Membran mogna adipocyte aggregerad kultur (MAAC) är en ny metod för att kultur mogna mänskliga adipocyter. Här beskriver vi hur man isolerar adipocyter från mänsklig adipose och hur man ställer in MAAC.
Vit fettvävnad (WAT) dysregulation spelar en central roll i utvecklingen av insulinresistens och typ 2-diabetes (T2D). För att utveckla nya behandlingar för T2D krävs mer fysiologiskt relevanta in vitro adipocyte-modeller. Denna studie beskriver en ny teknik för att isolera och kultur mogna mänskliga adipocyter. Denna metod har rätt MAAC (membran mogen adipocyte aggregerad kultur), och jämfört med andra adipocyte in vitro modeller, maac har en adipogenic gen signatur som är närmast nyligen isolerade mogna adipocyter. Med hjälp av MAAC kan adipocyter odlas från magra och feta patienter, olika fettdepåer, samodlade med olika celltyper, och viktigast av allt, kan hållas i kultur i 2 veckor. Funktionella experiment kan också utföras på MAAC inklusive glukos upptag, lipogenesis, och lipolys. Dessutom svarar MAAC robust på olika farmakologiska agonism och kan användas för att studera adipocyte fenotypiska förändringar, inklusive transdifferentiering av vita adipocyter till brun-liknande fettceller.
Den globala ökningen av fetma och fetma-relaterade samsjuklighet kräver utveckling av nya therapeutics. Vit fettvävnad (WAT) är en viktig regulator av hela kroppenmetabolism, energi homeostas, och är en central aktör i utvecklingen av insulinresistens och typ 2-diabetes (T2D)1,2. Under kronisk överskott kaloriförbrukning, adipocyter förstora för att hantera överskott av energi. Emellertid, adipocyte lipid lagringskapacitet kan bli överskriden, vilket resulterar i en höjd av cirkulerande nivåer av fettsyror och ökad lagring i perifera icke-fettvävnad och leder till lipotoxicitet3,4.
Bristen på adipocyte in vitro modeller med hög translationell relevans är en viktig utmaning i utvecklingen av nya behandlingar för fetma och T2D. Ex vivo explant modell, där små bitar av fettvävnad odlas, är associerad med snabba förändringar i adipogenic gen uttryck drivs av hypoxi och inflammation5,6. Takkulturer (CCs) där mogna adipocyter flyter och håller sig till toppen av mediefyllda kolvar, snabbt dedifferentiate i fibroblast-liknande celler saknar lipid7,8,9,10. Den vanligaste modellen är adipocyter differentierade in vitro från engagerade prekursorer. De differentierade cellerna är dock morfologiskt åtskilda från mogna adipocyter in vivo eftersom de är mycket mindre i storlek och saknar en unilocular lipid dropp. Andra begränsningar med denna modell inkluderar det ofysiologiska behovet av en kemisk cocktail för att driva differentiering, samt variationer i differentiering effektivitet som kan påverkas av ett antal faktorer11,12,13,14.
Vi har nyligen utvecklat membran mogna adipocyte samlad kultur (MAAC), en metod för långsiktig kultur av nyisolerade mogna adipocyter, där adipocyter odlas under genomsläppliga membran10. Opartisk analys av RNA sekvenseringdata har visat att i förhållande till fettvävnadsväxter och in vitro-differentierade adipocyter är MAAC mest lik nyisolerade adipocyter. MAAC kan användas för att odla mogna adipocyter isolerade från både subkutan och visceral fettvävnad, samt adipocyter från både feta och magra ämnen. Denna metod tillåter studiet av långsiktiga adipocyte fenotypiska förändringar och underlättar samodling av adipocyter med andra celltyper. Här ger vi ett detaljerat protokoll för isolering av mogna adipocyter från mänsklig fettvävnad och hur man ställer in MAAC-systemet.
Membran mogen adipocyte aggregerad kultur (MAAC) är en ny metod för den långsiktiga kulturen av nyisolerade mogna adipocyter. Vid inrättandet maac finns det några kritiska steg i protokollet som i hög grad påverkar avkastning, kvalitet och lönsamhet av de mogna adipocyter. Mycket arbete bör läggas på att malet fett i steg 3,2 eftersom detta steg direkt påverkar den tid adipocyter utsätts för kollagen. Om delar av fettär för stora, måste matsmältningstiden förlängas vilket negativt påverkar cellernas livskraft. Omvänt, om vävnaden bearbetas för fint med sax, kan livskraften påverkas också. För framgångsrik kultur av mogna adipocyter som MAAC, bör man ägna särskild uppmärksamhet åt följande steg: för framgångsrik sådd av adipocyter på membranen, är det viktigt att fri lipid och överföring tvätta buffert tas bort från mogna adipocyter i steg 5.3 och 5.4. Återstående lipid eller tvätt buffert kommer att minska ytspänningen i adipocyter och öka risken för adipocyter droppande-off membranen när de vänds. När adipocyterna är seedade och i media, cellerna förblir i kontakt med membranet främst genom flytkraft, alltså en långsam och mild teknik rekommenderas när du byter media för att inte förlora celler. Ta bort media från botten av brunnarna som beskrivs i steg 7.1 och lägg till media genom att långsamt pipetting media ner sidorna av väggarna. Slutligen är ett tidsbesparande förslag att förbereda plattorna med media och behandlingar innan adipocyte isoleringsprocessen. Särskilt för komplexa experimentella mönster, pre-förbereda plattorna kan spara mycket tid och säkerställer att adipocyter placeras i media med sina behandlingar så snart de är isolerade.
