Summary
膜成熟脂肪细胞聚集培养（MAAC）是培养成熟人类脂肪细胞的新方法。在这里，我们详细介绍了如何从人类脂肪中分离脂肪细胞，以及如何设置MAAC。
Abstract
白色脂肪组织 （WAT） 调节障碍在胰岛素抵抗和 2 型糖尿病 （T2D） 的发展中起着核心作用。为了开发T2D的新疗法，需要更具有生理相关性的体外脂肪细胞模型。本研究描述了一种分离和培养成熟的人类脂肪细胞的新技术。该方法名为MAAC（膜成熟脂肪细胞聚集培养），与其他腺细胞体外模型相比，MAAC具有最接近新分离的成熟腺细胞的腺基因特征。使用MAAC，可以从瘦和肥胖患者培养脂肪细胞，不同的脂肪库，与不同的细胞类型共同培养，重要的是，可以在培养中保存2周。功能实验也可以对MAAC进行，包括葡萄糖的摄入、脂质生成和脂质化。此外，MAAC对各种药理学痛苦有强烈反应，可用于研究脂肪细胞型异型变化，包括将白蛋白细胞转分化为棕色脂肪细胞。
Introduction
全世界肥胖和肥胖相关共同疾病的增加使得新的治疗方法需要开发。白脂肪组织（WAT）是全身代谢、能量平衡的重要调节剂，是胰岛素抵抗和2型糖尿病（T2D）1、2型发展的核心作用者。在长期过量的卡路里消耗期间，脂肪细胞放大以处理能量过剩。然而，脂质脂质的储存能力可能会超过，导致脂肪酸的循环水平升高，增加周围非脂肪组织的储存，并导致脂毒性3，4。
缺乏具有高转化相关性的体外细胞模型是开发肥胖和T2D新疗法的关键挑战。前体外植模型，其中小片脂肪组织被培养，与由低氧和炎症5，6驱动的腺基因表达的快速改变相关。天花板培养物（CC），其中成熟的脂肪细胞漂浮并粘附在充满介质的烧瓶的顶部，迅速分化成纤维细胞状细胞，缺乏脂质7、8、9、10。最常用的模型是在体外与已提交前体区分的脂肪细胞。然而，分化的细胞在形态上不同于体内成熟的脂肪细胞，因为它们体积小得多，而且缺乏一个未分离的脂质滴。该模型的其他局限性包括非生理上需要化学鸡尾酒来推动分化，以及分化效率的可变性，这可能受多种因素11、12、13、14的影响。
我们最近开发了膜成熟腺细胞聚合培养（MAAC），这是一种用于新分离的成熟腺细胞的长期培养方法，其中腺细胞在透膜10下培养。对RNA测序数据的无偏见分析表明，相对于脂肪组织外植和体外分化的脂肪细胞，MAAC最类似于新鲜分离的腺细胞。MAAC可用于培养从皮下和内脏脂肪组织分离的成熟脂肪细胞，以及肥胖和瘦受试者的脂肪细胞。该方法允许研究长期的腺细胞型型变化，并促进其他细胞类型的腺细胞与其他培养。在这里，我们提供了一个详细的协议，从人类脂肪组织分离成熟的脂肪细胞，以及如何建立MAAC系统。
Protocol
在瑞典哥德堡的萨尔格伦斯卡大学医院，从接受选择性手术的女性患者的腹部区域收集了匿名的脂肪组织样本。所有研究对象在书面知情同意使用组织之前，都收到了书面和口头信息。这些研究得到了瑞典哥德堡区域道德审查委员会的批准。
注：图1提供了该方法的概述。
1. 制备缓冲液、组织培养和培养板
- 在 900 mL 水中溶解 35.1 g 的 NaCl、1.75 g KCl、0.82 g KH2PO4和 1.48 g MgSO4+7H2O，制备 5x 克雷布斯环角 （KR） 库存。加入 1.84 g 的 CaCl2±2H2O，通过加水将音量调节到 1 L。通过 0.22 μm 过滤器进行无菌过滤器，并储存在 4°C 下。
- 从 5x KR 库存中，制备 1 L 的缓冲液，其中包含 1x KR、25 mM HEPES、2 mM 葡萄糖和 2% 牛血清白蛋白 （BSA）（以下简称洗涤缓冲液）。将 pH 调整到 7.4。
- 制备含有 1x HBSS + CaCl2 + MgCl2、2% BSA 和 450 mL 水的胶原酶缓冲液 500 mL（以下简称消化缓冲液）。
注：在步骤2.2中称量脂肪组织后，不应将胶原酶添加到消化缓冲液中。 - 将中等 199 的 pH 度调整为 7.4。
- 无菌过滤器缓冲液和介质199通过0.22 μm滤瓶加热至37°C。
