이 연구의 목적은 번역 동물 모델을 사용하여 심장 역학을 조사하는 방법을 확립하는 것이었습니다. 기술된 실험 접근법은 분리되고 손상되지 않은 돼지 심장 모델에서 전기 적 활동을 평가하기 위한 전기 생리학 연구와 함께 이중 방출 광검을 통합합니다.
작은 동물 모델은 더 큰 동물에 비해 유전자 변형 종의 가용성과 낮은 비용으로 인해 심장 혈관 연구에 가장 일반적으로 사용됩니다. 그러나, 더 큰 포유동물은 일반적인 심장 생리학, 병리생리학 및 치료제의 전임상 시험과 관련있는 번역연구 질문에 더 적합합니다. 심장 연구에서 더 큰 동물 모델을 사용하는 것과 관련된 기술적 장벽을 극복하기 위해, 우리는 고립된 랑엔도르프(Langendorff)가 주입한 돼지 심장에서 생리학적 매개 변수를 측정하는 접근법을 설명합니다. 이 접근법은 심장상태를 평가하기 위한 두 가지 강력한 실험 도구를 결합합니다: 전기생리학(EP) 연구와 파라미터 민감한 염료(RH237, Rhod2-AM)를 사용하여 막간 전압과 세포내 칼슘의 동시 광학 매핑. 기재된 방법론은 심장 전도 시스템, 활동 잠재적 형태, 칼슘 취급, 여기 수축 커플링 및 심장 교류의 발생률을 조사하는 번역 연구에 적합합니다. Arrhythmias.
심혈관 질환은 전 세계적으로 질병과 사망의 주요 원인입니다. 이와 같이, 1 차적인 연구 초점은 일반적인 심장 생리학 및 인간에 있는 이환율 그리고 사망에 기여할 수 있는 근본적인 기계장치를 공부하기 위하여 이용될 수 있는 방법론을 낙하하는 것입니다. 기본 심장 혈관 연구는 전통적으로 설치류와토끼를포함한 작은 동물 모델에 의존하고있다1,2,3,때문에 유전자 변형 종의 가용성4,5, 더 낮은 비용, 더 작은 실험 발자국 및 더 높은 처리량. 그러나, 돼지 모델의 사용은 보다 임상적으로 관련된 데이터를 제공할 가능성이있다 6. 실제로, 이전 연구는 인간과 돼지 사이의 심장 전기 생리학 (EP)에서 유사 이온 전류7,동작 전위 모양8및 약리학적시험에대한 반응을 포함하여 9. 더욱이, 돼지 심장은 설치류 또는토끼(10)보다인간과 더 유사한 수축성 및 이완 역학을 가지고 있다. 개 모델에 비해, 돼지 관상 동맥 해부학은 더 밀접하게 인간의 심장과 유사11,12 심장 발달에 초점을 맞춘 연구에 대한 선택의 모델입니다, 소아 심장학 및 / 또는 선천성 심장 결함 13. 돼지와 인간의 심장8사이에 차이가 있지만, 이러한 유사성은 돼지 심장을 심장 혈관 연구를위한 가치있는 모델로14.
심장의 역행 관류는 오스카 랑엔도르프16에의해 처음 설립된 이래로 심장 역학 ex vivo15를 연구하기 위한 표준 프로토콜이 되었다. 따라서, 랑엔도르프 관류는 자율적 영향이 없는 상태에서 고립된, 온전한 심장을 지원하는 데 사용될 수 있다. 이 모델은 심장 전기 생리학과 건강하지 않은 심장 사이의 수축성을 직접 비교하는 데 유용한 도구입니다. 심장 역학은 시간적으로 그리고 공간적으로 복잡하기 때문에, 한 지역에 있는 경미한 변경은 극적으로 syncytium17로 일하는 전체 심혼의 기능에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 파라미터 민감한 염료의 높은 시공간 화상 진찰은 심혼의 표면에 걸쳐 심장 기능을 감시하기 위한 유용한공구18,19. 실제로, 전압 및 칼슘에 민감한 형광 프로브의 동시 이중 이미징은 조직 수준20,21에서전기 활성, 칼슘 처리 및 여기 수축 커플링의 평가를 허용합니다. 22,23,24,25,26,27,28. 랑엔도르프 관류 및/또는 광학 매핑 기술은 이전에 노화 또는 유전 적 돌연변이로 인한 심장 성능 저하를 문서화하고 약리작용제 또는 환경 노출의 안전성을 평가하는 데 사용되었습니다29 ,30,31,32,33.
