Målet med denne studien var å etablere en metode for å undersøke CARDIAC dynamikk ved hjelp av en translational dyr modell. Den beskrevne eksperimentelle tilnærmingen inkorporerer dual-utslipp optocardiography i forbindelse med en elektrofysiologisk studie for å vurdere elektrisk aktivitet i en isolert, intakt svin hjerte modell.
Små dyremodeller er mest brukt i kardiovaskulær forskning på grunn av tilgjengeligheten av genmodifiserte arter og lavere kostnader i forhold til større dyr. Likevel, større pattedyr er bedre egnet for translational forskning spørsmål knyttet til normal hjerte fysiologi, patofysiologi, og prekliniske testing av terapeutiske midler. For å overkomme de tekniske barrierene forbundet med å ansette en større dyremodell i CARDIAC forskning, beskriver vi en tilnærming for å måle fysiologiske parametre i et isolert, Langendorff-perfusert Piglet hjerte. Denne tilnærmingen kombinerer to kraftige eksperimentelle verktøy for å evaluere tilstanden i hjertet: elektrofysiologi (EP) studie og samtidig optisk kartlegging av transmembrane penning og intracellulære kalsium ved hjelp av parameter sensitive fargestoffer (RH237, Rhod2-AM). De beskrevne metodene egner seg godt til translational studier som undersøker hjerte ledningssystemet, endringer i Handlings potensialet morfologi, kalsium håndtering, eksitasjon og forekomsten av CARDIAC alternans eller Arytmier.
Kardiovaskulær sykdom er en ledende årsak til sykdom og død over hele verden. Som sådan er en primær forsknings fokus å optimalisere metoder som kan brukes til å studere normal hjerte fysiologi og underliggende mekanismer som kan bidra til sykelighet og dødelighet hos mennesker. Grunnleggende kardiovaskulær forskning har tradisjonelt støttet seg på små dyremodeller, inkludert gnagere og kaniner1,2,3, på grunn av tilgjengeligheten av genmodifiserte arter4,5, lavere kostnad, mindre eksperimentell fotavtrykk og høyere gjennomstrømming. Bruken av en gris modell har imidlertid potensial til å gi mer klinisk relevante data6. Faktisk har tidligere studier dokumentert likheter i CARDIAC elektrofysiologi (EP) mellom mennesker og griser, inkludert lignende ion7, action potensial form8, og svar på farmakologisk testing9. Videre har svin hjertet kontraktile og avslapping Kinetics som er mer sammenlignbare med mennesker enn enten gnagere eller kaniner10. Sammenlignet med en canine modell, den svin koronar anatomi tettere ligner en menneskelig hjerte11,12 og er modellen av valget for studier fokusert på hjerte utvikling, pediatric kardiologi og/eller medfødt hjertefeil 13. selv om det er forskjeller mellom gris og menneskehjertet8, disse likhetene gjør svin hjertet en verdifull modell for kardiovaskulær forskning14.
Retrograd av hjertet har blitt en standard protokoll for å studere CARDIAC dynamikk ex vivo15 siden først etablert av Oskar Langendorff16. Følgelig kan Langendorff brukes til å støtte et isolert, intakt hjerte i fravær av autonome påvirkninger. Denne modellen er et nyttig verktøy for direkte sammenligne CARDIAC elektrofysiologi og contractility mellom sunne og ikke-sunne hjerter. Siden CARDIAC dynamikk er både timelig og romlig kompleks, en liten endring i en region kan dramatisk påvirke hele hjertets evne til å fungere som en syncytium17. Derfor er høy spatiotemporal Imaging av parameter sensitive fargestoffer et nyttig verktøy for overvåking hjertefunksjon over overflaten av hjertet18,19. Faktisk gjør samtidig dual Imaging av spenning og kalsium-sensitive fluorescerende sonder for vurdering av elektrisk aktivitet, kalsium håndtering og eksitasjon-sammentrekning kopling på vevet nivå20,21, 22,23,24,25,26,27,28. Langendorff-og/eller optisk kartlegging teknikker har tidligere blitt brukt til å dokumentere nedgangen i CARDIAC ytelse på grunn av aldring eller genetiske mutasjoner, og å vurdere sikkerheten til farmakologiske midler eller miljømessige eksponeringer29 ,30,31,32,33.