注：为了节省时间，在加工脂肪组织之前，可以准备组织培养培养，并将其添加到板中。对于 24 孔板格式（图 1A），使用 0.5⁄1 mL/孔 Dulbecco 的改良 Eagle 的介质/Ham 的营养混合物 F12 （DMEM/F12）、10% 胎儿牛血清 （FBS）、1% 青霉素-链霉素 （彭/链球菌） 和 20 nM 胰岛素。小分子和其他稳定的药理剂也可以在这个时候添加到介质在所需的布局。将板放入组织培养箱（37°C，5% CO2）。
2. 解剖人体皮下脂肪组织
注：在生物安全柜内工作，在整个隔离过程中使用无菌技术，以及独家使用高压灭菌和无菌设备。
- 将人体脂肪组织放入15厘米培养皿中，加入少量中等199，使其在解剖过程中保湿。
- 使用大约高尔夫球大小的脂肪片，用钳子抓住大型纤维化容器，并通过用封闭剪刀的背面刮擦脂肪来轻轻释放脂肪细胞。丢弃大块纤维化组织。称量修剪的脂肪。
3. 胶原酶治疗
- 将胶原酶加入消化缓冲液（参见步骤1.3），浓度为1mg/mL。使用 0.22 μm 无菌过滤器对溶液进行无菌过滤。
注：建议每克脂肪3 mL的消化缓冲液（即，对于100克脂肪，用300mg的2型胶原酶制备300 mL的消化缓冲液）。
注意：2型胶原酶对眼睛、皮肤有害，并可能导致呼吸道刺激。处理胶原酶时，请戴上手套、护目并工作在通风罩中工作。 - 将大约 10 克脂肪组织移动到 15 厘米培养皿中，用一把弯曲的剪刀仔细切碎脂肪，直到它变成平滑的均匀混合物，并且没有大块的脂肪。重复此过程，直到处理所有脂肪。
注：每轮大约需要2分钟，脂肪片应足够小，以便可以使用宽孔移液器尖端移液。这一步对于产生高质量的脂肪细胞至关重要。如果碎片太大，消化时间将不得不延长，损害细胞的通力。 - 使用勺子将切碎的脂肪转移到 50 mL 锥形管中。在每个管中加入10 mL的切碎组织和30 mL的消化缓冲液。如果可用的切碎脂肪量小于 10 mL，则可缩小至适当的体积。
- 在37°C下在摇动的培养箱中消化组织，在150rpm下持续搅拌30-45分钟。30分钟后，每5分钟检查一次，以避免过度消化。
注：当脂肪溶液均匀且没有任何大块且具有杏色时，消化完成。
4. 细胞悬浮物的过滤和成熟蛋白细胞的纯化
- 将漏斗放在 1 L 无菌烧瓶的顶部，并在漏斗内放置无菌 250 μm 网状过滤器。将消化的脂肪溶液倒入过滤器中，以去除未消化的组织。
- 当所有的脂肪细胞悬浮液都通过过滤器时，轻轻挤压网状过滤器以增加脂肪细胞的产量。将大约 50~100 mL 的洗涤缓冲液倒入过滤器中冲洗，然后再次挤压滤清器。
- 将从烧瓶中分离的脂肪悬浮液倒入分离漏斗中，并添加洗涤缓冲液，直到漏斗几乎完全填满。轻轻地反转漏斗几次，将脂肪细胞悬浮液与缓冲液混合。
- 让悬浮液站立2⁄3分钟，直到有2层的明显分离（图1B），顶部黄色层包含成熟的脂肪细胞和自由脂质，底部层包含缓冲液和脂肪频闪血管分数（SVF）。
- 打开分离漏斗上的喷嘴，将底部溶液慢慢排入无菌烧瓶（SVF中的细胞可在离心后以200 x g进行7分钟）进行颗粒和收集）。在分离漏斗中保留与成熟脂肪细胞的顶层。
- 在步骤 4.3_4.5 中重复洗涤过程三次，彻底洗涤成熟的脂肪细胞并去除所有胶原酶。
5. 成熟蛋白细胞的包装
- 打开喷嘴，将纯化的成熟脂肪细胞悬浮液收集到 50 mL 锥形管中。
- 通过以 50 x g旋转管 3 分钟，轻轻包装成熟的脂肪细胞。
- 使用 18 G 针头和注射器去除脂肪细胞悬浮液下方的剩余洗涤缓冲液。
- 使用移液器去除漂浮在成熟脂肪细胞顶部的游离脂质层（在隔离过程中破裂的一小部分脂肪细胞中的油）。
注：为了降低在步骤 6.5 中脂肪细胞从膜上滴出的风险，当成熟的脂肪细胞播种到膜上时，必须去除脂质层和所有洗涤缓冲液。因此，在3个管中收集脂肪细胞。最后收集的样本将具有最多的结转脂质，因此质量最低。但是，通过仔细移液，可以使用这些样品。
6. 成熟蛋白细胞的种子
- 打开含有渗透膜插入物的包装（材料表），并拿出膜组件。翻转它，并放置在无菌表面，使膜面对天花板。
