Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Optocardiografie en elektrofysiologie studies van ex vivo Langendorff-perfused Hearts

Published: November 7, 2019 doi: 10.3791/60472
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3, 4, 1,2,3, 4, 1,2,5
1Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation, Children's National Hospital, 2Children's National Heart Institute, Children's National Hospital, 3Center for Neuroscience Research, Children's National Hospital, 4Department of Biomedical Engineering, School of Engineering, University of Alabama at Birmingham, 5Department of Pediatrics, Department of Pharmacology & Physiology, School of Medicine and Health Sciences, George Washington University

Summary

Het doel van deze studie was het vaststellen van een methode voor het onderzoeken van de cardiale dynamiek met behulp van een translationeel diermodel. De beschreven experimentele aanpak omvat Dual-emission optocardiografie in combinatie met een elektrofysiologisch onderzoek om elektrische activiteit te beoordelen in een geïsoleerd, intact varkens hart model.

Abstract

Kleine diermodellen worden meestal gebruikt in cardiovasculaire onderzoek als gevolg van de beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde soorten en lagere kosten in vergelijking met grotere dieren. Toch zijn grotere zoogdieren beter geschikt voor translationele onderzoeksvragen met betrekking tot normale cardiale fysiologie, pathofysiologie en preklinisch onderzoek van therapeutische middelen. Om de technische barrières die gepaard gaan met het gebruik van een groter diermodel in het hart onderzoek te overwinnen, beschrijven we een benadering om fysiologische parameters te meten in een geïsoleerd, Langendorff-perfused Knorretje. Deze aanpak combineert twee krachtige experimentele instrumenten om de toestand van het hart te evalueren: elektrofysiologie (EP) studie en gelijktijdige optische mapping van transmembraan spanning en intracellulaire calcium met behulp van parameter gevoelige kleurstoffen (RH237, Rhod2-AM). De beschreven methodologieën zijn zeer geschikt voor translationele studies die het cardiale geleidingssysteem onderzoeken, veranderingen in de actiepotentiaal morfologie, behandeling van calcium, excitatie-contractie koppeling en de incidentie van cardiale plaatsvervankers of hartritmestoornissen.

Introduction

Hart-en vaatziekten is een leidende oorzaak van ziekte en dood wereldwijd. Als zodanig is een primair onderzoek gericht op het optimaliseren van methodologieën die kunnen worden gebruikt om normale cardiale fysiologie en onderliggende mechanismen te bestuderen die kunnen bijdragen tot morbiditeit en sterfte bij de mens. Fundamenteel cardiovasculair onderzoek heeft zich traditioneel gebaseerd op kleine diermodellen, met inbegrip van knaagdieren en konijnen1,2,3, als gevolg van de beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde soorten4,5, lagere kosten, kleinere experimentele voetafdruk en hogere doorvoer. Het gebruik van een Pig-model heeft echter het potentieel om meer klinisch relevante gegevens te verstrekken6. Inderdaad, eerdere studies hebben gedocumenteerde gelijkenissen in cardiale elektrofysiologie (EP) tussen mensen en varkens, met inbegrip van soortgelijke ionen stromen7, actie potentiële vorm8, en reacties op farmacologische testen9. Bovendien heeft het varkens hart contractiele en ontspannings kinetiek die meer vergelijkbaar zijn met die van de mens dan knaagdieren of konijnen10. In vergelijking met een Canine model, de varkens coronaire anatomie lijkt meer op een menselijk hart11,12 en is het model van de keuze voor studies gericht op hart ontwikkeling, pediatrische cardiologie en/of aangeboren hartdefecten 13. Hoewel er verschillen zijn tussen het varken en het menselijk hart8, maken deze gelijkenissen het varkens hart tot een waardevol model voor cardiovasculair onderzoek14.

Retrograde perfusie van het hart is uitgegroeid tot een standaardprotocol voor het bestuderen van cardiale Dynamics ex vivo15 sinds de eerste oprichting door Oskar Langendorff16. Daarom kan Langendorff-Perfusion worden gebruikt om een geïsoleerd, intact hart te ondersteunen bij afwezigheid van autonome invloeden. Dit model is een handig hulpmiddel voor het direct vergelijken van cardiale elektrofysiologie en contractiliteit tussen gezonde en niet-gezonde harten. Aangezien cardiale dynamiek zowel tijdelijk als ruimtelijk complex is, kan een lichte verandering in één regio het vermogen van het hele hart om te werken als een syncytium17drastisch beïnvloeden. Daarom is een hoge spatiotemporele beeldvorming van parameter gevoelige kleurstoffen een handig hulpmiddel voor het bewaken van de hartfunctie over het oppervlak van het hart18,19. Inderdaad, gelijktijdige dubbele beeldvorming van spanning en calcium-gevoelige fluorescentie sondes maakt het mogelijk voor de beoordeling van elektrische activiteit, behandeling van calcium en excitatie-contractie koppeling op het weefselniveau20,21, 22,23,24,25,26,27,28. Langendorff-perfusie en/of optische mapping technieken zijn eerder gebruikt om de afname van de cardiale prestaties als gevolg van veroudering of genetische mutaties te documenteren, en om de veiligheid van farmacologische agentia of milieu blootstellingen te beoordelen29 ,30,31,32,33.

In de klinische setting wordt een invasieve cardiale elektrofysiologie-studie vaak gebruikt om hartritmestoornissen te onderzoeken, pathologieën te identificeren en mogelijke behandelingsopties te lokaliseren. Evenzo beschrijven we een EP-protocol dat kan worden gebruikt om de sinus knooppunt functie te beoordelen, Atrioventriculaire geleiding te meten en de refractoriteit van myocard weefsel te identificeren. De beschreven EP-studie kan worden uitgevoerd in combinatie met optische mapping, of optocardiografie34, om de cardiale fysiologie in geïsoleerde harten volledig te karakteriseren. In het beschreven protocol werd een hoge spatiotemporele resolutie fluorescentie Imaging uitgevoerd met een combinatie van voltage (RH237) en calcium (Rhod-2AM) kleurstoffen in een dubbele emissie-opstelling. Daarnaast werden cardiale elektrofysiologie parameters bewaakt onder zowel sinusritme als respons op geprogrammeerde elektrische stimulatie.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (achtste editie). Alle methoden en protocollen die in deze onderzoeken worden gebruikt, zijn goedgekeurd door het Comité voor het gebruik van het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks protocol in het Children's National Hospital volgens de richtlijnen voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren die door NIH zijn gepubliceerd. Alle dieren die in deze studie worden gebruikt, kregen humane zorg in overeenstemming met de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.

