Membran modne adipocyte samlede kultur (MAAC) er en ny metode til kultur modne menneskelige adipocytter. Her beskriver vi, hvordan du isolerer adipocytter fra menneskelig fedt, og hvordan du konfigurerer MAAC.
Hvid fedtvæv (WAT) dysregulering spiller en central rolle i udviklingen af insulinresistens og type 2 diabetes (T2D). For at udvikle nye behandlinger for T2D kræves der mere fysiologisk relevante in vitro adipocytemodeller. Denne undersøgelse beskriver en ny teknik til at isolere og kultur modne menneskelige adipocytter. Denne metode har titlen MAAC (membran modne adipocyte samlede kultur), og sammenlignet med andre adipocyte in vitro modeller, MAAC besidder en adipogenic gensignatur, der er tættest på frisk isolerede modne adipocytter. Ved hjælp af MAAC, kan adipocytter dyrkes fra magert og fede patienter, forskellige fedt depoter, co-kulturmed forskellige celletyper, og vigtigere, kan holdes i kultur i 2 uger. Funktionelle eksperimenter kan også udføres på MAAC herunder glukose optagelse, lipogenese, og lipolyse. Desuden reagerer MAAC robust på forskellige farmakologiske agonisme og kan bruges til at studere adipocyte fænotypiske ændringer, herunder transdifferentiering af hvide adipocytter i brunlignende fedtceller.
Den verdensomspændende stigning i fedme og fedme-relaterede co-morbiditeter kræver udvikling af nye terapeutiske. Hvidt fedtvæv (WAT) er en vigtig regulator af hele kroppen stofskifte, energi homøostase, og er en central aktør i udviklingen af insulinresistens og type 2 diabetes (T2D)1,2. Under kronisk overskydende kalorieforbrug, adipocytter udvide til at håndtere overskuddet af energi. Men, adipocyte lipid lagerkapacitet kan blive overskredet, hvilket resulterer i en stigning i cirkulerende niveauer af fedtsyrer og øget opbevaring i perifere ikke-fedtvæv og fører til lipotoksicitet3,4.
Manglen på adipocyte in vitro-modeller med høj translationel relevans er en central udfordring i udviklingen af nye behandlinger for fedme og T2D. Ex vivo explant model, hvor små stykker fedtvæv er dyrket, er forbundet med hurtige ændringer i adipogene genekspression drevet af hypoxi og betændelse5,6. Loftkulturer (CC’er), hvor modne adipocytter flyder og klæber til toppen af mediefyldte kolber, hurtigt dedifferentieres til fibroblastlignende celler, der mangler lipid7,8,9,10. Den mest almindeligt anvendte model er adipocytter differentieret in vitro fra engagerede prækursorer. De differentierede celler er dog morfologisk adskilt fra modne adipocytter in vivo, da de er meget mindre i størrelse og mangler en unilocular lipid dråbe. Andre begrænsninger med denne model omfatter det ufysiologiske behov for en kemisk cocktail for at drive differentiering samt variation i differentieringseffektivitet , som kan påvirkes af en række faktorer11,12,13,14.
Vi har for nylig udviklet membran modne adipocyte samlede kultur (MAAC), en metode til langsigtet kultur af friskisolerede modne adipocytter, hvor adipocytter er dyrket under gennemtrængelige membraner10. Uvildig analyse af RNA-sekventeringsdata har vist, at maac i forhold til fedtvævsexplanter og in vitro-differentierede adipocytter minder mest om friskisolerede adipocytter. MAAC kan bruges til at dyrke modne adipocytter isoleret fra både subkutane og visceral fedtvæv, samt adipocytter fra både fede og magert emner. Denne metode gør det muligt at studere langsigtede adipocyte fænotypiske ændringer og letter co-kultur af adipocytter med andre celletyper. Her giver vi en detaljeret protokol for isolering af modne adipocytter fra humant fedtvæv, og hvordan man opretter MAAC-systemet.
Membran modne adipocyte samlede kultur (MAAC) er en ny metode til den langsigtede kultur af frisk isolerede modne adipocytter. Ved oprettelsen af MAAC er der et par kritiske trin i protokollen, der i høj grad påvirker udbyttet, kvaliteten og levedygtigheden af de modne adipocytter. En stor indsats bør sættes i hakke fedt i trin 3,2, da dette trin direkte påvirker den tid adipocytter er udsat for kollagen. Hvis fedtstykkerne er for store, skal fordøjelsestiden forlænges, hvilket påvirker cellernes levedygtighed negativt. Omvendt, hvis vævet behandles for fint med en saks, levedygtighed kan påvirkes så godt. For en vellykket kultur af modne adipocytter som MAAC, bør man være særlig opmærksom på følgende trin: for en vellykket seedning af adipocytter på membranerne, er det afgørende, at gratis lipid og fremførsel vask buffer fjernes fra de modne adipocytter i trin 5.3 og 5.4. Resterende lipid eller vask buffer vil reducere overfladen spænding adipocytter og øge risikoen for adipocytter dryppende-off membranerne, når de er vendt. Når adipocytter er seedet og i medierne, forbliver cellerne i kontakt med membranen primært gennem opdrift, og dermed anbefales en langsom og blid teknik, når medierne skifter til ikke at miste celler. Fjern medier fra bunden af brøndene som beskrevet i trin 7.1, og tilføj medier ved langsomt at pipettere medier ned ad siderne af væggene. Endelig er et forslag til tidsbesparelse at forberede pladerne med medier og behandlinger før adipocyte isolationsprocessen. Især for komplekse eksperimentelle designs, pre-forberede pladerne kan spare meget tid og sikrer, at adipocytter er placeret i medierne med deres behandlinger, så snart de er isoleret.