- 将30 μL的包装成熟脂肪细胞移液到每个膜上（图1C）。避免用尖端接触膜。使用宽孔移液器吸头将细胞播种，或使用剪刀剪下一小块移液器尖端，使其更宽。
- 在整个播种过程中，用包装的脂肪细胞多次轻轻反转 50 mL 管，以确保不同尺寸的脂肪细胞均匀分布。
- 将装有介质的多孔板从培养箱带到生物安全柜，并取下盖子。拿起用脂肪细胞播种的膜，从底部抓住它，以便它可以在步骤6.5中倒置。
- 在一个平滑的运动中，将膜与顶部的脂肪细胞反转，使种子的脂肪细胞现在朝下（图1D）。将带脂肪细胞的板放入装有介质的孔中（图1E）。
- 将盖子放在盘子上，小心地将板转移到组织培养箱中。避免板的快速移动，因为最初很容易去除脂肪细胞。
注：细胞需要几天才能更牢固地粘附在膜上。
7. 维护脂肪细胞和分析收获
- 至少每 7 天更换一次媒体。通过每个膜插入件中的切口孔拆下并添加介质。要取出介质，请使用注射器和针头、吸气棒或带 p200 尖端的移液器。要添加介质，请使用移液器，并缓慢地将新媒体移入墙边，以避免干扰脂肪细胞。
注： 脂肪细胞已培养 2 周，7 天后更换一次介质。然而，不同的脂肪来源和实验问题可能受益于增加的介质变化。 - 要收获RNA，如步骤7.1所述，去除培养物，并将500μL的液化缓冲液（材料表）直接加入井中，以对细胞进行分液。要修复细胞进行成像，请以1%的最终浓度将甲醛直接添加到井中。
注：然后细胞可以储存在4°C。
Representative Results
作为 MAAC 培养的成熟脂肪细胞可保持其功能、表型，并可用于研究脂肪细胞对各种药理治疗的反应。从皮下脂肪组织分离出1周培养MAAC后，维持仅在成熟脂肪细胞中发现的特征未节血脂滴（图2A）。MAAC在用PPARé® 激动剂rosiglitazone（罗西）和皮奥列酮（Pio）或糖皮质激素受体（GR）激动剂地塞米松（Dex）进行治疗时，进行1周的治疗，以确定不同的核激素受体（NHR）激动剂是否驱动预测MAAC下游目标基因的变化。罗西和皮奥将PPAR®反应基因FABP4和LPL的表达分别增加了4倍和2⁄3倍，而地塞米松没有效果（图2B）。同样，地塞米松将GR靶基因APOD和FKBP5的基因表达分别驱动了13倍和55倍，而PPAR®激动剂则没有显著作用。我们之前已经证明，新鲜分离的人类成熟白蛋白细胞可以转分化成棕色样的表型在MAAC时，治疗与Rosi10。用Rosi或Pio进行7天的治疗，将棕色脂肪特异性基因UCP1的基因表达诱导44-65倍，并增加棕色脂肪标记PDK4 12-18倍（图2C）的表达。
图 1：MAAC 设置的可视化图。（A） 介质的准备.（B） 成熟脂肪细胞的分离和包装.（C） 将成熟的脂肪细胞播种到膜上.（D） 反转膜，同时保持脂肪细胞连接。（E） 将膜降低到介质中并改变介质。这个数字已由哈姆斯等人10修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：MAAC在一周内保持不象样的外观，并应对各种药理学的疼痛。（A） 代表 MAAC 的 4 倍和 10 倍明亮场图像经过一周的文化。平均直径为100μm且具有大的未孔脂液滴的脂肪细胞很容易分辨。（B） PPAR® 靶向基因和糖皮质激素受体 （GR） 靶基因的 mRNA 水平在 MAAC 中经过 7 天的处理，使用车辆 （Vehc）、罗格列酮 （Rosi）、皮格列酮 （Pio） 或地塞米松 （Dex）。Rosi、Pio和Dex在用车载（Vehc）、罗西格列酮（罗西）、皮格列酮（Pio）或地塞米松（Dex）治疗7天后，在MAAC中最终浓度为10μM（C）mRNA水平的棕色脂肪富集基因。罗西、皮奥和德克斯均以10μM的最终浓度使用。对于所有基因表达数据，TATA结合蛋白（TBP）被用作内部规范化控制。使用单向方差分析与图基的多重比较测试计算统计数据。（均值 = SD，n = 3，\p < 0.05;\p < 0.01;\p < 0.001）。请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