I klinisk setting, en invasiv CARDIAC elektrofysiologi studie brukes ofte til å undersøke hjerterytme forstyrrelser, identifisere patologi, og finne mulige behandlingsalternativer. Tilsvarende beskriver vi en EP-protokoll som kan brukes til å vurdere sinus node funksjon, måle atrioventrikulær ledning, og identifisere ingen respons av hjerteinfarkt vev. Den beskrevne EP studien kan utføres i forbindelse med optisk kartlegging, eller optocardiography34, å fullt karakterisere hjerte fysiologi i isolerte hjerter. I den beskrevne protokollen ble høy spatiotemporal oppløsning fluorescens Imaging utført med en kombinasjon av spenning (RH237) og kalsium (Rhod-2AM) fargestoffer i et dobbelt utslipp oppsett. I tillegg ble CARDIAC elektrofysiologi parametre overvåket under både sinus rytme og som svar på programmert elektrisk stimulering.
Selv om hjerte-forskning modeller spenner fra Cellular til in vivo forberedelser, det er en iboende trade-off mellom klinisk relevans og eksperimentell nytte. På dette spekteret, fortsatt den isolerte Langendorff-perfusert hjertet et nyttig kompromiss for å studere hjerte fysiologi48. Hele hjerte modellen representerer et høyere nivå av funksjonell og strukturell integrasjon enn enkelt celle-eller vevs monolagere, men unngår også den forvirrende kompleksiteten forbundet med in vivo-modeller. En stor fordel i løpet av dobbelt optisk kartlegging eksperimenter er at epicardial overflaten av det isolerte hjertet kan observeres, og fluorescens avbildning av transmembrane potensial og kalsium håndtering kan brukes til å overvåke hjerte fysiologi34.
Gnagere modeller er mest brukt for isolerte hjerte preparater i motsetning til større dyr, på grunn av den tilhørende kostnaden for opp-dimensjonering alle elementene som er involvert (f. eks, løsnings volum, modell krets, mengde fargestoffer og mekaniske uncouplers) sammen med større ustabilitet og tilbøyelighet til arytmi i større dyr10,36,49. En fordel å bruke gris hjerter er at de ligner den menneskelige hjertet i struktur, størrelse og hastighet på sammentrekning, derfor mer presist modellering hemodynamisk parametre som koronar blodstrøm og CARDIAC output. På samme måte, mennesker og griser har lignende kalsium håndtering, elektro intervaller37, og handling potensial morfologi inkludert de underliggende kanalene som den representerer12,50,51, i 52. Denne protokollen beskriver i detalj fremgangsmåten for å skape en reproduserbar stor dyremodell for å omfattende karakterisere hjerteinfarkt funksjon. Samtidig bilde av transmembrane penning (RH237) og intracellulære kalsium (Rhod2), som brukes sammen med etablerte elektrofysiologisk protokoller, gir mulighet til å finne mekanismer som er ansvarlig for endrede CARDIAC Funksjonen. Den beskrevne metodikken kan brukes til prekliniske sikkerhetstesting, toksikologiske undersøkelser og etterforskning av genetiske eller andre sykdoms sykdommer. Videre kan den beskrevne metodikken modifiseres og tilpasses for bruk med andre CARDIAC modeller (f. eks, canine, Human) avhengig av den spesifikke forskningen fokus53,54,55.
Det er noen kritiske modifikasjoner å huske på når overgangen fra en mindre gnager modell til en større gris modell for isolerte, hele hjerte forberedelser. Under forberedelse og oppsett, anbefaler vi å legge albumin til perfusate å opprettholde oncotic trykk og redusere ødem (pluss skumdemper, om nødvendig)56,57,58,59. Dess, perfusate inneholder albumin kan også hjelpe i metabolske studier som også krever fettsyrer-tilskudd til Media60,61. I motsetning til gnager hjerter, det større gris hjertet ikke trenger å være neddykket i varme medier på grunn av sin mindre overflate til volumforhold og økt volum av varmet Media strømmer gjennom koronar fartøy som bedre opprettholder temperaturen. Som nevnt tidligere plasserte vi temperatur sonder i høyre ventrikkel og på den epicardial overflaten til både høyre og venstre ventriklene, og observerer bare små temperatursvingninger på 1 − 2 ° c på alle tre steder i løpet av studien. Viktigere, kan slike raskere strømningsrater også øke sannsynligheten for bobler og en potensiell emboli. For å omgå dette problemet, anbefaler vi å bruke en boble felle med stor bore slange som fører rett ned til aorta-kanyle. Tilsvarende fant vi det mest nyttig å ha to personer som arbeider i tandem å kannelerer aorta på en større (og tyngre) hjerte; en person til å holde aorta åpen med solid hemostats og en annen for å sikre aorta til canula ved hjelp av navle tape. I den beskrevne metodikk, fant vi at cardioplegia og defibrillering var avgjørende for CARDIAC utvinning, som er i strid med gnagere hjerte preparater. I vår erfaring, bare noen få excised hjerter gjenopptatt normal sinus-drevet aktivitet uten kardioversjon.
