft cellelinjer.
Denne metoden var i stand til å etablere blære tumor organoider avledet fra en kreftfremkallende murinblære svulst. Artikkelen gir en beskrivelse av lentivirus-medierte eksperimentelle prosedyrer der de genetiske modifikasjonene innføres og stabilt opprettholdes i blæretumororganoider. I tillegg er en prosedyre for ortopisk transplantasjon av tumororganoider inkludert. I kombinasjon med nåværende in vivo kreftmodeller, vil denne teknikken være et nyttig verktøy for å studere molekylært grunnlag av blære tumorigenese.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra National Research Foundation of Korea til K.S: NRF-2017R1A2B4006043, NRF-2017M3C7A1047875, NRF-2017R1A5A1015366, Creative Economy Leading Technology Development Programme (SF317001A), POSCO (2018Y) BK21 Plus Research Fellowship.
0.45 µm syringe filter (PES membrane) | Millipore | SLHP033RS | |
10 cm culture plate | Eppendorf | 0030-702-115 | |
90 mm Petri dish | SPL | 10090 | |
100 µm cell strainer | Corning | 352360 | |
15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
24-well plate | Corning | 3526 | |
29 G 1/2 insulin syringe | SHINA | B299473538 | |
3 mL syringe | Norm-ject | N7.A03 | |
50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
A8301 | Tocris | 2939 | stock concentration: 25 mM |
Absolute ethanol | Daejung | 4023-2304 | |
Absorbable suture | Henry Schein | 039010 | |
Advanced DMEM/F-12 | Thermo | 12634028 | |
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Thermo | A1049201 | |
B-27 | Gibco | 17504-044 | stock concentration: 50X |
BBN(N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine) | Tokyo Chemical Industry | B0938 | |
Blue nylon 5/0-13mm | AILEE | NB521 | |
C57BL Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | |
CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (nude mouse) | Charles River | 194 | |
Collagenase type I | Thermo | 17100017 | stock concentration: 20 mg/mL |
Collagenase type II | Thermo | 17100015 | stock concentration: 20 mg/mL |
Collagenase/dispase | Sigma | 10269638001 | stock concentration: 1 mg/mL |
Cyrovial | Corning | 430488 | |
DMEM(Dulbecco's modified minimum essential media) | Gibco | 11965-118 | |
DMSO(Dimethyl sulfoxide) | Sigma | D8418 | |
DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline) | Welgene | LB 001-02 | |
Enrofloxacin (Baytril) | Bayer Healthcare | DIN: 02169428 | |
FBS(Fetal bovine serum) | Millipore | ES009B-KC | |
Glutamax | Gibco | 35050061 | 100X |
HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Welgene | BB001-01 | |
Isoflurane | Hana Pharm Co., Ltd. | ||
Ketoprofen (Anafen) | Merial | DIN: 02150999 | |
Matrigel growth factor reduced (GFR) Growth Factor Reduced (GFR) |
Corning | 354230 | use for organoid culture in plate |
Matrigel high concentration (HC) | Corning | 354248 | use for organoid transplantation |
1.5 mL microtube | Axygen | MCT-150-C | |
LT1 transfection reagent | Mirus Bio | MIR 2300 | |
murine EGF(epidermal growth factor) | Peprotech | 315-09 | stock concentration: 100 µg/mL |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | stock concentration: 200 mM |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | stock concentration: 1M |
Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
pCMV.R 8.74 | Addgene | 22036 | Packaging plasmid |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | 100X |
pMD2.G | Addgene | 12259 | Envelope plasmid |
Polybrene(hexadim ethrine bromide) | Sigma | H9286 | stock concentration: 2 µg/mL |
pSiCoR | Addgene | 11579 | Lentiviral plasmid |
Razor blade | |||
Saline buffer | JW Pharmaceutical | ||
SW41Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
Thermolysin, Bacillus thermoproteolyticus | Millipore | 58656-2500KUCN | stock concentration: 250 KU/mL |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | |
Ultracentrifugation tube | Beckman Coulter | 331372 | |
Y-27632 dihydrochloride | Abmole | M1817 | stock concentration: 10 mM |