임상 환경에서, 침략적인 심장 전기 생리학 연구는 수시로 심장 리듬 소요를 조사하고, 병리학을 확인하고, 가능한 처리 선택권을 찾아내기 위하여 이용됩니다. 유사하게, 우리는 부비동 노드 기능을 평가하고, 방실 전도를 측정하고, 심근 조직의 내화성을 확인하는 데 사용될 수 있는 EP 프로토콜을 기술합니다. 기재된 EP 연구는 고립된 심혼에 있는 심장 생리학을 완전하게 특성화하기 위하여 광학 매핑, 또는 안과엽(34)과함께 수행될 수 있다. 기재된 프로토콜에서, 높은 시공간적 분해능 형광 이미징은 이중 방출 설정에서 전압(RH237) 및 칼슘(Rhod-2AM) 염료의 조합으로 수행되었다. 추가적으로, 심장 전기 생리학 파라미터는 부비동 리듬 및 프로그램된 전기 자극에 응하여 둘 다의 밑에 감시되었습니다.
심혈관 연구 모델은 세포에서 생체 내 제제에 이르기까지 다양하지만 임상 관련성과 실험 적 유용성 사이에는 내재된 절충안이 있습니다. 이 스펙트럼에, 고립 된 Langendorff-perfused 심장 심장 생리학 공부에 대 한 유용한 타협 남아48. 전체 심장 모델은 단일 세포 또는 조직 단층보다 더 높은 수준의 기능적 및 구조적 통합을 나타내지만 생체 내 모델과 관련된 혼란스러운 복잡성을 방지합니다. 이중 광학 매핑 실험 중 주요 장점은 분리된 심장의 후피나표면이 관찰될 수 있고, 막 전위와 칼슘 처리의 형광 이미징이 심장 생리학을 모니터링하는데 사용될 수 있다는 것이다34.
설치류 모델은 관련된 모든 요소(예: 용액 부피, 관류 회로, 염료 및 기계적 비커플러 수량)를 업사이징하는 관련 비용으로 인해 더 큰 동물과 는 반대로 고립된 심장 제제에 가장 일반적으로 사용됩니다. 큰 동물10,36,49에서부정맥에 대한 더 큰 불안정성과 성향과 함께. 돼지 하트를 사용하는 한 가지 장점은 구조, 크기 및 수축 속도에 있어 인간의 심장과 밀접하게 유사하므로 관상 동맥 혈류 및 심장 출력과 같은 혈역학적 매개 변수를 보다 정확하게 모델링한다는 것입니다. 마찬가지로, 인간과 돼지는 유사한 칼슘 처리, 심전도 간격37,및12,50,51을나타내는 기본 채널을 포함하는 행동 잠재적 인 형태를 가지고있습니다. 52. 이 프로토콜은 심근 기능을 포괄적으로 특성화하기 위해 재현 가능한 대형 동물 모델을 만드는 단계를 자세히 설명합니다. 확립된 전기 생리학적 프로토콜과 함께 사용되는 막외 전압(RH237)과 세포내 칼슘(Rhod2)의 동시 이미징은 심장 의 변화된 메커니즘을 정확히 파악할 수 있는 기회를 제공합니다. 함수. 기재된 방법론은 전임상 안전성 시험, 독성 학적 스크리닝 및 유전 적 또는 기타 질병 병리의 조사에 사용될 수 있다. 더욱이, 기재된 방법론은 특정 연구포커스53,54,55에따라 다른 심장 모델(예를 들어, 개, 인간)과 함께 사용하기 위해 수정 및 적응될 수 있다.