膜成熟脂肪团聚集培养（MAAC）是新分离成熟腺细胞长期培养的新方法。在设置 MAAC 时，协议中有几个关键步骤，这些步骤极大地影响了成熟蛋白细胞的产量、质量和生存能力。在步骤3.2中，应该付出很多努力来切碎脂肪，因为这个步骤直接影响到蛋白酶暴露于胶原酶的时间。如果脂肪片过大，消化时间将不得不延长，这对细胞的生存能力产生负面影响。相反，如果组织用剪刀处理得太精细，生存能力也会受到影响。对于作为 MAAC 的成熟脂肪细胞的成功培养，应特别注意以下步骤：为了成功地将脂肪细胞播种到膜上，从成熟的脂肪细胞中去除游离脂质和结转洗涤缓冲液至关重要在步骤 5.3 和 5.4 中。剩余的脂质或洗涤缓冲液将降低脂肪细胞的表面张力，并增加脂肪细胞在翻转膜时滴出膜的风险。当蛋白细胞被播种并在介质中时，细胞主要通过浮力与膜接触，因此，在改变介质以不失去细胞时，建议采用缓慢而温和的技术。如步骤 7.1 所述，从井底取下介质，并通过缓慢移液介质从墙壁两侧移移来添加介质。最后，一个节省时间的建议是在脂肪细胞分离过程之前用介质和治疗准备板。尤其对于复杂的实验设计，预准备板可以节省大量时间，并确保在分离后立即将脂肪细胞与介质一起置于介质中进行治疗。
与区分preadipo细胞相比，使用MAAC的一个好处是使用MAAC介质非常简单，不需要非生理激素鸡尾酒。在这里，我们在富含葡萄糖的介质 （DMEM/F12）、10% FBS、1% 便士/链球菌和 20 nM 胰岛素中培养了 MAAC。重要的是，我们发现胰岛素是绝对需要的罗西格列酮/皮格列酮驱动诱导UCP110。胰岛素，但是，不要求保持细胞的副体性表型。因此，根据实验问题，胰岛素可以包括或省略。
上述详细程序已针对人类脂肪细胞的隔离和培养进行了优化。然而，小鼠，可能还有其他生物体的脂肪细胞，也可以培养为MAAC。如果要将小鼠脂肪细胞培养为 MAAC，则应牢记其他注意事项和预防措施。我们发现，来自小鼠的成熟脂肪细胞比来自人类的成熟脂肪细胞要脆弱得多。因此，消化时间应缩短到绝对最小，以增加细胞活力。我们还发现，来自幼鼠（8周及小）的脂肪细胞提供了最健壮和可重复的结果。最后，小鼠MAAC可以培养长达一个星期，但是考虑到它们的机敏表型似乎不如人类稳定（这可以通过至少两周培养），我们建议在最短的时间内培养小鼠MAAC，以最少的需要时间解决实验问题。
由于MAAC模型基于使用渗透膜，该技术的一个优点是有可能与其他细胞类型共同培养成熟的腺细胞。我们之前已经证明了成熟的脂肪细胞和巨噬细胞的能力，通过使用MAAC10串扰。这为进一步探讨肥胖、胰岛素抵抗和免疫反应之间的联系提供了机会。未来的实验可以合并其他细胞类型，如肝细胞、肝细胞、内皮细胞或胰腺细胞，以进一步提高MAAC模型的复杂性和转化相关性，并研究多种细胞类型之间的串扰。
尽管MAAC已被证明在保持脂肪细胞的功能和特性方面优于其他体外细胞，但它也有需要考虑的局限性。与使用与前体细胞区别开来的脂肪细胞相比，MAAC是一种更费力和费时的模型。与常规细胞培养板相比，带膜的板也更昂贵。重要的是，成熟的卵波细胞需要在播种时每次被新鲜分离，不能扩大或冷冻成前体细胞等种群。因此，这需要获得新鲜的白色脂肪组织样本，但也增加了从捐赠者到捐赠者变异的复杂性。
在这里，我们提出了一个详细的协议，用于分离人类成熟的脂肪细胞和设置MAAC。我们已经证明，作为MAAC培养的脂肪细胞在两周内仍然存活，其腺基因特征得以保存，并且它们对各种药理学的疼痛做出反应。使用MAAC可以研究串扰性细胞和其他细胞类型，并评估成熟腺细胞在响应不同刺激时的长期型板体变化。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢彭小荣和斯特凡·哈伦提供资源并优化脂肪细胞隔离，马丁·乌勒博姆提供技术援助，丹尼尔·奥劳森和马林·伦协调和提供人类脂肪。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclaved scissors | |||
