本研究的目的是建立一种使用转化动物模型调查心脏动力学的方法。所述的实验方法将双发射心电图与电生理学研究相结合,以评估孤立、完整的猪心脏模型中的电活动。
小型动物模型最常用于心血管研究,因为与大型动物相比,转基因物种的可得性较低,成本更低。然而,大型哺乳动物更适合于与正常心脏生理学、病理生理学和治疗剂临床前测试有关的转化研究问题。为了克服在心脏研究中采用大型动物模型相关的技术障碍,我们描述了一种在孤立的、兰根多夫(Langendorff)注入小猪心脏中测量生理参数的方法。这种方法结合了两个强大的实验工具来评估心脏的状态:电生理学(EP)研究和同时光学映射跨膜电压和细胞内钙使用参数敏感染料(RH237,Rhod2-AM)。上述方法非常适合研究心脏传导系统、运动电位形态变化、钙处理、激励收缩耦合和心脏变数或心律 失常。
心血管疾病是全世界疾病和死亡的主要原因。因此,主要的研究重点是优化可用于研究正常心脏生理学和有助于人类发病率和死亡率的基本机制的方法。基础心血管研究传统上依赖于小动物模型,包括啮齿动物和兔子1,2,3,由于转基因物种4,5,成本更低、实验占地面积更小、吞吐量更高。然而,使用猪模型有可能提供更临床相关的数据6。事实上,以前的研究已经记载了人类和猪在心脏电生理学(EP)上的相似性,包括类似的电电流7、作用电位形状8和对药理学测试9的反应。此外,猪心脏具有收缩和放松动力学,比啮齿动物或兔子10更可比人类。与一只虫模型相比,猪冠状动脉解剖学更类似于人的心脏11,12,是研究重点研究心脏发育、小儿心脏病学和/或先天性心脏缺陷的首选模型13.虽然猪和人类心脏8有区别,但这些相似性使得猪心脏成为心血管研究的宝贵模型。
自奥斯卡·兰根多夫16首次建立心脏动力学以来,心脏的逆行灌注已成为研究心脏动力学的标准方案。因此,朗根多夫灌注可用于在没有自主影响的情况下支持孤立的、完整的心脏。该模型是直接比较心脏电生理学和健康心脏与非健康心脏之间的收缩性的有用工具。由于心脏动力学在时间上和空间上都是复杂的,一个区域的轻微变化会极大地影响整个心脏作为同步17工作的能力。因此,参数敏感染料的高时空成像是监测心脏表面心脏功能的有用工具。事实上,同时对电压和钙敏荧光探头进行双成像,可以评估组织20、21、21的电活性、钙处理和激励收缩耦合。22,23,24,25,26,27,28。Langendorff 灌注和/或光学映射技术以前曾用于记录因老化或基因突变而导致的心脏性能下降,并评估药理剂或环境暴露的安全性29,30,31,32,33.
在临床环境中,侵入性心脏电生理学研究通常用于调查心脏节律障碍、识别病理和确定可能的治疗方案。同样,我们描述了一个EP协议,可用于评估坐面节点功能,测量眼间传导,并确定心肌组织的耐火性。所述EP研究可以结合光学映射或心电图34进行,以完全描述孤立心脏的心脏生理学。在所述协议中,在双发射设置中,使用电压 (RH237) 和钙 (Rhod-2AM) 染料的组合进行高时空分辨率荧光成像。此外,在正心节律下和对程序电刺激的反应下,对心脏电生理学参数进行了监测。
虽然心血管研究模型从细胞制剂到体内制剂,但临床相关性和实验效用之间有着内在的权衡。在这个光谱上,孤立的兰根多夫心脏仍然是研究心脏生理学的有益折衷方案。与单细胞或组织单层相比,整个心脏模型代表了更高的功能和结构整合水平,但也避免了与体内模型相关的混淆复杂性。在双光学映射实验中,一个主要优点是可以观察到分离心脏的表观表面,并且可以利用跨膜电位和钙处理的荧光成像来监测心脏生理学34。