작은 설치류 모델에서 고립된 전체 심장 준비를 위한 더 큰 돼지 모델로 전환할 때 염두에 두어야 할 몇 가지 중요한 수정 사항이 있습니다. 준비 및 설정 하는 동안, 우리는 온 코 압력을 유지 하 고 부 종 (플러스 안티 폼, 필요한 경우)56,57,58,59를줄이기 위해 향수에 알부민을 추가 하는 것이 좋습니다. 더욱이, 알부민을 함유하는 향수는 또한 매체60,61에지방산 보충을 요구하는 대사 연구에 도움을 주어 도포할 수 있다. 설치류 심장과 는 달리, 더 큰 돼지 심장은 더 나은 온도를 유지하는 관상 동맥 혈관을 통해 흐르는 온난화 매체의 증가 된 부피와 부피의 작은 표면으로 인해 따뜻한 매체에 잠길 필요가 없습니다. 앞서 언급했듯이, 우리는 우심실 내부와 우심실과 좌심실의 후두면 에피나얼 표면에 온도 프로브를 배치하여 연구 기간 동안 세 위치에서 1-2 °C의 약간의 온도 변동만 관찰했습니다. 중요한 것은, 이러한 빠른 유량은 또한 거품과 잠재적 인 색전증의 가능성을 증가시킬 수있다. 이 문제를 우회하려면 대동맥 캐뉼라로 곧장 이어지는 대형 보어 튜브가있는 버블 트랩을 사용하는 것이 좋습니다. 유사 하 게, 우리는 더 큰에 대류를 캐뉼을 위해 함께 작업 하는 두 개인을 가장 유용 발견 (그리고 무거운) 심장; 한 사람은 튼튼한 지혈대와 대류를 열고 다른 하나는 탯줄 테이프를 사용하여 카눌라에 대류를 고정합니다. 설명된 방법론에서, 우리는 심전도 및 제세동을 가진 관류가 설치류 심혼 준비에 반대되는 심장 회복에 생명이었다는 것을 것을을 발견했습니다. 우리의 경험에서, 단지 몇 절제된 마음은 심장 전환없이 정상적인 부비동 구동 활동을 재개.
광학 화상 진찰 끝점을 향상시키기 위하여는, 매달려 심혼 준비는 침수한 심혼으로 생길 수 있는 눈부심의 효력을 제한했습니다. 더욱이, 매달려 있는 심혼은 또한 수직 화상 진찰을 위해 수평으로 심혼을 놓을 때 생길 수 있는 심혼의 후방 양상에 관상 동맥 혈관의 어떤 압축 또는 타협든지 피합니다. 우리는 또한 버블 트랩 (대동맥 캐뉼라에 가까운) 후에 형광 염료를 적재하는 것이 조직 염색 및 광학 신호를 크게 향상시켰습니다. 마지막으로, 심장 전기 생리학 종점을 개선하기 위해, 더 큰 동축 자극 전극의 사용은 성공적인 심방 진행을 촉진. 우리는 다양한 EP 매개 변수에 대한 캡처 및 캡처 손실을 식별하기 위해 심전도의 사용을 설명하지만, 심장 내 카테터 또는 양극성 기록 전극도 사용할 수 있습니다.