1. voorbereiding

  1. Bereid 6 L gemodificeerde Krebs-Henseleit oplossing16 (mM: 118,0 nacl, 3,3 kcl, 1,2 MgSO4, 24,0 NAHCO3, 1,2 KH2po4, 10,0 glucose, 2,0 natrium Pyruvate, 2% albumine, 2,0 CACL2). Voeg CaCl2 toe op de dag van het experiment, aangezien calciumchloride na verloop van tijd in aanwezigheid van fosfaten terminaal zal neerslaan uit de oplossing als calciumfosfaat.
  2. Pas de pH op 7,4 na steriele filtering (poriegrootte: 0,22 μm). Controleer de oplossing osmolaliteit om een bereik van 275 − 310 mosm/kg te garanderen. Koel 1 L op ijs voor gebruik onmiddellijk nadat het hart is uitgesneden. Warm 3 L in een waterbad tot ongeveer 37 °c vóór het borrelen met Manager (95% O2,5% co2).
    Opmerking: Opwarming minimaliseert bubbels en potentiële embolie, omdat koude vloeistof een toegenomen capaciteit van gas heeft om op te lossen; Daarom, als de gemodificeerde Krebs-Henseleit media passeert het perfusie systeem en warms, het gas zal worden vrijgegeven als bubbels.
  3. Bereid 2 L cardioplegia (gemodificeerde del Nido cardioplegia oplossing, tabel 1). Vries genoeg cardioplegia in een IJsblokjesbakje om een bekerglas van 500 mL te vullen.
  4. Schakel de circulerende waterbaden in op 42 °C. Schakel de pompen in om de perfusaat in een gesloten Hydronic-verwarmings loop te laten circuleren (voor een volledige lijst van materialen, Zie tabel met materialen en Figuur 1).
    Opmerking: Een verwarmd stromend waterbad wordt gebruikt om de met watermantel buizen en warmtewisselaars te verwarmen.
  5. Reinig slang circuits en kamers door 2 L van een 1%-oplossing van universeel reinigingsmiddel in water door het systeem te draaien. Spoel alle slangen circuits en kamers van het Langendorff-systeem af met > 4 L gezuiverd water. Voer pompen uit totdat al het water uit het systeem is verwijderd.
  6. Voeg een synthetisch membraanfilter toe in lijn met de perfusie pompen (polypropyleen filter, poriegrootte > 5 μm). Gas een microfiber oxygenator (hemofilter) met 95% O2 en 5% Co2 bij 80 kPa.
    Opmerking: Bij het gebruik van albumine, is er vaak schuimen geassocieerd met oxygenatie en/of de pomp activiteit door het slangen circuit. Een anti schuimstof (antifoam Y30 emulsie) kan periodiek worden toegevoegd (~ elke 30 min) om het te doven zoals het zich voordoet.
  7. Controleer een tweepunts kalibratie (0 en 60 mmHg) voor de druksensor die zich boven de aorta of in de bubbel vanger bevindt; Kalibreer indien nodig.
  8. Giet de media onmiddellijk vóór de excisie in het Langendorff loop perfusie systeem. Zorg ervoor dat perfusaat door microfiber oxygeneratoren (hemofilters) wordt geverteerd met zuurstofhoudende perfusaat, die vervolgens door warmtewisselaars stroomt om een media-perfusaattemperatuur van 37 °c in de aorta te behouden.
  9. Stel het circulerende waterbad in op een paar graden hoger dan 37 °C, zoals 42 °C, om rekening te kunnen maken met warmteverlies tijdens de uitwisseling en in het hele systeem. Bewaak de circulerende perfusaat temperatuur met thermokoppels.

2. hart excisie en Langendorff-perfusie

  1. Sedate het varken met een intramusculaire (I.M.) injectie van ketamine (20 mg/kg) en xylazine (2 mg/kg) en intuberen met een endotracheale buis. Voor inductie, een intraveneuze (I.V.) bolusinjectie van fentanyl (50 μg/kg) en Rocuronium (1 mg/kg) toedienen. Onderhoud anesthesie met geïnhaleerde Isofluraan (0,5 − 3%), fentanyl (10 − 25 μg/kg) en Pancuronium (1 mg/kg).
    Opmerking: Voor deze proof-of-principe studie werden juveniele Yorkshire Pigs (14 − 42 dagen oud, n = 18) gebruikt die varieerden van 2,5 − 10,5 kg lichaamsgewicht en 18 − 137 g hart gewicht (Figuur 2). Als een extra injectie voor inductie nodig is, kan ketamine (10 mg/kg) I.M. worden geïnjecteerd
  2. Zodra het dier is volledig verdoeflijk en niet-responsief, voer een sternotomie om de stijgende aorta en rechter Atrium bloot.
    1. Maak met behulp van een scalpel een middenlijn incisie vanaf de bovenkant van het borstbeen bij de thoracische inlaat, tot aan het xiphoïde proces. Met een cauterie (of een schaar), ontleden het onderliggende vet en de spieren totdat het borstbeen zichtbaar is.
    2. Snijd uit het xifoïde proces de borstbeen middellijn omhoog door de manubrium met ofwel een chirurgische botschaar of een been zaag. Voeg OPROLMECHANISMEN in de incisie om het hart bloot te leggen.
  3. Lever een bolus dosis van heparine (300 U/kg) naar de juiste atria, met behulp van een 18 G naald en spuit, om de klonters te minimaliseren bij orgaan excisie. Plaats absorberende pads in de borstholte en ijs rond het hart.
  4. Met een schaar, snijd voorzichtig door het pericardium, Isoleer de aorta door botte dissectie van het omringende bindweefsel en klem de aorta net onder de eerste arteriële tak op de aortaboog. Gebruik een 50 mL spuit met een 18 G naald, Injecteer ijskoude cardioplegia (20 mL/kg) via de bovenkant van de stijgende aorta.
  5. Snijd door de vaten die naar het hart leiden en verwijder het hart met de stijgende aorta intact en dompel het uitgestanste hart in ijskoude cardioplegia.
  6. Pak de wanden van de aorta met een paar hemostatica en glijd het op een geribbelde canule bevestigd aan buizen die leiden tot 1 L ijskoude cardioplegia media die boven het hart zijn opgehangen (~ 95 cm om ~ 70 mm Hg te leveren). Laat vloeistof invoeren en vul de aorta totdat deze overstroomt om te voorkomen dat elke bubbel de vasculatuur binnenkomt.
    Opmerking: Gebruik van een mechanische ontkoppelaar (2, 3-butanedione monoxime [BDM] of blebbistatine) zal de coronaire perfusie snelheid verminderen als de zuurstofbehoefte van het weefsel afneemt.
  7. Beveilig de aorta aan de canule met behulp van navelstreng en Veranker het door de hemostatica te binden om het gewicht van het hart te dragen, dat nu aan de canule hangt (figuur 1c). Laat de koude media het hart met een constante druk van 70 mmHg via de zwaartekracht parfuseren. Houd het hart ondergedompeld in de koude cardioplegia tot het klaar is om overgebracht te worden naar het gewarmde (37 °C) Langendorff-perfusie systeem (< 10 min).
    Opmerking: De aorta op kleinere harten (< 50 g, tot 2 weken oud varken) zal het gewicht van het hart dragen, maar grotere harten dreigen te glijden van de canule. Tijdens de initiële cannulatie en bij het verplaatsen naar het verwarmde systeem, voorkomen dat lucht in de aorta in te voeren, die kan leiden tot coronaire emboli. Gebruik grote boring tubing (> 3/8 "inwendige diameter) waardoor bellen sneller stijgen dan de oplossing invoeren van de aorta.
  8. Breng het hart over naar het Langendorff-systeem (37 °C) zonder lucht in de canule te introduceren. Laat het normale sinusritme de vasculatuur van alle overgebleven bloed en cardioplegia spoelen.
    Opmerking: In het beschreven onderzoek werd een gemiddelde initiële stroomsnelheid van 184 ± 17 mL/min waargenomen in geïsoleerde juveniele varkens harten. De stroomsnelheid daalde tot 70 ± 7,5 mL/min (gemiddelde ± SEM) na perfusing met verwarmde media met een mechanische ontkoppelaar (20 mM BDM). Het hartweefsel niet onderdompelen, omdat het kan afbreuk doen aan cardiale beeldvorming. Weefsel temperatuur wordt gehandhaafd door coronaire stroming in het varken hart als gevolg van het grotere volume en kleinere oppervlakte, in vergelijking met knaagdieren. Onder volle stroming varieerden de temperaturen van het epicardium en membraan van respectievelijk 35 °c tot 37 °c.
    Let op: Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, inclusief oogslijtage bij het werken met mechanische ontkoppelende koppelingen. Het hart kan media snel en onverwacht uitwerpen.
  9. Defibrilleren het hart in het geval van schok bare aritmines (ventriculaire tachycardie, ventrikelfibrillatie) door het plaatsen van externe peddels op de Apex en de basis van het hart en het leveren van een enkele schok bij 5 J, verhogen in stappen van 5 J (of als selecteerbaar door de Defibrillator) tot 50 J, cardioversion of onschokbaar ritme. Herhaal schokken bij 50 J indien nodig.
    Opmerking: In de gepresenteerde studie, 89% van de preparaten vereist defibrillatie. Na een equilibratie (~ 10 min) werd een gemiddelde hartslag van 70 ± 4,5 BPM (gemiddelde ± SEM) waargenomen bij juveniele biglet's Hearts (Figuur 2).
  10. Spoel het hart met ten minste 1 L gemodificeerde Krebs-Henseleit media, zonder recirculeren, om eventuele resterende bloed en cardioplegia verwijderen. Zodra de media helder door het hart loopt, sluit u de circulerende lus om perfusaat te recirculeren.