与大型动物相比,啮齿类模型最常用于隔离心脏制剂,部分原因在于所有相关元件的放大相关成本(例如,溶液体积、灌注回路、染料数量和机械不耦合器)伴随着更大的动物10、36、49的更大不稳定性和心律失常倾向。使用猪心脏的一个优点是,它们在结构、大小和收缩速率上与人的心脏非常相似,因此可以更准确地模拟冠状血流和心脏输出等血液动力学参数。同样,人类和猪有类似的钙处理,心电图间隔37,和行动潜力形态,包括它代表12,50,51的基础通道, 52.该协议详细介绍了创建可重现的大型动物模型以全面描述心肌功能的步骤。与已建立的电生理协议结合使用的同膜电压 (RH237) 和细胞内钙 (Rhod2) 的同步成像,为查明导致心脏改变的机制提供了机会功能。所述方法可用于临床前安全测试、毒理学筛查和遗传或其他疾病病理学调查。此外,根据具体的研究重点53、54、55,所述方法可以修改和调整,以便与其他心脏模型(如,人)一起使用。
从较小的啮齿动物模型过渡到更大的猪模型,用于隔离的整心准备时,需要牢记一些关键的修改。在准备和设置过程中,我们建议在渗透液中加入白蛋白,以保持粘液压力,减少水肿(如果需要,加上消泡) 56、57、58、59 。此外,含有白蛋白的渗透剂也有助于代谢研究,还需要补充脂肪酸的介质60,61。与啮齿动物的心脏不同,较大的猪心不需要被淹没在温暖的介质中,因为其表面体积比较小,并且流经冠状血管的加热介质体积增加,从而更好地保持温度。如前所述,我们在右心室和左右心室的表观表面放置了温度探头,在整个研究中,我们只观察到所有三个位置的1~2°C的轻微温度波动。重要的是,这种更快的流速也会增加气泡和潜在栓塞的可能性。为了规避此问题,我们建议使用带大孔管的气泡陷阱,直直通向主动脉管。类似地,我们发现,让两个人协同工作,将主塔放在一个更大(更重)的心脏上是很有用的;一个人用坚固的四分位保持主塔打开,另一个人用脐带将主塔固定到主塔。在所述方法中,我们发现,心痛和除颤灌注对心脏恢复至关重要,这与啮齿动物心脏制剂相反。根据我们的经验,只有少数被切除的心脏在没有心电图的情况下恢复了正常的坐着的坐交运动。
为了改善光学成像端点,挂心脏准备限制了眩光的影响,可能发生与淹没的心脏。此外,挂心脏还避免任何压缩或损害冠状血管在心脏后部,可能发生时,水平放下心脏垂直成像。我们还发现,在气泡陷阱(靠近主动脉管)后加载荧光染料可以大大改善组织染色和光信号。最后,为了改善心脏电生理学端点,使用更大的同轴刺激电极有助于成功的心房起搏。尽管我们描述了使用心电图来识别各种 EP 参数的捕获和捕获损失,但也可以使用心内导管或双极记录电极。
我们的研究重点是在孤立的、完整的猪心脏模型中开发双光学映射和心脏电生理学评估方法。由于与青少年心脏的相似性,猪心仍然是研究儿科心脏病学或先天性心脏缺陷的热门模式。重要的是,所述方法可以适应使用大尺寸的成人心脏和/或不同的兴趣物种。事实上,其他实验室可能会发现,使用人或人类心脏(无论是捐赠者或疾病)更适用于他们的特定研究重点53,54,55。这项研究的另一个潜在限制是使用机械不耦合器来减少成像过程中的运动伪影。Blebbistatin因其对心电图参数、活化和耐火期41、62、63的影响最小,已成为心脏成像应用中的首选。BDM 是一种较便宜的选择,在需要更大量的渗透和机械非耦合剂的大型动物研究中尤为重要,但已知对钾和钙电流的影响更大,可以改变作用电位形态学 64,65,66,67。如果使用BDM,请注意,APD缩短会增加心脏易感休克引起的阿瑞特米亚68。相反,使用比比沙丁的主要限制是它的光敏性和光毒性,虽然替代配方已经减少了这些影响69,70,71。最后,所述方法利用单一相机系统进行双光学映射实验,但需要注意的是,研究的重点是心室颤动和/或跟踪心室表面的电波需要修改这种方法,以包括三维全景成像,如其他人描述15,19,72,73,74,75.
The authors have nothing to disclose.
