Мембрана зрелой адипоцита агрегированной культуры (MAAC) является новым методом для культуры зрелых человеческих адипоцитов. Здесь мы подробно, как изолировать адипоциты от человеческого жирового и как создать MAAC.
Дисрегуляция белой жировой ткани (WAT) играет центральную роль в развитии резистентности к инсулину и диабета 2 типа (T2D). Для разработки новых методов лечения T2D требуются более физиологически значимые модели in vitro adipocyte. Это исследование описывает новую технику изолировать и культуры зрелых адипоцитов человека. Этот метод озаглавлен MAAC (мембранная зрелая адипоцитная агрегированная культура), и по сравнению с другими моделями adipocyte in vitro, MAAC обладает адипогенной генной подписью, которая является самой близкой к свежеизолированным зрелым адипоцитам. Использование MAAC, адипоциты могут быть культивированы из худой и ожирением пациентов, различных жировые склады, совместно культурные с различными типами клеток, и что важно, может храниться в культуре в течение 2 недель. Функциональные эксперименты также могут быть выполнены на MAAC, включая поглощение глюкозы, липогенез, и липоиз. Кроме того, MAAC решительно реагирует на разнообразный фармакологический агонизм и может быть использован для изучения фенотипических изменений адипоцитов, включая трансдифферециацию белых адипоцитов в коричнево-подобные жировые клетки.
Во всем мире рост ожирения и связанных с ожирением сопутствующих заболеваний требует разработки новых терапевтических препаратов. Белая жировая ткань (WAT) является важным регулятором метаболизма всего тела, энергетического гомеостаза, и является центральным игроком в развитии резистентности к инсулину и диабета 2 типа (T2D)1,2. Во время хронического избыточного потребления калорий, адипоциты увеличиваются, чтобы справиться с избытком энергии. Тем не менее, адипоцитов липидной емкость может стать превышен, в результате чего повышение циркулирующих уровней жирных кислот и увеличение хранения в периферических нежирных тканей и приводит к липотоксичности3,4.
Отсутствие адипоцитов в пробирке моделей с высокой трансляционной актуальности является ключевой задачей в разработке новых методов лечения ожирения и T2D. Ex vivo explant модель, где маленькие кусочки жировой ткани культивируются, связана с быстрыми изменениями в экспрессии адипогенных генов, вызванных гипоксией и воспалением5,6. Потолочные культуры (CCs), где зрелые адипоциты плавают и придерживаться верхней части медиа заполненные колбы, быстро дедифференцировать в фибробластоподобных клеток, не хватает липидов7,8,9,10. Наиболее часто используемой моделью является адипоциты, дифференцированные в пробирке от совершенных прекурсоров. Дифференцированные клетки, однако, морфологически отличаются от зрелых адипоцитов in vivo, так как они гораздо меньше по размеру и не имеют неилоглазной липидной капли. Другие ограничения с этой моделью включают нефизиологическую потребность химического коктейля для диска дифференциации, а также изменчивость в эффективности дифференциации, которые могут быть затронуты рядом факторов11,12,13,14.
Недавно мы разработали мембраны зрелой адипоцитовой агрегированной культуры (MAAC), метод для долгосрочной культуры свежеизолированных зрелых адипоцитов, где адипоциты культивируются под проницаемыми мембранами10. Непредвзятый анализ данных секвенирования РНК показал, что по отношению к жировой ткани explants и in vitro-дифференцированных адипоцитов, MAAC больше всего похож на свежеизолированные адипоциты. MAAC может быть использован для культуры зрелых адипоцитов, изолированных как от подкожной, так и из висцеральной жировой ткани, а также адипоцитов как от тучных, так и от худых предметов. Эта методология позволяет изучать долгосрочные фенотипические изменения адипоцитов и облегчает совместное выращивание адипоцитов с другими типами клеток. Здесь мы предоставляем подробный протокол для изоляции зрелых адипоцитов от жировой ткани человека и как настроить систему MAAC.
Мембрана зрелой адипоцита агрегированной культуры (MAAC) является новым методом для долгосрочной культуры свежеизолированных зрелых адипоцитов. При настройке MAAC есть несколько критических шагов в протоколе, которые значительно влияют на урожайность, качество и жизнеспособность зрелых адипоцитов. Много усилий должно быть приложено в фарш жира в шаге 3.2, так как этот шаг непосредственно влияет на количество времени адипоцитов подвергаются коллагенеза. Если кусочки жировой ткани слишком велики, время пищеварения должно быть увеличено, что негативно влияет на жизнеспособность клеток. И наоборот, если ткань обрабатывается слишком мелко ножницами, жизнеспособность может быть затронута также. Для успешной культуры зрелых адипоцитов как MAAC следует уделить особое внимание следующим шагам: для успешного посева адипоцитов на мембраны, крайне важно, чтобы свободный липидный и переносной буфер для мытья выдался из зрелых адипоцитов в шагах 5.3 и 5.4. Оставшийся липидный или моющий буфер снизит поверхностное натяжение адипоцитов и увеличит риск того, что адипоциты высваивают мембраны, когда они переворачиваются. Когда адипоциты посеяны и в средствах массовой информации, клетки остаются в контакте с мембраной в первую очередь через плавучесть, таким образом, медленный и нежный метод рекомендуется при изменении среды, чтобы не потерять клетки. Удалите носители из нижней части скважины, как описано в шаге 7.1 и добавить средства массовой информации медленно pipetting средств вниз по бокам стен. Наконец, экономия времени предложение заключается в том, чтобы подготовить пластины со средствами массовой информации и лечения до процесса изоляции адипоцитов. Особенно для сложных экспериментальных конструкций, предварительной подготовки пластин может сэкономить много времени и гарантирует, что адипоциты помещаются в средствах массовой информации с их лечения, как только они изолированы.