3. elektrofysiologie studie

  1. Om een standaard lead II elektrocardiogram (ECG) in de loop van de studie op te nemen, bevestig een 29 G naald elektrode aan het ventriculaire epicardium bij de Apex, met een andere elektrode in het rechter Atrium. Verbind de positieve en negatieve ingangen van een differentiële bioversterker met respectievelijk de Apex en het rechter Atrium.
  2. Bevestig een bipolaire prikkel elektrode op de rechter atria, en een tweede bipolaire stimulus elektrode aan de laterale linker ventrikel voor pacing doeleinden.
  3. Pace het hart met behulp van een elektrofysiologie stimulator, met de initiële stroom ingesteld op tweemaal de diastolische drempel (1 − 2 Ma) en een 1 MS puls breedte35,36.
    Opmerking: Als de stimulatie een reactie niet ontlokken, kan de pulsbreedte worden verhoogd tot 2 MS. meer stroom (~ 10x) is nodig met grote coaxiale elektroden (bipolaire stimulatie).
  4. Identificeer de pacing drempel door het toepassen van een reeks stimulus impulsen (1 − 2 mA, 1 MS pulsbreedte) op gedefinieerde pacing Cycle lengtes (PCL) om een consistente stimulus respons te garanderen.
    Opmerking: Zodra de intrinsieke snelheid is vastgesteld, kan de initiële impuls trein beginnen bij een iets kortere PCL.
  5. Extrastimulus pacing uitvoeren met behulp van een S1 − S1 of S1 − S2 pacing Train, in de laatste een trein van 6 − 8 impulsen (S1) werd gevolgd door een enkele impuls (S2). Verlaag de S2 PCL stapsgewijs met 10 MS (d.w.z. 200 MS, 190 MS, 180 MS, enz.) totdat deze niet wordt vastgelegd. Stap omhoog naar de voorlaatste PCL (d.w.z. 190 MS) en verlaag de intervallen van 1 MS om de meest precieze PCL te vinden vóór het verlies van de opname (d.w.z. 184 MS).
    Opmerking:     dezelfde stimulatie parameters worden gebruikt voor zowel S1 als S2 (1 − 2 Ma, 1 MS pulsbreedte). Zie afbeelding 3 voor representatieve voorbeelden, of eerder gepubliceerde waarden op varkens hart elektrofysiologie metingen37.
    1. Om de ventriculaire effectieve refractaire periode (VERP) vast te stellen, gebruikt u de stimulus-elektrode op de laterale linker ventrikel om het kortste interval van S1 − S2 te identificeren waarbij de S2 (voortijdige Beat) ventriculaire depolarisatie initieert.
      Opmerking: De vuurvaste periode is de kortste haalbare S1 − S2 koppelings interval.
    2. Om de Wenckebach-cyclus lengte (WBCL) te definiëren, gebruikt u de stimulus-elektrode op het rechter Atrium om het kortste S1 − S1-interval te vinden waarbij 1:1 Atrioventriculaire geleiding via het normale geleidings traject voortgaat.
      Opmerking: Niet te doen vertegenwoordigt 2ND graden hartblok.
    3. Als u de hersteltijd van de sinusknoop (SNRT) wilt definiëren, gebruikt u de stimulus-elektrode op het rechter Atrium om een pacing-trein toe te passen (S1 − S1) en meet u de tijdvertraging tussen de laatste impuls in de pacing-trein en het herstel van spontane sinoatriale node-gemedieerde activiteit.
    4. Om Atrioventriculaire node effectieve refractaire periode (AVNERP) vast te stellen, gebruikt u de stimulus-elektrode op het rechter Atrium om het kortste koppelings interval van S1 − S2 te vinden waarbij de premature atriale stimulatie wordt gevolgd door een zijn bundel potentiaal die een QRS complex, wat een ventriculaire depolarisatie betekent.

4. optische mapping van transmembraan spanning en intracellulair calcium

Opmerking: Een mechanische ontkoppelaar moet worden gebruikt om bewegings artefacten te minimaliseren tijdens optische mapping en om hypoxie3,38,39,40te vermijden. (-/-) Blebbistatin (5 μM circulerende concentratie) kan langzaam worden toegevoegd als een bolus dosis van 0,5 mM in 5 mL perfusaat (100x van de eindconcentratie)41. Als alternatief kan BDM in eerste instantie in de perfusaat media worden opgenomen bij een circulerende concentratie van 20 mm.

  1. Bereid de spannings kleurstof door het oplossen van 5 mg RH237 in 4 mL watervrije DMSO. Verdun de kleurstof hoeveelheid met maximaal 5 mL media en Vortex. Voeg langzaam RH237 (62,1 μg per 500 mL perfusaat) proximale toe aan de aorta canule.
    Opmerking: Het myocard weefsel kan, indien nodig, opnieuw worden gekleurd met RH237 gedurende de duur van het experiment.
  2. Bereid de calcium kleurstof door het oplossen van 1 mg Rhod2-AM in 1 mL watervrije DMSO. Meng de kleurstof met 50 μL pluronic zuur, plaats in een 37 °C sonicerend bad tot 10 min, en Verdun vervolgens met maximaal 5 mL media. Voeg langzaam de calcium kleurstof (50 μg per 500 mL perfusaat) proximale toe aan de aorta canule.
    Opmerking: Om uniforme kleurstof kleuring te garanderen, moeten kleurstoffen langzaam worden toegevoegd (> 30 s). Rhod-2AM neemt tot 10 minuten om piek fluorescentie te bereiken, terwijl RH237 het hart binnen een 1 − 2 min. met behulp van de beschreven kleurstof laden, signaal ruis verhouding (SRV) bereiken van ~ 42 − 86 en ~ 35 − 69 voor respectievelijk voltage en calcium, kan worden verwacht. SNR-waarden kunnen worden berekend als SNR = (piek-naar-piek tellingen)/(standaarddeviatie tijdens diastolische interval)42.
  3. Positioneer de beeldvormings hardware (camera, beeld splitter, lens) zoals weergegeven in Figuur 1om te focussen op een passend gezichtsveld.
    Opmerking: De splitter is geconfigureerd met een dichroïde spiegel (660 + nm) die RH237 passeert en Rhod2 emissiespectra weergeeft. Emissie filters met hoge transmissie worden gebruikt voor de RH237 (710 nm long pass) en Rhod2 (585 ± 40 nm) licht (long pass ET710, Zie tabel met materialen). Een Wide-pupil 50 mm/F 0,95 l lens is bevestigd aan de voorkant van de afbeelding splitter. Deze configuratie resulteert in een adequate scheiding van het emissie licht, zoals eerder gevalideerd43,44.
  4. Verbind de camera met een werkstation en verkrijg afbeeldingen met behulp van geselecteerde software, met een belichtingstijd van 0,5 − 2 MS. Voer de uitlijning van de afbeelding uit met behulp van software die de gewenste gebieden kan splitsen, bedekken en een grijs-schaal aftrek of pseudo-kleur weergeven Naast het markeren van onjuiste uitlijning (Zie tabel met materialen voor software optie).
  5. Schakel het kamer licht uit om fluorescentie interferentie van omgevingsverlichting te minimaliseren. Test de ledlampjes (525 nm, 1,4 mW/mm2) vóór de start van de beeldvorming om een uniforme en maximale epicardial-verlichting te garanderen, zoals bepaald door de diepte van de sensor.
    Opmerking: Elk licht wordt geleid door een excitatie filter (535 ± 25 nm). LED-lampjes kunnen handmatig worden geactiveerd voordat ze worden gefilmd om de lineariteit van het signaal te maximaliseren. Uitgezonden fluorescentie van het epicardium wordt door de beeld splitter en emissie filters doorgegeven. Gesplitste afbeeldingen worden geprojecteerd op een hoge-snelheidssensor. Het gezichtsveld van is ongeveer 12 cm x 10 cm, of 5,9 cm x 4,7 cm voor elke gesplitste afbeelding, afhankelijk van de keuze van de lens en de afstand van het hart.
  6. Voor optische mapping-onderzoeken wordt het myocardium tijdens het sinusritme, ventrikelfibrillatie (Figuur 4) of dynamische pacing (S1 − S1, 1 − 2 Ma, 1 MS pulsbreedte) via een stimulatie elektrode op de linker ventrikel geplaatst (Figuur 5). Begin met een pacing cyclus lengte van 350 MS, en verlaagt met 10 − 50 MS om restitutie curven te genereren (figuur 5e)35,36.