For å forbedre optiske Imaging endepunkter, en hengende hjerte forberedelse begrenset effekten av gjenskinn som kan oppstå med et nedsenket hjerte. Videre unngår hengende hjerte også noen kompresjon eller kompromiss av koronar fartøy på bakre aspekt av hjertet som kan oppstå når du legger hjertet ned horisontalt for vertikal bildebehandling. Vi fant også at lasting fluorescerende fargestoffer etter boble felle (nær aorta kanyle) sterkt forbedret vev flekker og optiske signaler. Til slutt, for å forbedre CARDIAC elektrofysiologi endepunkter, bruk av en større koaksial stimulering elektroden tilrettelagt vellykket atrieflimmer pacing. Selv om vi beskriver bruken av elektrokardiogrammer for å identifisere fangst og tap av fangst for ulike EP parametere, intrakardielle katetre eller bipolar opptaks elektroder kan også brukes.
Vår studie var fokusert på å utvikle en metodikk for dobbel optisk kartlegging og CARDIAC elektrofysiologisk vurdering i en isolert, intakt svin hjerte modell. På grunn av likheter med juvenile menneskets hjerte, forblir svin hjerte en populær modell for studier fokusert på pediatric kardiologi eller medfødt hjertefeil. Viktigere, den beskrevne tilnærmingen kan tilpasses til bruk med større størrelse voksne hjerter og/eller ulike arter av interesse. Faktisk kan andre laboratorier finner at bruk av canine eller menneskelige hjerter (enten donor eller syk) er mer aktuelt for deres spesifikke forskning fokus53,54,55. En annen potensiell begrensning til denne studien er bruk av en mekanisk uncoupler for å redusere bevegelse gjenstand under bildebehandling. Blebbistatin har blitt den uncoupler av valg i CARDIAC Imaging applikasjoner på grunn av sin minimale effekter på EKG-parametre, aktivisering og ildfaste perioder41,62,63. BDM er et rimeligere valg, som kan være spesielt viktig i store dyrestudier som krever større volumer av perfusate og mekaniske uncoupler, men det er kjent for å ha en større innvirkning på kalium og kalsium strømmer som kan endre handlings potensialet morfologi64,65,66,67. Hvis BDM brukes, Merk at APD forkortelse øker hjertene sårbarhet for sjokk-indusert arrythmias68. Omvendt, den viktigste begrensningen for å bruke blebbistatin er dens foto og Phototoksisitet, selv om alternative formuleringer som har redusert disse effektene69,70,71. Til slutt, den beskrevne metodikken utnytter et enkelt kamera system for dobbelt optisk kartlegging eksperimentering, men det er viktig å merke seg at forskningsstudier fokusert på ventrikkel atrieflimmer og/eller sporing av elektriske bølger over epicardial overflaten ville nød å endre denne adgang å inkludere tre-dimensjonal Panoramic tenkelig, idet beskrevet av andre15,19,72,73,74,75 .
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takknemlig erkjenner Dr. Matthew Kay for nyttig eksperimentell veiledning, og Manelle Ramadan og Muhaymin Chowdhury for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (R01HL139472 til NGP, R01 HL139712 til NI), Children ‘ s Research Institute, Children ‘ s National Heart Institute og Sheikh Zayed Institute for pediatric kirurgisk innovasjon.