Одним из преимуществ использования MAAC по сравнению с дифференциацией preadipocytes является то, что MAAC сми используется очень просто и не требует нефизиологического гормона коктейль. Здесь мы культивировали MAAC в богатых глюкозой сми (DMEM/F12), 10% FBS, 1% пенн/стреп, и 20 нм инсулина. Важно отметить, что мы обнаружили, что инсулин абсолютно необходим для розиглитазона / pioglitazone приводом индукции UCP110. Инсулин, однако, не требуется для поддержания адипогенного фенотипа клеток. Таким образом, в зависимости от экспериментального вопроса, инсулин может быть включен или опущен.
Процедура, описанная выше, была оптимизирована для изоляции и культуры адипоцитов человека. Тем не менее, мышь, и, возможно, адипоциты другого организма, также могут быть культивированы как MAAC. Если мыши адипоцитов должны быть культивированы как MAAC Есть дополнительные соображения и меры предосторожности, которые следует иметь в виду. Мы обнаружили, что зрелые адипоциты мышей гораздо более хрупкие, чем у людей. В результате время пищеварения должно быть сокращено до абсолютного минимума, чтобы повысить жизнеспособность клеток. Мы также обнаружили, что адипоциты молодых мышей (8-недельных и молодых) дали наиболее надежные и воспроизводимые результаты. Наконец, мышь MAAC может быть культивируется на срок до одной недели, однако, учитывая, что их адипогенный фенотип кажется менее стабильным, чем люди (которые могут быть культивированы в течение по крайней мере две недели) мы рекомендуем культивирование мыши MAAC для минимального необходимого времени для решения экспериментальные вопросы.
Поскольку модель MAAC основана на использовании проницаемых мембран, одним из преимуществ этого метода является возможность совместного культивирования зрелых адипоцитов с другими типами клеток. Ранее мы продемонстрировали способность зрелых адипоцитов и макрофагов перекрестный разговор с помощью MAAC10. Это открывает возможности для дальнейшего изучения связи между ожирением, резистентность к инсулину, и иммунные реакции15,16,17. Будущие эксперименты могут включать другие типы клеток, такие как гепатоциты, предипоциты, эндотелиальные клетки или клетки поджелудочной железы, чтобы еще больше увеличить сложность и переводственную значимость модели MAAC и исследовать перекрестный разговор между несколькими типами клеток.
Несмотря на то, что MAAC, как было показано, превосходит функциональность и идентичность адипоцитов по сравнению с другими моделями adipocyte in vitro, он также имеет ограничения, которые необходимо учитывать. По сравнению с использованием адипоцитов, отличающихся от клеток-предшественников, MAAC является более трудоемкой и трудоемкой моделью. Плиты с мембранами также дороже по сравнению с обычными пластинами клеточной культуры. Важно отметить, что зрелые адипоциты должны быть свежеизолированы каждый раз при посеве и не могут быть расширены или заморожены в запасы, такие как клетки-предшественники. Таким образом, это требует доступа к свежим белым образцам жировой ткани, но также добавляет уровень сложности, вытекающих из донора донора к донору вариации.
Здесь мы представили подробный протокол для изоляции зрелых адипоцитов человека и создания MAAC. Мы показали, что адипоциты, культивированные как MAAC, остаются жизнеспособными в течение двух недель, их адипогенная генная подпись сохраняется, и они реагируют на разнообразный фармакологический агонизм. Использование MAAC позволяет изучать кросс-говорить betweeen адипоцитов и других типов клеток, а также оценки долгосрочных фенотипических изменений зрелых адипоцитов в ответ на различные стимулы.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Сяо-Ронг Пэн и Стефана Халлена за предоставление ресурсов и оптимизацию изоляции адипоцитов, Мартина Урблома за техническую помощь, а Даниэля Олауссона и Малин Лённ за координацию и предоставление человеческого угрюмого.
Autoclaved scissors | |||
Autoclaved spoons | |||
Autoclaved tweezers | |||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
Buffer RLT | QIAGEN | 79216 | Lysis buffer |
CaCl2*2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | |
Conical tubes, 50 mL | |||
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm | Thermo Scientific | 156-4020 | 500 mL |
Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm | Thermo Scientific | 158-0020 | 1000 mL |
HBSS+CaCl2+MgCl2 | Gibco | 14065-49 | |
HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
Insulin (Actrapid Penfill) | Novo Nordisk A/S | ||
KCl | Merck | 104936 | |
KH2PO4 | Merck | 104873 | |
Medium 199 | Gibco | 10012-011 | |
Mesh filter (250 µM) | Sintab AB | 6111-025043 | |
MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Needles, 18G, 1.20×40 mm | Sterican | 613-2948 | |
Pencillin-Streptomycin (Penn/Strep) | Gibco | 15140 | |
Petri dishes, 150×21 mm | Thermo Scientific | 168381 | |
Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
Quantstudio 7 Flex Real-Time PCR machine | Applied Biosystems | ||
RNeasy Mini kits | QIAGEN | 74106 | |
Separation funnel | VWR | 527-0008 | For large scale preparation |
Separation funnel | VWR | 527-0005 | For small scale preparation |
Shaking incubator (37 °C) | |||
Syringes, 5 mL | Omnifix | 612-2892 | 100 st |
Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
Transwells, 24-well (6,5 mm) | Costar | 3397 | Permeable membrane inserts |
TRIzol reagent | Invitrogen | 10296010 | Lysis buffer |
Type 2 Collagenase | Worthington | LS004177 |