5. opschonen

  1. Verwijder het hart uit het systeem en afvoer alle perfusate. Spoel de systeem slang en de kamers af met gezuiverd water.
  2. Voor routinematig onderhoud, indien nodig, het systeem periodiek met reinigingsmiddel of een verdunde waterstofperoxide oplossing spoelen.

6. gegevensverwerking

  1. Bevestig de optische signaalkwaliteit gedurende de hele studie door een videobestand te openen, een interessegebied te selecteren en de gemiddelde fluorescentie na verloop van tijd te plotten met behulp van een geschikt softwarepakket of een aangepast algoritme.
  2. Analyseer Imaging gegevens zoals eerder beschreven23,33,43,45,46, om actiepotentiaal en calcium tijdelijke temporele parameters, inclusief activeringstijd, te kwantificeren, voltage-calcium koppelings tijd (verschil tussen VM en ca activeringstijden), en repolarisatie duur metingen.
    1. Breng drempelmethode aan om fluorescerende epicardial pixels te isoleren en lawaaierige achtergrondgegevens te negeren.
      Opmerking: Thresholding zal de analyse van grote Video's vereenvoudigen en versnellen.
    2. Filter optische signalen ruimtelijk op een epicarbel oppervlak met kernelgrootten variërend van 3 mm x 3 mm tot 5 mm x 5 mm, zoals te zien in Figuur 4 en Figuur 5.
      Opmerking: De laatste zal de SNR verbeteren zonder actiepotentiaal te verstoren, calcium voorbijgaande morfologie, of algemene contour van de Golf fronten19,47. Dit kan onnodig zijn bij gebruik van een sensor met grote pixels of als binning tijdens de overname.
    3. Tijdelijke filter signalen met een digitale lowpass filter (bijv. 5e-orde Butterworth) met een afsluit frequentie tussen 100 en 75 Hz om onbeduidende signaal inhoud45te elimineren.
      Opmerking: Zie afbeelding 5c voor een voorbeeld van de representatieve verwerkte sporen.
    4. Pas drift verwijdering en aftrekken toe via het Nth-order polynoom, om de effecten van fotobleaching, beweging of andere belangrijke variatie bronnen te minimaliseren.
    5. Na het verwerken en normaliseren van optische gegevens over een hele video, bereken je actiepotentiaal en calcium voorbijgaande parameters van belang. Bepaal de activeringstijd, gedefinieerd als de tijd van het maximale derivaat tijdens depolarisatie, en piek fluorescentie om repolarisatie percentage tijden en punten te berekenen (actiepotentiaal duur [APD] en [CA2 +] i duur [CaD], zie Figuur 5).
    6. Nadat tijdelijke parameters zijn berekend, genereren van isochronal kaarten om aspecten van een enkele actiepotentiaal of calcium voorbijgaande aard over het gehele beeld-epicardial oppervlak met behulp van aangepaste algoritmen23,33, 43,45,46.
      Opmerking: Zie afbeelding 5d voor een voorbeeld.

Representative Results

Figuur 1a toont een diagram van het geïsoleerde hart perfusie systeem, dat het slangen circuit, de pomp, het filter, de oxygenator, de reservoirs en de verwarmingselementen omvat. Plaatsing van de ECG (lead II configuratie) en pacing elektroden wordt weergegeven in afbeelding 1B, en de Imaging Setup wordt afgebeeld in afbeelding 1c. De optische componenten en licht paden worden schematisch weergegeven in figuur 1d.

Experimentele studies werden uitgevoerd op intact, hele hart geïsoleerd van juveniele Yorkshire varkens (14 − 42 dagen, n = 18) die varieerden in grootte van 2,5 − 10,5 kg lichaamsgewicht en 18 − 137 g hart gewicht (Figuur 2a). Na het overdragen van het geïsoleerde hart naar een Langendorff-systeem (37 ° c) stabiliseerde de hartfrequentie tot 70 ± 4,5 BPM (gemiddelde ± SEM) binnen ~ 10 min van defibrillatie en bleef constant gedurende de duur van de studie (Figuur 2b). Een gemiddelde stroomsnelheid van 184 ± 17 mL/min (gemiddeld ± SEM) werd gemeten, wat vertraagde tot 70 ± 7,5 mL/min na perfusing met verwarmde media met een mechanische ontkoppelaar (figuur 2c).

Lood II-Ecg's werden gedurende de gehele duur van de studie geregistreerd tijdens het sinusritme (Figuur 3a) of als reactie op externe pacing (Figuur 3B-E) om elektrofysiologische parameters te kwantificeren. Voor de beoordeling van het EP werd Dynamic pacing (S1 − S1) toegepast op het rechter Atrium om de wbcl en SNRT te lokaliseren (hersteltijd na S1 − S1 begint, figuur 3c), waarbij wbcl werd aangeduid als de kortste PCL die Atrium naar ventriculaire geleiding initieerde. Een S1 − S2 pacing-protocol werd uitgevoerd met behulp van een bipolaire stimulus-elektrode op de linker ventrikel om de kortste koppelings interval die de ventriculaire depolarisatie initieerde te identificeren, waardoor VERP (figuur 3D). Als alternatief wordt een S1 − S2 Atrium pacing protocol toegepast op Pinpoint avnerp (S1 − S2), zoals weergegeven in figuur 3e. Representatieve voorbeelden van varkens hart elektrofysiologie parameters uitlijnen nauw met die eerder gepubliceerde37.

Er werden optische toewijzings experimenten uitgevoerd tijdens het sinusritme, spontane ventrikelfibrillatie (Figuur 4) of tijdens dynamische pacing (S1 − S1) van de linker VENTRIKEL (LV) om elektrische en calcium restitutie curven te genereren, afgebeeld in Figuur 5. Representatieve beelden van een Knorretje hart met kleurstof lading worden weergegeven in Figuur 4 met overeenkomstige optische actie potentialen (VM) en calcium (CA) transiënten verzameld uit twee gebieden van belang op het epicardial oppervlak (rechter ventrikel [RV] = blauw, LV = rood) . Onverwerkte signalen worden weergegeven tijdens sinusritme en tijdens ventrikelfibrillatie. Zoals eerder vermeld, werd Dynamic epicardial pacing (S1 − S1) ook gebruikt tijdens optische toewijzings experimenten om een klein verschil in de intrinsieke hartslag te normaliseren (Figuur 5A-E). RAW-signalen worden weergegeven (RV = blauw, LV = rood), die werden gebruikt om de actiepotentiaal af te beelden — calcium transiënte koppelings tijd (figuur 5c), activering en duurtijd (figuur 5d), elektrische en calcium restitutie (figuur 5e). Voor dikke myocardiale preparaten is ruimtelijke filtering met kernelgrootte ~ 3 mm x 3 mm geschikt voor epicardial-actiepotentiaal of calciumtransiënte analyse19,47. Dienovereenkomstig, hoge ruimtelijke resolutie beelden (in de beschreven Setup 1240 x 1024 totaal, of 620 x 512 per kanaal, 6,5 μm pixelgrootte) zijn vaak ruimtelijk binned tijdens of na de overname (figuur 5c). Beeldverwerking kan worden uitgevoerd om activerings-en repolarisatie kaarten te genereren met behulp van aangepaste algoritmen23,33,43,45 (afbeelding 3D), met de activeringstijd van elke pixel op het hart werd gedefinieerd als de maximale afgeleide van de actiepotentiaal of calcium voorbijgaande upstroke.