우리의 연구 결과는 고립된, 온전한 돼지 심혼 모형에 있는 이중 광학 매핑 및 심장 전기 생리학 평가를 위한 방법론을 개발에 집중되었습니다. 청소년 인간의 심장과 유사성으로 인해 돼지 심장은 소아 심장학 또는 선천성 심장 결함에 초점을 맞춘 연구를위한 인기있는 모델로 남아 있습니다. 중요한 것은, 설명된 접근법은 더 큰 크기의 성인 하트 및/또는 관심의 다른 종과 함께 사용하도록 적응될 수 있다. 실제로, 다른 실험실은 개 또는 인간의 마음 (기증자 또는 병든)의 사용이 그들의 특정 연구 초점53,54,55에더 적용 가능하다는 것을 발견 할 수있다. 이 연구의 또 다른 잠재적 인 제한은 이미징 중에 운동 아티팩트를 줄이기 위해 기계적 비커플러를 사용하는 것입니다. Blebbistatin은 심전도 매개 변수, 활성화 및 내화 기간41,62,63에대한 최소한의 효과로 인해 심장 이미징 응용 분야에서 선택의 비커플러가되었습니다. BDM은 더 많은 양의 이과 및 기계적 비커플러를 필요로 하는 대규모 동물 연구에서 특히 중요할 수 있는 덜 비싼 선택이지만, 작용 잠재력을 바꿀 수 있는 칼륨과 칼슘 전류에 더 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다. 형태64,65,66,67. BDM을 사용하는 경우 APD 단축은 충격 유발 아린스미아스68에대한 심장 취약성을 증가시킨다는 점에 유의하십시오. 반대로, blebbistatin을 사용하는 주요 제한은 광과민성 및 광독성이지만 이러한 효과를 감소시킨 대체 제형은69,70,71입니다. 마지막으로, 설명된 방법론은 이중 광학 매핑 실험을 위해 단일 카메라 시스템을 활용하지만 심실 세동 및/또는 상피 표면에서 전기파 추적에 초점을 맞춘 연구 결과에 유의해야 합니다. 다른 사람에 의해 설명 된 대로 3 차원 파노라마 이미징을 포함 하기 위해이 접근 방식을 수정 해야15,19,72,73,74, 75 .
The authors have nothing to disclose.
저자들은 매튜 케이 박사에게 유용한 실험지도를, 마넬 라마단과 무하이민 차우두리가 기술 지원을 해주신 것을 감사하게 도모합니다. 이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 지원되었다 (NGP에 R01HL139472, R01 HL139712 NI에), 어린이 연구소, 어린이 국립 심장 연구소와 소아 외과 혁신을위한 셰이크 자이드 연구소.
(-)-Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560-5MG | Mechanical Uncoupler |
2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753-100G | Mechanical Uncoupler |
Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9418 | |
Analog signal interface | emka Technologies | itf16USB | |
Antifoam | Sigma-Aldrich | A5758-250ML | |
Antifoam Y-30 Emulsion | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A5758 | |
Aortic cannula, 5/16” | Cole-Parmer | 45509-60 | |
Bubble trap | Sigma-Aldrich | CLS430641U-100EA | |
CaCl2 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | C77-500 | |
Camera, sCMOS | Andor Technology | Zyla 4.2 PLUS | |
Coaxial stimulation electrode (atria) | Harvard Apparatus | 73-0219 | |
Defibrillator | Zoll | M Series | |
Dichroic mirror | Chroma Technology | T660lpxrxt-UF2 | |
Differential amplifier | Warner Instruments | DP-304A | |
Emission filter, calcium | Chroma Technology | ET585/40m | |
Emission filter, voltage | Chroma Technology | ET710lp | |
EP stimulator (Bloom) | Fisher Medical | DTU-215B | |
Excitation filter | Chroma Technology | CT510/60bp | |
Excitation lights | Thorlabs | SOLIS-525C | |
Filter | McMaster-Carr | 8147K52 | |
Filter cartridge, polypropylene | Pentair | PD-5-934 | |
Filter housing | McMaster-Carr | 9979T21 | |
Flow transducer | Transonic | ME6PXN | |
Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 158968 | |
Heating coil | Radnoti | 158821 | |
Hemofilter | Hemocor | HPH 400 | |
Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 501326 | |
Image Splitter | Cairn Research | OptoSplit II | |
KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P3911 | |
KH2PO4 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | 423-316 | |
Large-bore tubing, I.D. 3/8” | Fisher Scientific | 14-169-7H | |
Lens 50 mm, 0.95 f-stop | Navitar | DO-5095 | |
Metamorph | Molecular Devices | Image Alignment | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M-7506 | |
Mucasol detergent | Sigma-Aldrich | Z637181-2L | |
Na Pyruvate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P2256 | |
NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S-3014 | |
NaHCO3 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S-233 | |
Needle Electrodes 29 gauge, 2 mm | AD Instruments Inc. | MLA1204 | |
Noise eliminator | Quest Scientific | Humbug | |
Perfusion pump | PolyStan | A/S 1481 | |
Pressure transducer | World Precision Instruments | BLPR2 | |
Reservoir, 2 liter | Cole-Parmer | UX-34541-07 | |
RH237 | AAT Bioquest Inc. | 21480 | |
Rhod2-AM | AAT Bioquest Inc. | 21062 | |
Stimulation electrode (ventricle) | Harvard Apparatus | 73-0160 | |
Surgical Suture | McKesson Medical-Surgical | 890186 | |
Transducer amplifier | World Precision Instruments | TBM4M | |
Tubing flow console | Transonic | TS410 | |
Umbilical tape | Jorvet | J0025UA | |
Water bath/circulator | VWR | 89400-970 | |
Surgical Tools | |||
Bandage shears | Harvard Apparatus | 72-8448 | Lister Bandage Scissors, Angled, Blunt/Blunt, 42.0mm blade length, 17.0 cm |
Electrocautery | Dalwha Corp. Ltd. | BA2ALD001 | Model: 200 Basic |
Hemostat | Roboz | RS-7476 | St Vincent Tube Occluding Forceps |
Hemostatic forceps | Harvard Apparatus | 72-8960 | Hartmann Hemostatic Forceps, Curved, Serrated 2.2 mm tip width, 9.5 cm |
Hemostats | Harvard Apparatus | 72-8985 | Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Curved, Serrated, 2mm tip 14cm |
Mayo scissors | WPI | 501749 | 14.5 cm, Straight |
Metzenbaum scissors | WPI | 501747 | 11.5 cm, Straight |
Mosquito forceps | Harvard Apparatus | 72-8980 | Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Straight, Smooth, 2mm tip width 12cm |
Needle holder | Harvard Apparatus | 72-8828 | Webster Needle Holders, Straight, Smooth,13.0 cm overall length |
Pediatric cross clamp | Roboz | RS-7660 | Cooley-Derra Clamp 6.25" 5mm Calibrations |
Right angle forceps | WPI | 501240 | Baby Mixter Hemostatic Forceps, 14cm, Right Angle |
Scalpel | Ted Pella | 549-4 | Scalpel Handle No. 4, 13.7cm Stainless Steel and 10 No. 22 Blades |
scissors | Harvard Apparatus | 72-8380 | Operating Scissors, Straight, Blunt/Blunt, 42mm blade,12cm |
Straight Serrated forceps | WPI | 500363 | Dressing Forceps 15.5cm |
Towel clamp | WPI | 501700 | Backhaus Towel Clamp, 13cm, Curved, Locking handle, SS |
Weitlaner retractor | WPI | 501314 | Weitlaner Retractor, Self-Retaining, 10.2cm, 2×3 Sharp Prongs |
Disposables | |||
3-0 prolene suture | Various vendors | Various vendors | |
Vessel loop | Aspen surgical | 011001PBX | Sterion® Vessel Loop, 0.8 x 406mm |
Cardioplegia (Plegisol) | Pfizer | 00409-7969-05 | Plegisol; St Thomas crystalloid cardioplegia solution 20ml/kg |
Heparin | Various vendors | Various vendors | 300 U/kg |
Syringe and Needle | Various vendors | Various vendors | 60mL & 18G respectively |
Umbilical tape | Ethicon | U12T |