En fordel ved at bruge MAAC i forhold til at differentiere preadipocytter er, at MAAC medier, der anvendes, er meget enkel og kræver ikke en ufysiologisk hormon cocktail. Her har vi dyrket MAAC i glukose-rige medier (DMEM/F12), 10% FBS, 1% penn / strep, og 20 nM insulin. Vigtigere er det, vi har konstateret, at insulin er absolut nødvendig for rosiglitazone / pioglitazone drevet induktion af UCP110. Insulin er dog ikke forpligtet til at opretholde cellernes adipogene fænotype. Afhængigt af det eksperimentelle spørgsmål kan insulin derfor medtages eller udelades.
Proceduren beskrevet ovenfor er blevet optimeret til isolering og kultur af menneskelige adipocytter. Men, mus, og muligvis andre organisme adipocytter, kan også dyrkes som MAAC. Hvis mus adipocytter skal dyrkes som MAAC der er yderligere overvejelser og forholdsregler, der bør holdes i tankerne. Vi har konstateret, at modne adipocytter fra mus er langt mere skrøbelige end dem fra mennesker. Som følge heraf bør fordøjelsestiden forkortes til et absolut minimum for at øge cellelevedygtigheden. Vi fandt også ud af, at adipocytter fra unge mus (8 uger gamle og yngre) gav de mest robuste og reproducerbare resultater. Endelig kan mus MAAC dyrkes i op til en uge, men da deres adipogene fænotype synes mindre stabil end mennesker (som kan dyrkes gennem mindst to uger) anbefaler vi dyrkning mus MAAC for den mindste nødvendige tid til at løse eksperimentelle spørgsmål.
Da MAAC-modellen er baseret på brug af gennemtrængelige membraner, er en fordel ved denne teknik muligheden for at sammensmelte modne adipocytter med andre celletyper. Vi har tidligere vist evne til modne adipocytter og makrofager til krydstale gennem brug af MAAC10. Dette åbner mulighed for yderligere at udforske forbindelsen mellem fedme, insulinresistens, og immunrespons15,16,17. Fremtidige eksperimenter kan omfatte andre celletyper såsom hepatocytter, preadipocytter, endotelceller eller pancreasceller for yderligere at øge kompleksiteten og den translationelle relevans af MAAC-modellen og undersøge krydstale mellem flere celletyper.
Selv om MAAC har vist sig at være overlegen i forhold til at opretholde funktionalitet og identitet adipocytter i forhold til andre adipocyte in vitro modeller, det har også begrænsninger, der skal overvejes. I forhold til at bruge adipocytter differentieret fra prækursorceller, MAAC er en mere besværlig og tidskrævende model. Plader med membraner er også dyrere i forhold til almindelige cellekulturplader. Det er vigtigt, at modne adipocytter skal være friskisolerede hver gang ved såning og kan ikke udvides eller fryses til bestande som prækursorceller. Dette kræver således at have adgang til friske hvide fedtvævsprøver, men tilføjer også et kompleksitetsniveau, der stammer fra donor til donorvariationer.
Her har vi fremlagt en detaljeret protokol for isolering af modne menneskeadipocytter og opsætning af MAAC. Vi har vist, at adipocytter dyrket som MAAC forbliver levedygtige gennem to uger, deres adipogene gensignatur bevares, og de reagerer på forskellige farmakologiske agonisme. Brug AF MAAC giver mulighed for undersøgelse af cross-talk betweeen adipocytter og andre celletyper, og vurderingen af langsigtede fænotypiske ændringer af modne adipocytter som reaktion på forskellige stimuli.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Xiao-Rong Peng og Stefan Hallen for at have skaffet ressourcer og optimeret adipocytisolationen Martin Uhrbom for teknisk bistand, og Daniel Olausson og Malin Lönn for at koordinere og levere den menneskelige fedt.
Autoclaved scissors | |||
Autoclaved spoons | |||
Autoclaved tweezers | |||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
Buffer RLT | QIAGEN | 79216 | Lysis buffer |
CaCl2*2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | |
Conical tubes, 50 mL | |||
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm | Thermo Scientific | 156-4020 | 500 mL |
Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm | Thermo Scientific | 158-0020 | 1000 mL |
HBSS+CaCl2+MgCl2 | Gibco | 14065-49 | |
HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
Insulin (Actrapid Penfill) | Novo Nordisk A/S | ||
KCl | Merck | 104936 | |
KH2PO4 | Merck | 104873 | |
Medium 199 | Gibco | 10012-011 | |
Mesh filter (250 µM) | Sintab AB | 6111-025043 | |
MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Needles, 18G, 1.20×40 mm | Sterican | 613-2948 | |
Pencillin-Streptomycin (Penn/Strep) | Gibco | 15140 | |
Petri dishes, 150×21 mm | Thermo Scientific | 168381 | |
Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
Quantstudio 7 Flex Real-Time PCR machine | Applied Biosystems | ||
RNeasy Mini kits | QIAGEN | 74106 | |
Separation funnel | VWR | 527-0008 | For large scale preparation |
Separation funnel | VWR | 527-0005 | For small scale preparation |
Shaking incubator (37 °C) | |||
Syringes, 5 mL | Omnifix | 612-2892 | 100 st |
Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
Transwells, 24-well (6,5 mm) | Costar | 3397 | Permeable membrane inserts |
TRIzol reagent | Invitrogen | 10296010 | Lysis buffer |
Type 2 Collagenase | Worthington | LS004177 |