Figure 1
Figuur 1: experimentele opstelling. A) diagram van het geïsoleerde hart perfusie systeem; pijlen duiden de richting van de stroming aan. B) bij het plaatsen van de elektrode wordt een gecanuleerd hart weergegeven. RA = right atria, RV = rechter ventrikel, LV = linker ventrikel, ECG = lood II elektrocardiogram. C) het beeldvormings platform in de nabijheid van het hartweefsel. D) de emissie van elke aanvullende sonde (spanning, calcium) wordt gescheiden door een golflengte met behulp van een beeldsplitsings inrichting met geschikte emissie filters en dichroïde spiegel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: hart gewicht, snelheid en debietmetingen. A) hart gewicht tot lichaamsgewicht verhouding voor elke biglaat gebruikt in het onderzoek (n = 18). (B) gemeten hartslag ~ 10 min na defibrillatie en opnieuw aan het einde van de studie (ongeveer 1 uur). C) coronaire stroom daalt neerslaand na perfusie met een mechanische ontkoppelaar (+ BDM) door een verminderde zuurstofbehoefte. Schaalbalken vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: representatieve voorbeelden van lood II-elektrocardiogram opnames verzameld tijdens sinusritme of als reactie op externe pacing. (A) normaal sinusritme. (B) voorbeeld van het gebruik van epicardial bij cyclus lengte van 400 MS (S1 − S1), dat werd gebruikt voor Imaging-experimenten. C) boven: atriale pacing om wbcl te identificeren; succesvolle inname wordt waargenomen bij S1 = 250 MS waarin atriale naar ventriculaire geleiding wordt waargenomen. Merk op dat atriale pacing kan worden gebruikt om SNRT (tijd tot sinusknoop ontlading te bepalen, na het beginnen met een externe pacing). Bodem: als de S1 cyclus lengte wordt verlaagd tot 205 MS, de geleiding naar de ventrikel mislukt. D) boven: Epicardial pacing (S1 − S2) om verp te identificeren; succesvolle opname wordt waargenomen bij S1 = 450 MS, S2 = 300 MS. onder: als de S2 cyclus lengte wordt verlaagd tot 250 MS, het ventriculaire weefsel niet vast te leggen. E) atriale pacing (S1 − S2) om AVNERP te identificeren. Boven: succesvolle opname wordt waargenomen bij S1 = 450 MS, S2 = 200 MS. onder: aangezien de S2-cyclus lengte wordt verlaagd tot 199 MS, mislukt de geleiding naar de ventrikel. Blauwe pijlen duiden op pacing spikes, rode pijlen duiden Capture (' C ') of no Capture (' NC ') aan. S1 − S1 = dynamisch pacing, S1 − S2 = extrastimulus pacing. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: optische gegevens tijdens sinusritme en ventrikelfibrillatie. Links: representatieve afbeeldingen van een met kleurstof beladen Pig-hart (VM = voltage, RH237; CA = calcium, Rhod2), anterieure weergave. Ruimtelijk gefilterde transmembraan spanning en intracellulaire calcium fluorescerende signalen van een varkens hart tijdens sinusritme (midden). Spanning en calcium signalen tijdens ventrikelfibrillatie (rechts). Signaal regio maten (15 x 15 pixels = 2,4 x 2,4 mm2, 30 x 30 = 4,8 x 4,8 mm2 kernel grootte) weergegeven als rode en blauwe vierkantjes. Eenheden = ΔF/F. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: optische gegevens van Langendorff-perfused Pig Hearts. Onbewerkt, ruimtelijk gefilterd (A) transmembraan spanning en (B) intracellulaire calcium fluorescentie signalen van de rechter en linker ventrikels tijdens elektrische pacing op de Apex. Ongefilterde, ruimtelijk gemiddelde signalen verbeelden optische actie potentialen en calcium transiënten uit regio's van belang (signaal eenheden zijn ΔF/F). (C) een overlay van genormaliseerde transiënten illustreert actiepotentiaal-calcium voorbijgaande koppelings tijd (Low-Pass gefilterd op 75 Hz). D) het verwerken van signalen over het epicardial oppervlak om isochrale kaarten van temporele parameters te genereren, inclusief activeringstijd (tact) en 80% repolarisatie tijd. E) elektrische en calcium voorbijgaande restitutie curven gegenereerd op meerdere frequenties (links) met statistische analyse (rechts) ter illustratie van langere repolarisatie tijd bij langzamere pacing cyclus lengtes. Schaalbalken = gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Chemische Formule Molecuulgewicht g/L
Natriumchloride Nacl 58,44 5,26
Natriumgluconaat C6H11nao7 218,14 5,02
Natriumacetaattrihydraat C2H3nao2• 3H2O 136,08 3,68
Kaliumchloride Kcl 74,55 0,63
Magnesium chloride (watervrij) MgCl2 95,21 0,1405
8,4% natriumbicarbonaat NaHCO3 84,01 13
Mannitol C6H14O6 182,17 16,3
Magnesium sulfaat MgSO4 120,37 4
Ph 7,4
Osmolariteit (mOsmol/L) 294

Tabel 1: gemodificeerd del Nido cardioplegia recept.

Discussion

Hoewel cardiovasculaire onderzoekmodellen variëren van cellulaire tot in vivo preparaten, er is een inherente trade-off tussen klinische relevantie en experimentele nut. Op dit spectrum blijft het geïsoleerde Langendorff-perfused hart een nuttig compromis voor het bestuderen van cardiale fysiologie48. Het hele hart model vertegenwoordigt een hoger niveau van functionele en structurele integratie dan single cell of weefsel monolayers, maar vermijdt ook de verstorende complexiteiten geassocieerd met in vivo modellen. Een groot voordeel bij twee optische mapping-experimenten is dat het epicardial-oppervlak van het geïsoleerde hart kan worden waargenomen, en fluorescentie beeldvorming van transmembraan potentiaal en calcium behandeling kan worden gebruikt om cardiale fysiologie te controleren34.

Knaagdier modellen worden meestal gebruikt voor geïsoleerde hart preparaten in tegenstelling tot grotere dieren, deels te wijten aan de bijbehorende kosten van het up-dimensioneren van alle elementen die betrokken zijn (bijv. oplossings volume, perfusiecircuit, hoeveelheid kleurstoffen en mechanische uncouplers) samen met grotere instabiliteit en neiging voor aritmiteit bij grotere dieren10,36,49. Een voordeel voor het gebruik van varken harten is dat ze sterk lijken op het menselijk hart in structuur, grootte en snelheid van contractie, dus nauwkeuriger modellering van hemodynamische parameters zoals coronaire bloedstroom en cardiale output. Evenzo hebben mensen en varkens vergelijkbare calcium behandeling, elektrocardiogram intervallen37, en actiepotentiaal morfologie met inbegrip van de onderliggende kanalen die het vertegenwoordigt12,50,51, 52. Dit protocol beschrijft in detail de stappen voor het maken van een reproduceerbaar groot diermodel om de myocardiale functie volledig te karakteriseren. Gelijktijdige beeldvorming van transmembraan spanning (RH237) en intracellulair calcium (Rhod2), gebruikt in combinatie met gevestigde elektrofysiologische protocollen, biedt de mogelijkheid om mechanismen te lokaliseren die verantwoordelijk zijn voor veranderde cardiale Functie. De beschreven methodologie kan worden gebruikt voor preklinisch veiligheidsonderzoek, toxicologische screening en het onderzoek naar genetische of andere ziektepathologieën. Bovendien kan de beschreven methodologie worden aangepast en aangepast voor gebruik met andere cardiale modellen (bijv. Canine, mens), afhankelijk van de specifieke onderzoeksinspanningen53,54,55.