(-)-Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560-5MG | Mechanical Uncoupler |
2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753-100G | Mechanical Uncoupler |
Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9418 | |
Analog signal interface | emka Technologies | itf16USB | |
Antifoam | Sigma-Aldrich | A5758-250ML | |
Antifoam Y-30 Emulsion | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A5758 | |
Aortic cannula, 5/16” | Cole-Parmer | 45509-60 | |
Bubble trap | Sigma-Aldrich | CLS430641U-100EA | |
CaCl2 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | C77-500 | |
Camera, sCMOS | Andor Technology | Zyla 4.2 PLUS | |
Coaxial stimulation electrode (atria) | Harvard Apparatus | 73-0219 | |
Defibrillator | Zoll | M Series | |
Dichroic mirror | Chroma Technology | T660lpxrxt-UF2 | |
Differential amplifier | Warner Instruments | DP-304A | |
Emission filter, calcium | Chroma Technology | ET585/40m | |
Emission filter, voltage | Chroma Technology | ET710lp | |
EP stimulator (Bloom) | Fisher Medical | DTU-215B | |
Excitation filter | Chroma Technology | CT510/60bp | |
Excitation lights | Thorlabs | SOLIS-525C | |
Filter | McMaster-Carr | 8147K52 | |
Filter cartridge, polypropylene | Pentair | PD-5-934 | |
Filter housing | McMaster-Carr | 9979T21 | |
Flow transducer | Transonic | ME6PXN | |
Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 158968 | |
Heating coil | Radnoti | 158821 | |
Hemofilter | Hemocor | HPH 400 | |
Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 501326 | |
Image Splitter | Cairn Research | OptoSplit II | |
KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P3911 | |
KH2PO4 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | 423-316 | |
Large-bore tubing, I.D. 3/8” | Fisher Scientific | 14-169-7H | |
Lens 50 mm, 0.95 f-stop | Navitar | DO-5095 | |
Metamorph | Molecular Devices | Image Alignment | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M-7506 | |
Mucasol detergent | Sigma-Aldrich | Z637181-2L | |
Na Pyruvate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P2256 | |
NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S-3014 | |
NaHCO3 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S-233 | |
Needle Electrodes 29 gauge, 2 mm | AD Instruments Inc. | MLA1204 | |
Noise eliminator | Quest Scientific | Humbug | |
Perfusion pump | PolyStan | A/S 1481 | |
Pressure transducer | World Precision Instruments | BLPR2 | |
Reservoir, 2 liter | Cole-Parmer | UX-34541-07 | |
RH237 | AAT Bioquest Inc. | 21480 | |
Rhod2-AM | AAT Bioquest Inc. | 21062 | |
Stimulation electrode (ventricle) | Harvard Apparatus | 73-0160 | |
Surgical Suture | McKesson Medical-Surgical | 890186 | |
Transducer amplifier | World Precision Instruments | TBM4M | |
Tubing flow console | Transonic | TS410 | |
Umbilical tape | Jorvet | J0025UA | |
Water bath/circulator | VWR | 89400-970 | |
Surgical Tools | |||
Bandage shears | Harvard Apparatus | 72-8448 | Lister Bandage Scissors, Angled, Blunt/Blunt, 42.0mm blade length, 17.0 cm |
Electrocautery | Dalwha Corp. Ltd. | BA2ALD001 | Model: 200 Basic |
Hemostat | Roboz | RS-7476 | St Vincent Tube Occluding Forceps |
Hemostatic forceps | Harvard Apparatus | 72-8960 | Hartmann Hemostatic Forceps, Curved, Serrated 2.2 mm tip width, 9.5 cm |
Hemostats | Harvard Apparatus | 72-8985 | Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Curved, Serrated, 2mm tip 14cm |
Mayo scissors | WPI | 501749 | 14.5 cm, Straight |
Metzenbaum scissors | WPI | 501747 | 11.5 cm, Straight |
Mosquito forceps | Harvard Apparatus | 72-8980 | Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Straight, Smooth, 2mm tip width 12cm |
Needle holder | Harvard Apparatus | 72-8828 | Webster Needle Holders, Straight, Smooth,13.0 cm overall length |
Pediatric cross clamp | Roboz | RS-7660 | Cooley-Derra Clamp 6.25" 5mm Calibrations |
Right angle forceps | WPI | 501240 | Baby Mixter Hemostatic Forceps, 14cm, Right Angle |
Scalpel | Ted Pella | 549-4 | Scalpel Handle No. 4, 13.7cm Stainless Steel and 10 No. 22 Blades |
scissors | Harvard Apparatus | 72-8380 | Operating Scissors, Straight, Blunt/Blunt, 42mm blade,12cm |
Straight Serrated forceps | WPI | 500363 | Dressing Forceps 15.5cm |
Towel clamp | WPI | 501700 | Backhaus Towel Clamp, 13cm, Curved, Locking handle, SS |
Weitlaner retractor | WPI | 501314 | Weitlaner Retractor, Self-Retaining, 10.2cm, 2×3 Sharp Prongs |
Disposables | |||
3-0 prolene suture | Various vendors | Various vendors | |
Vessel loop | Aspen surgical | 011001PBX | Sterion® Vessel Loop, 0.8 x 406mm |
Cardioplegia (Plegisol) | Pfizer | 00409-7969-05 | Plegisol; St Thomas crystalloid cardioplegia solution 20ml/kg |
Heparin | Various vendors | Various vendors | 300 U/kg |
Syringe and Needle | Various vendors | Various vendors | 60mL & 18G respectively |
Umbilical tape | Ethicon | U12T |