| Autoclaved spoons | |||
| Autoclaved tweezers | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Buffer RLT | QIAGEN | 79216 | Lysis buffer |
| CaCl2*2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Conical tubes, 50 mL | |||
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm | Thermo Scientific | 156-4020 | 500 mL |
| Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm | Thermo Scientific | 158-0020 | 1000 mL |
| HBSS+CaCl2+MgCl2 | Gibco | 14065-49 | |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Insulin (Actrapid Penfill) | Novo Nordisk A/S | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| Medium 199 | Gibco | 10012-011 | |
| Mesh filter (250 µM) | Sintab AB | 6111-025043 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Needles, 18 G, 1.20 mm x 40 mm | Sterican | 613-2948 | |
| Pencillin-Streptomycin (Penn/Strep) | Gibco | 15140 | |
| Petri dishes, 150 mm x 21 mm | Thermo Scientific | 168381 | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Quantstudio 7 Flex Real-Time PCR machine | Applied Biosystems | ||
| RNeasy Mini kits | QIAGEN | 74106 | |
| Separation funnel | VWR | 527-0008 | For large scale preparation |
| Separation funnel | VWR | 527-0005 | For small scale preparation |
| Shaking incubator (37 °C) | |||
| Syringes, 5 mL | Omnifix | 612-2892 | 100 st |
| Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
| Transwells, 24-well (6.5 mm) | Costar | 3397 | Permeable membrane inserts |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 10296010 | Lysis buffer |
| Type 2 Collagenase | Worthington | LS004177 |
References
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