Er zijn een paar kritische wijzigingen in gedachten te houden bij de overgang van een kleinere knaagdier model naar een groter varken model voor geïsoleerde, hele hart preparaten. Tijdens de voorbereiding en Setup, raden wij aan het toevoegen van albumine aan de perfusaat te handhaven oncotische druk en verminderen van oedeem (plus anti schuim, indien nodig)56,57,58,59. Bovendien, perfusaat bevattende albumine kan ook helpen bij metabole studies die ook vetzuur-suppletie vereisen aan de media60,61. In tegenstelling tot knaagdier harten, het grotere varken hart hoeft niet te worden ondergedompeld in warme media vanwege de kleinere oppervlakte-volume verhouding en het toegenomen volume van verwarmde media stroomt door de coronaire vaten die de temperatuur beter onderhoudt. Zoals eerder opgemerkt, plaatsten we temperatuurvoelers in de rechter ventrikel en op het epicardial-oppervlak van zowel de rechter-als de linkerventrikels, waarbij slechts lichte temperatuurschommelingen van 1 − 2 °C op alle drie de locaties in de studie werden waargenomen. Belangrijk is dat dergelijke snellere stroomsnelheden ook de kans op bellen en een potentiële embolie kunnen verhogen. Om dit probleem te omzeilen, raden wij het gebruik van een Bubble val met grote boring buizen die recht naar beneden naar de aorta canule. Evenzo vonden we het nuttigst om twee individuen te laten werken in tandem om de aorta te cannuleren op een groter (en zwaarder) hart; Eén persoon om de aorta open te houden met stevige hemostatica en een andere om de aorta aan de aan te beveiligen met behulp van navelstreng. In de beschreven methodologie, we vonden dat perfusie met cardioplegia en defibrillatie essentieel voor cardiale herstel waren, wat in strijd is met knaagdieren hart preparaten. In onze ervaring, slechts een paar uitgesneden harten hervat normale sinus-gedreven activiteit zonder cardioversion.

Om optische beeldvormende eindpunten te verbeteren, beperkte een hangende hart voorbereiding het effect van verblinding dat kan optreden met een ondergedompeld hart. Bovendien vermijdt het hangende hart ook een compressie of compromis van de coronaire vaten op het achterste deel van het hart dat kan optreden bij het horizontaal leggen van het hart voor verticale beeldvorming. We vonden ook dat het laden van fluorescerende kleurstoffen na de Bubble-val (dicht bij de aorta-canule) sterk verbeterde weefsel kleuring en optische signalen. Tot slot, voor het verbeteren van cardiale elektrofysiologie eindpunten, het gebruik van een grotere coaxiale stimulatie elektrode vergemakkelijkt succes atriale pacing. Hoewel we het gebruik van elektrocardiogrammen beschrijven om opname en verlies van opname voor verschillende EP-parameters te identificeren, kunnen intracardiale katheters of bipolaire opname elektroden ook worden gebruikt.

Onze studie was gericht op het ontwikkelen van een methodologie voor dubbele optische mapping en cardiale elektrofysiologische beoordeling in een geïsoleerd, intact varkens hart model. Vanwege gelijkenissen met het juveniele menselijk hart blijft het varkens hart een populair model voor studies gericht op pediatrische cardiologie of aangeboren hartafwijkingen. Belangrijk is dat de beschreven aanpak kan worden aangepast om te gebruiken met groter formaat volwassen harten en/of verschillende soorten van belang. Andere laboratoria kunnen namelijk vaststellen dat het gebruik van Canine of menselijk hart (donor of zieke) meer toepasbaar is voor hun specifieke onderzoek focus53,54,55. Een andere mogelijke beperking van deze studie is het gebruik van een mechanische ontkoppelaar om bewegings artefact tijdens beeldvorming te verminderen. Blebbistatin is de ontkoppelaar van de keuze geworden in cardiale beeldvormings toepassingen vanwege de minimale effecten op ECG-parameters, activering en refractaire perioden41,62,63. BDM is een goedkopere keuze, wat vooral belangrijk kan zijn in grote dierproeven die grotere volumes perfusaat en mechanische ontkoppelaar vereisen, maar het is bekend dat het een grotere invloed heeft op kalium-en calcium stromen die het actie potentieel kunnen veranderen morfologie64,65,66,67. Als BDM wordt gebruikt, houd er dan rekening mee dat apd verkorting de hart kwetsbaarheid voor Shock-geïnduceerde hartritme68verhoogt. Omgekeerd, de belangrijkste beperking voor het gebruik van blebbistatine is de lichtgevoeligheid en fototoxiciteit, hoewel alternatieve formuleringen die deze effecten hebben verminderd69,70,71. Ten slotte maakt de beschreven methodologie gebruik van een enkel camerasysteem voor dubbele optische mapping experimenten, maar het is belangrijk op te merken dat onderzoeken gericht op ventriculaire fibrillatie en/of het volgen van elektrische golven over het epicardial-oppervlak zou deze benadering moeten wijzigen om driedimensionale panoramische beeldvorming op te nemen, zoals beschreven door anderen15,19,72,73,74,75 .