作者感谢马修·凯博士的有益实验指导,以及马内尔·拉马丹和穆海明·乔杜里为技术援助。这项工作得到了国家卫生研究院(R01HL139472至NGP、R01 HL139712至NI)、儿童研究所、国家儿童心脏研究所和谢赫扎耶德儿科外科创新研究所的支持。
(-)-Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560-5MG | Mechanical Uncoupler |
2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753-100G | Mechanical Uncoupler |
Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9418 | |
Analog signal interface | emka Technologies | itf16USB | |
Antifoam | Sigma-Aldrich | A5758-250ML | |
Antifoam Y-30 Emulsion | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A5758 | |
Aortic cannula, 5/16” | Cole-Parmer | 45509-60 | |
Bubble trap | Sigma-Aldrich | CLS430641U-100EA | |
CaCl2 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | C77-500 | |
Camera, sCMOS | Andor Technology | Zyla 4.2 PLUS | |
Coaxial stimulation electrode (atria) | Harvard Apparatus | 73-0219 | |
Defibrillator | Zoll | M Series | |
Dichroic mirror | Chroma Technology | T660lpxrxt-UF2 | |
Differential amplifier | Warner Instruments | DP-304A | |
Emission filter, calcium | Chroma Technology | ET585/40m | |
Emission filter, voltage | Chroma Technology | ET710lp | |
EP stimulator (Bloom) | Fisher Medical | DTU-215B | |
Excitation filter | Chroma Technology | CT510/60bp | |
Excitation lights | Thorlabs | SOLIS-525C | |
Filter | McMaster-Carr | 8147K52 | |
Filter cartridge, polypropylene | Pentair | PD-5-934 | |
Filter housing | McMaster-Carr | 9979T21 | |
Flow transducer | Transonic | ME6PXN | |
Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 158968 | |
Heating coil | Radnoti | 158821 | |
Hemofilter | Hemocor | HPH 400 | |
Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 501326 | |
Image Splitter | Cairn Research | OptoSplit II | |
KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P3911 | |
KH2PO4 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | 423-316 | |
Large-bore tubing, I.D. 3/8” | Fisher Scientific | 14-169-7H | |
Lens 50 mm, 0.95 f-stop | Navitar | DO-5095 | |
Metamorph | Molecular Devices | Image Alignment | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M-7506 | |
Mucasol detergent | Sigma-Aldrich | Z637181-2L | |
Na Pyruvate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P2256 | |
NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S-3014 | |
NaHCO3 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S-233 | |
Needle Electrodes 29 gauge, 2 mm | AD Instruments Inc. | MLA1204 | |
Noise eliminator | Quest Scientific | Humbug | |
Perfusion pump | PolyStan | A/S 1481 | |
Pressure transducer | World Precision Instruments | BLPR2 | |
Reservoir, 2 liter | Cole-Parmer | UX-34541-07 | |
RH237 | AAT Bioquest Inc. | 21480 | |
Rhod2-AM | AAT Bioquest Inc. | 21062 | |
Stimulation electrode (ventricle) | Harvard Apparatus | 73-0160 | |
Surgical Suture | McKesson Medical-Surgical | 890186 | |
Transducer amplifier | World Precision Instruments | TBM4M | |
Tubing flow console | Transonic | TS410 | |
Umbilical tape | Jorvet | J0025UA | |
Water bath/circulator | VWR | 89400-970 | |
Surgical Tools | |||
Bandage shears | Harvard Apparatus | 72-8448 | Lister Bandage Scissors, Angled, Blunt/Blunt, 42.0mm blade length, 17.0 cm |
Electrocautery | Dalwha Corp. Ltd. | BA2ALD001 | Model: 200 Basic |
Hemostat | Roboz | RS-7476 | St Vincent Tube Occluding Forceps |
Hemostatic forceps | Harvard Apparatus | 72-8960 | Hartmann Hemostatic Forceps, Curved, Serrated 2.2 mm tip width, 9.5 cm |
Hemostats | Harvard Apparatus | 72-8985 | Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Curved, Serrated, 2mm tip 14cm |
Mayo scissors | WPI | 501749 | 14.5 cm, Straight |
Metzenbaum scissors | WPI | 501747 | 11.5 cm, Straight |
Mosquito forceps | Harvard Apparatus | 72-8980 | Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Straight, Smooth, 2mm tip width 12cm |
Needle holder | Harvard Apparatus | 72-8828 | Webster Needle Holders, Straight, Smooth,13.0 cm overall length |
Pediatric cross clamp | Roboz | RS-7660 | Cooley-Derra Clamp 6.25" 5mm Calibrations |
Right angle forceps | WPI | 501240 | Baby Mixter Hemostatic Forceps, 14cm, Right Angle |
Scalpel | Ted Pella | 549-4 | Scalpel Handle No. 4, 13.7cm Stainless Steel and 10 No. 22 Blades |
scissors | Harvard Apparatus | 72-8380 | Operating Scissors, Straight, Blunt/Blunt, 42mm blade,12cm |
Straight Serrated forceps | WPI | 500363 | Dressing Forceps 15.5cm |
Towel clamp | WPI | 501700 | Backhaus Towel Clamp, 13cm, Curved, Locking handle, SS |
Weitlaner retractor | WPI | 501314 | Weitlaner Retractor, Self-Retaining, 10.2cm, 2×3 Sharp Prongs |
Disposables | |||
3-0 prolene suture | Various vendors | Various vendors | |
Vessel loop | Aspen surgical | 011001PBX | Sterion® Vessel Loop, 0.8 x 406mm |
Cardioplegia (Plegisol) | Pfizer | 00409-7969-05 | Plegisol; St Thomas crystalloid cardioplegia solution 20ml/kg |
Heparin | Various vendors | Various vendors | 300 U/kg |
Syringe and Needle | Various vendors | Various vendors | 60mL & 18G respectively |
Umbilical tape | Ethicon | U12T |