En fördel med att använda MAAC jämfört med att skilja preadipocytes är att MAAC media används är mycket enkel och inte kräver en ofysiologisk hormon cocktail. Här har vi odlade MAAC i glukos-rika medier (DMEM/F12), 10% FBS, 1% penn / strep, och 20 nM insulin. Viktigt, Vi har funnit att insulin absolut krävs för rosiglitazone/pioglitazone driven induktion av UCP110. Insulin, dock, krävs inte för att upprätthålla cellernas adipogena fenotyp. Beroende på den experimentella frågan kan insulin därför inkluderas eller utelämnas.
Förfarandet ovan har optimerats för isolering och kultur av mänskliga adipocyter. Men mus, och eventuellt andra organismers adipocyter, kan också odlas som MAAC. Om mus adipocyter ska odlas som MAAC finns det ytterligare överväganden och försiktighetsåtgärder som bör hållas i åtanke. Vi har funnit att mogna adipocyter från möss är mycket bräckligare än de från människor. Som ett resultat bör matsmältningstiden förkortas till ett absolut minimum för att öka celllönsamheten. Vi fann också att adipocyter från unga möss (8 veckor gamla och yngre) gav de mest robusta och reproducerbara resultaten. Slutligen kan musen MAAC odlas i upp till en vecka, men med tanke på att deras adipogenic fenotyp verkar mindre stabil än människor (som kan odlas genom minst två veckor) rekommenderar vi odling mus MAAC för minsta nödvändiga tid att ta itu med experimentella frågor.
Eftersom MAAC-modellen är baserad på att använda genomsläppliga membran, är en fördel med denna teknik möjligheten att sammogna mogna adipocyter med andra celltyper. Vi har tidigare visat förmågan hos mogna adipocyter och makrofager att övergå med hjälp av MAAC10. Detta öppnar möjligheter att ytterligare utforska kopplingen mellan fetma, insulinresistens och immunsvar15,16,17. Framtida experiment skulle kunna innehålla andra celltyper såsom hepatocyter, preadipocytes, endotelceller eller bukspottskörteln celler för att ytterligare öka komplexiteten och translationella relevansen av MAAC-modellen och undersöka tvärkort mellan flera celltyper.
Även om MAAC har visat sig vara överlägsen upprätthålla funktionalitet och identitet adipocyter i förhållande till andra adipocyte in vitro modeller, har det också begränsningar som måste beaktas. I jämförelse med att använda adipocyter differentierade från prekursorceller, maac är en mer mödosam och tidskrävande modell. Plattor med membran är också dyrare jämfört med vanliga cellodlingsplattor. Viktigt, mogna adipocyter måste nyligen isoleras varje gång på sådd och kan inte utvidgas eller frysas i bestånd som prekursorceller. Detta kräver således tillgång till färska vita fettvävnadsprover, men lägger också till en nivå av komplexitet som härrör från givare till givare variationer.
Här har vi lagt fram ett detaljerat protokoll för isolera nde mänskliga mogna adipocyter och inrätta MAAC. Vi har visat att adipocyter odlade som MAAC förblir livskraftig genom två veckor, deras adipogenic gen signatur bevaras, och de svarar på olika farmakologiska agonism. Med hjälp av MAAC möjliggör studier av cross-talk betweeen adipocytes och andra celltyper, och bedömningen av långsiktiga fenotypiska förändringar av mogna adipocyter som svar på olika stimuli.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Xiao-Rong Peng och Stefan Hallen för att de har resurser och optimerat isoleringen, Martin Uhrbom för teknisk assistans och Daniel Olausson och Malin Lönn för att de koordinerade och tillhandahåller den mänskliga adiposen.
Autoclaved scissors | |||
Autoclaved spoons | |||
Autoclaved tweezers | |||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
Buffer RLT | QIAGEN | 79216 | Lysis buffer |
CaCl2*2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | |
Conical tubes, 50 mL | |||
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm | Thermo Scientific | 156-4020 | 500 mL |
Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm | Thermo Scientific | 158-0020 | 1000 mL |
HBSS+CaCl2+MgCl2 | Gibco | 14065-49 | |
HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
Insulin (Actrapid Penfill) | Novo Nordisk A/S | ||
KCl | Merck | 104936 | |
KH2PO4 | Merck | 104873 | |
Medium 199 | Gibco | 10012-011 | |
Mesh filter (250 µM) | Sintab AB | 6111-025043 | |
MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Needles, 18G, 1.20×40 mm | Sterican | 613-2948 | |
Pencillin-Streptomycin (Penn/Strep) | Gibco | 15140 | |
Petri dishes, 150×21 mm | Thermo Scientific | 168381 | |
Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
Quantstudio 7 Flex Real-Time PCR machine | Applied Biosystems | ||
RNeasy Mini kits | QIAGEN | 74106 | |
Separation funnel | VWR | 527-0008 | For large scale preparation |
Separation funnel | VWR | 527-0005 | For small scale preparation |
Shaking incubator (37 °C) | |||
Syringes, 5 mL | Omnifix | 612-2892 | 100 st |
Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
Transwells, 24-well (6,5 mm) | Costar | 3397 | Permeable membrane inserts |
TRIzol reagent | Invitrogen | 10296010 | Lysis buffer |
Type 2 Collagenase | Worthington | LS004177 |