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs erkennen Dr. Matthew Kay dankbaar voor nuttige experimentele begeleiding, en Manelle Ramadan en Muhaymin Chowdhury voor technische assistentie. Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (R01HL139472 to NGP, R01 HL139712 to NI), Children's Research Institute, Children's National Heart Institute en Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(-)-Blebbistatin Sigma-Aldrich B0560-5MG Mechanical Uncoupler
2,3-Butanedione monoxime (BDM) Sigma-Aldrich B0753-100G Mechanical Uncoupler
Albumin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A9418
Analog signal interface emka Technologies itf16USB
Antifoam Sigma-Aldrich A5758-250ML
Antifoam Y-30 Emulsion Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A5758
Aortic cannula, 5/16” Cole-Parmer 45509-60
Bubble trap Sigma-Aldrich CLS430641U-100EA
CaCl2 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ C77-500
Camera, sCMOS Andor Technology Zyla 4.2 PLUS
Coaxial stimulation electrode (atria) Harvard Apparatus 73-0219
Defibrillator Zoll M Series
Dichroic mirror Chroma Technology T660lpxrxt-UF2
Differential amplifier Warner Instruments DP-304A
Emission filter, calcium Chroma Technology ET585/40m
Emission filter, voltage Chroma Technology ET710lp
EP stimulator (Bloom) Fisher Medical DTU-215B
Excitation filter Chroma Technology CT510/60bp
Excitation lights Thorlabs SOLIS-525C
Filter McMaster-Carr 8147K52
Filter cartridge, polypropylene Pentair PD-5-934
Filter housing McMaster-Carr 9979T21
Flow transducer Transonic ME6PXN
Glucose Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 158968
Heating coil Radnoti 158821
Hemofilter Hemocor HPH 400
Hemostatic Forceps World Precision Instruments 501326
Image Splitter Cairn Research OptoSplit II
KCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P3911
KH2PO4 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ 423-316
Large-bore tubing, I.D. 3/8” Fisher Scientific 14-169-7H
Lens 50 mm, 0.95 f-stop Navitar DO-5095
Metamorph Molecular Devices Image Alignment
MgSO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M-7506
Mucasol detergent Sigma-Aldrich Z637181-2L
Na Pyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P2256
NaCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S-3014
NaHCO3 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ S-233
Needle Electrodes 29 G, 2 mm AD Instruments Inc. MLA1204
Noise eliminator Quest Scientific Humbug
Perfusion pump PolyStan A/S 1481
Pressure transducer World Precision Instruments BLPR2
Reservoir, 2 L Cole-Parmer UX-34541-07
RH237 AAT Bioquest Inc. 21480
Rhod2-AM AAT Bioquest Inc. 21062
Stimulation electrode (ventricle) Harvard Apparatus 73-0160
Surgical Suture McKesson Medical-Surgical 890186
Transducer amplifier World Precision Instruments TBM4M
Tubing flow console Transonic TS410
Umbilical tape Jorvet J0025UA
Water bath/circulator VWR 89400-970
Surgical Tools
Bandage shears Harvard Apparatus 72-8448 Lister Bandage Scissors, Angled, Blunt/Blunt, 42.0 mm blade length, 17.0 cm
Electrocautery Dalwha Corp. Ltd. BA2ALD001 Model: 200 Basic
Hemostat Roboz RS-7476 St Vincent Tube Occluding Forceps
Hemostatic forceps Harvard Apparatus 72-8960 Hartmann Hemostatic Forceps, Curved, Serrated 2.2 mm tip width, 9.5 cm
Hemostats Harvard Apparatus 72-8985 Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Curved, Serrated, 2 mm tip 14 cm
Mayo scissors WPI 501749 14.5 cm, Straight
Metzenbaum scissors WPI 501747 11.5 cm, Straight
Mosquito forceps Harvard Apparatus 72-8980 Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Straight, Smooth, 2 mm tip width 12 cm
Needle holder Harvard Apparatus 72-8828 Webster Needle Holders, Straight, Smooth,13.0 cm overall length
Pediatric cross clamp Roboz RS-7660 Cooley-Derra Clamp 6.25" 5 mm Calibrations
Right angle forceps WPI 501240 Baby Mixter Hemostatic Forceps, 14 cm, Right Angle
Scalpel Ted Pella 549-4 Scalpel Handle No. 4, 13.7 cm Stainless Steel and 10 No. 22 Blades
Scissors Harvard Apparatus 72-8380 Operating Scissors, Straight, Blunt/Blunt, 42 mm blade,12 cm
Straight Serrated forceps WPI 500363 Dressing Forceps 15.5 cm
Towel clamp WPI 501700 Backhaus Towel Clamp, 13 cm, Curved, Locking handle, SS
Weitlaner retractor WPI 501314 Weitlaner Retractor, Self-Retaining, 10.2 cm, 2x 3 Sharp Prongs
Disposables
3-0 prolene suture Various vendors Various vendors
Vessel loop Aspen surgical 011001PBX Sterion® Vessel Loop, 0.8 mm x 406 mm
Cardioplegia (Plegisol) Pfizer 00409-7969-05 Plegisol; St Thomas crystalloid cardioplegia solution 20 mL/kg
Heparin Various vendors Various vendors 300 U/kg
Syringe and Needle Various vendors Various vendors 60 mL & 18 G respectively
Umbilical tape Ethicon U12T

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, L., De Jesus, N. M., Ripplinger, C. M. Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart. Journal of Visualized Experiments. (103), e53166 (2015).
  2. Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2012).
  3. Asfour, H., Wengrowski, A. M., Jaimes, R., Swift, L. M., Kay, M. W. NADH fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts. Journal of Visualized Experiments. (65), e4115 (2012).
  4. Capecchi, M. R. The new mouse genetics: altering the genome by gene targeting. Trends in genetic. 5 (3), 70-76 (1989).
  5. Hall, B., Limaye, A., Kulkarni, A. B. Overview: generation of gene knockout mice. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 19, Unit 19 1-17 (2009).
  6. Schechter, M. A., et al. An Isolated Working Heart System for Large Animal Models. Journal of Visualized Experiments. (88), e51671 (2014).
  7. Arlock, P., et al. Ion currents of cardiomyocytes in different regions of the Göttingen minipig heart. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 86, 12-18 (2017).
  8. Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of anatomy. 193, Pt 1 105-119 (1998).
  9. Markert, M., et al. Validation of the normal, freely moving Göttingen minipig for pharmacological safety testing. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 60 (1), 79-87 (2009).
  10. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
  11. Bertho, E., Gagnon, G. A comparative study in three dimension of the blood supply of the normal interventricular septum in human, canine, bovine, porcine, ovine and equine heart. Diseases of the Chest. 46, 251-262 (1964).
  12. Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (5), 432-438 (2014).
  13. Camacho, P., Fan, H., Liu, Z., He, J. Q. Large Mammalian Animal Models of Heart Disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3 (4), 30 (2016).
  14. Jordan, C. P., et al. Minimally Invasive Resynchronization Pacemaker: A Pediatric Animal Model. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (6), 2210-2213 (2013).
  15. Rogers, J. M., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Kay, M. W. Panoramic optical mapping reveals continuous epicardial reentry during ventricular fibrillation in the isolated swine heart. Biophysical Journal. 92 (3), 1090-1095 (2007).
  16. Langendorff, O. Untersuchungen am uberlebenden Saugethierherzen [Investigations on the surviving mammalian heart]. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 61, 291-332 (1895).
  17. Pumir, A., Arutunyan, A., Krinsky, V., Sarvazyan, N. Genesis of ectopic waves: role of coupling, automaticity, and heterogeneity. Biophysical Journal. 89 (4), 2332-2349 (2005).
  18. Kay, M. W., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Rogers, J. M. Lifetimes of epicardial rotors in panoramic optical maps of fibrillating swine ventricles. American journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 291 (4), 1935-1941 (2006).
  19. Lee, P., et al. Low-Cost Optical Mapping Systems for Panoramic Imaging of Complex Arrhythmias and Drug-Action in Translational Heart Models. Scientific Reports. 7, 43217 (2017).
  20. Venkataraman, R., Holcomb, M. R., Harder, R., Knollmann, B. C., Baudenbacher, F. Ratiometric imaging of calcium during ischemia-reperfusion injury in isolated mouse hearts using Fura-2. BioMedical Engineering OnLine. 11 (1), 39 (2012).
  21. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical Imaging of the Heart. Circulation Research. 95 (1), 21-33 (2004).
  22. Zimmermann, W. H., et al. Three-dimensional engineered heart tissue from neonatal rat cardiac myocytes. Biotechnology and Bioengineering. 68 (1), 106-114 (2000).
  23. Jaimes, R., et al. A Technical Review of Optical Mapping of Intracellular Calcium within Myocardial Tissue. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (11), 1388-1401 (2016).
  24. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
  25. Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. S. Imaging Calcium Sparks in Cardiac Myocytes. Methods in Molecular Biology. 689, Clifton, N.J. 205 (2011).
  26. Hou, J. H., Kralj, J. M., Douglass, A. D., Engert, F., Cohen, A. E. Simultaneous mapping of membrane voltage and calcium in zebrafish heart in vivo reveals chamber-specific developmental transitions in ionic currents. Frontiers in Physiology. 5, 344 (2014).
  27. Thomas, K., Goudy, J., Henley, T., Bressan, M. Optical Electrophysiology in the Developing Heart. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (2), 28 (2018).
  28. Nikolski, V., Efimov, I. Fluorescent imaging of a dual-pathway atrioventricular-nodal conduction system. Circulation Research. 88 (3), 23-30 (2001).
  29. Posnack, N. G., et al. Bisphenol A Exposure and Cardiac Electrical Conduction in Excised Rat Hearts. Environmental Health Perspectives. 122 (4), 384-390 (2014).
  30. Garrott, K., et al. KATP channel inhibition blunts electromechanical decline during hypoxia in left ventricular working rabbit hearts. The Journal of Physiology. 595 (12), 3799-3813 (2017).
  31. Wang, Z., et al. Exposure to Secondhand Smoke and Arrhythmogenic Cardiac Alternans in a Mouse Model. Environmental Health Perspectives. 126 (12), 127001 (2018).
  32. Francis Stuart, S. D., et al. Age-related changes in cardiac electrophysiology and calcium handling in response to sympathetic nerve stimulation. The Journal of Physiology. 596 (17), 3977-3991 (2018).
  33. Jaimes, R., et al. Plasticizer Interaction With the Heart: Chemicals Used in Plastic Medical Devices Can Interfere With Cardiac Electrophysiology. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 12 (7), (2019).
  34. Boukens, B. J., Efimov, I. R. A century of optocardiography. IEEE reviews in Biomedical Engineering. 7, 115-125 (2014).
  35. Li, N., Wehrens, X. H. Programmed Electrical Stimulation in Mice. Journal of Visualized Experiments. (39), e1730 (2010).
  36. Dor-Haim, H., Berenfeld, O., Horowitz, M., Lotan, C., Swissa, M. Reduced Ventricular Arrhythmogeneity and Increased Electrical Complexity in Normal Exercised Rats. PLoS ONE. 8 (6), 66658 (2013).
  37. Noszczyk-Nowak, A., et al. Normal Values for Heart Electrophysiology Parameters of Healthy Swine Determined on Electrophysiology Study. Advances in Clinical and Experimental. 25 (6), 1249-1254 (2016).
  38. Wengrowski, A. M., Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R., Kay, M. W. NADH changes during hypoxia, ischemia, and increased work differ between isolated heart preparations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (4), 529-537 (2014).
  39. Schramm, M., Klieber, H. G., Daut, J. The energy expenditure of actomyosin-ATPase, Ca(2+)-ATPase and Na+,K(+)-ATPase in guinea-pig cardiac ventricular muscle. The Journal of Physiology. 481, 647-662 (1994).
  40. Kuzmiak-Glancy, S., et al. Cardiac performance is limited by oxygen delivery to the mitochondria in the crystalloid-perfused working heart. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 704-715 (2018).
  41. Fedorov, V. V., et al. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
  42. Evertson, D. W., et al. High-Resolution High-Speed Panoramic Cardiac Imaging System. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 55 (3), 1241-1243 (2008).
  43. Jaimes, R., et al. Path Splitter: A New Approach for Truly Simultaneous Dual Optical Mapping of the Heart with a Single Camera. bioRxiv. , 651380 (2019).
  44. Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
  45. Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303 (7), 753-765 (2012).
  46. O'Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1389 (2019).
  47. Mironov, S. F., Vetter, F. J., Pertsov, A. M. Fluorescence imaging of cardiac propagation: spectral properties and filtering of optical action potentials. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (1), 327-335 (2006).
  48. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
  49. Nishida, K., Michael, G., Dobrev, D., Nattel, S. Animal models for atrial fibrillation: clinical insights and scientific opportunities. Europace. 12 (2), 160-172 (2010).
  50. Verdouw, P. D., Van Den Doel, M. A., De Zeeuw, S., Duncker, D. J. Animal models in the study of myocardial ischaemia and ischaemic syndromes. Cardiovascular Research. 39 (1), 121-135 (1998).
  51. Camacho, P., Fan, H., Liu, Z., He, J. Q. Large Mammalian Animal Models of Heart Disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3 (4), 30 (2016).
  52. Swindle, M. M., Makin, A., Herron, A. J., Clubb, F. J., Frazier, K. S. Swine as Models in Biomedical Research and Toxicology Testing. Veterinary Pathology. 49 (2), 344-356 (2012).
  53. Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical Volume of Human Myocardium Necessary to Maintain Ventricular Fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11 (11), 006692 (2018).
  54. Hill, A. J., et al. In Vitro Studies of Human Hearts. The Annals of Thoracic Surgery. 79 (1), 168-177 (2005).
  55. Fedorov, V. V., et al. Structural and functional evidence for discrete exit pathways that connect the canine sinoatrial node and atria. Circulation Research. 104 (7), 915-923 (2009).
  56. Jacob, M., et al. Albumin Augmentation Improves Condition of Guinea Pig Hearts After 4 hr of Cold Ischemia. Transplantation. 87 (7), 956-965 (2009).
  57. Segel, L. D., Ensunsa, J. L. Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 254 (6), 1105-1112 (1988).
  58. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
  59. Werner, J. C., Whitman, V., Fripp, R. R., Schuler, H. G., Morgan, H. E. Carbohydrate metabolism in isolated, working newborn pig heart. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 241 (5), 364-371 (1981).
  60. Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303 (2), 156-167 (2012).
  61. Kates, R. E., Yee, Y. G., Hill, I. Effect of albumin on the electrophysiologic stability of isolated perfused rabbit hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 13 (1), 168-172 (1989).
  62. Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), 262-269 (2012).
  63. Swift, L. M., et al. Properties of blebbistatin for cardiac optical mapping and other imaging applications. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (5), 503-512 (2012).
  64. Kettlewell, S., Walker, N. L., Cobbe, S. M., Burton, F. L., Smith, G. L. The electrophysiological and mechanical effects of 2,3-butane-dione monoxime and cytochalasin-D in the Langendorff perfused rabbit heart. Experimental Physiology. 89 (2), 163-172 (2004).
  65. Liu, Y., et al. Effects of diacetyl monoxime on the electrical properties of sheep and guinea pig ventricular muscle. Cardiovascular Research. 27 (11), 1991-1997 (1993).
  66. Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (45), 419-424 (2010).
  67. Sellin, L. C., McArdle, J. J. Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime. Pharmacology & Toxicology. 74 (6), 305-313 (1994).
  68. Cheng, Y., Li, L., Nikolski, V., Wallick, D. W., Efimov, I. R. Shock-induced arrhythmogenesis is enhanced by 2,3-butanedione monoxime compared with cytochalasin D. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (1), 310-318 (2004).
  69. Kolega, J. Phototoxicity and photoinactivation of blebbistatin in UV and visible light. Biochemical and Biophysical Research Communications. 320 (3), 1020-1025 (2004).
  70. Sakamoto, T., Limouze, J., Combs, C. A., Straight, A. F., Sellers, J. R. Blebbistatin, a myosin II inhibitor, is photoinactivated by blue light. Biochemistry. 44 (2), 584-588 (2005).
  71. Várkuti, B. H., et al. A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative. Scientific Reports. 6 (1), 26141 (2016).
  72. Bray, M. A., Lin, S. F., Wikswo, J. P. Three-dimensional surface reconstruction and fluorescent visualization of cardiac activation. IEEE Transactions on Bio-medical Engineering. 47 (10), 1382-1391 (2000).
  73. Qu, F., Ripplinger, C. M., Nikolski, V. P., Grimm, C., Efimov, I. R. Three-dimensional panoramic imaging of cardiac arrhythmias in rabbit heart. Journal of Biomedical Optics. 12 (4), 44019 (2007).
  74. Gloschat, C., et al. RHYTHM: An Open Source Imaging Toolkit for Cardiac Panoramic Optical Mapping. Scientific Reports. 8 (1), 2921 (2018).
  75. Kay, M. W., Amison, P. M., Rogers, J. M. Three-dimensional surface reconstruction and panoramic optical mapping of large hearts. IEEE Transactions on Bio-medical Engineering. 51 (7), 1219-1229 (2004).

Tags

Geneeskunde probleem 153 fluorescentie beeldvorming elektrofysiologie hart elektrocardiogram optische mapping optocardiografie
Optocardiografie en elektrofysiologie studies van ex vivo Langendorff-perfused Hearts
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Swift, L. M., Jaimes III, R.,… More

Swift, L. M., Jaimes III, R., McCullough, D., Burke, M., Reilly, M., Maeda, T., Zhang, H., Ishibashi, N., Rogers, J. M., Posnack, N. G. Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts. J. Vis. Exp. (153), e60472, doi:10.3791/60472 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter