우리는 지방 조직 신진 대사 표현형에 기여에 매트릭스 및 지방 세포의 역할의 해부를 허용하는 시험관 내 3D 인간 세포 외 매트릭스 -adipocyte를 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
세포외 매트릭스 (ECM)는 조직 항상성을 조절하고 세포와의 크로스 토크에 참여하고 세포 기능의 여러 측면을 조절하는 데 핵심적인 역할을합니다. ECM은 비만에서 지방 조직 기능에 특히 중요한 역할을 하며, 지방 조직 ECM 증착 및 조성물의 변화는 마우스 및 인간에서 대사 질환과 관련이 있다. 글로벌 조직 표현형에 기여하는 ECM 및 세포의 역할의 해부를 허용하는 견인성 체외 모델은 희소하다. 우리는 지방 조직 신진 대사 표현형을 조절에 ECM 및 지방세포의 특정 역할의 연구를 허용하는 인간 ECM-지방세포 문화의 새로운 3D 체외 모형을 기술합니다. 인간 지방 조직은 ECM을 분리하기 위해 탈세포화되며, 이는 이후에 ECM 내에서 성숙한 지방세포로 분화되는 preadipocytes로 다시 채워집니다. 이 방법은 대사적으로 활성화되어 있는 ECM-adipocyte 구조를 생성하고 조직과 환자가 파생되는 특성을 유지합니다. 우리는 인간 지방 조직에서 질병 특이적 ECM-지방 세포 누토크를 입증하기 위해이 시스템을 사용했습니다. 이러한 배양 모델은 글로벌 지방 조직 대사 표현형에 기여하는 ECM 및 지방세포의 역할을 해부하는 도구를 제공하고 지방 조직 항상성을 조절하는 ECM의 역할에 대한 연구를 허용한다.
서론
세포외 매트릭스 (ECM)는 조직에 대한 기계적 스캐폴드를 제공 할뿐만 아니라 그 안에 있는 세포와 복잡한 크로스 토크에 종사하여 세포 증식을 포함한 조직 항상성에 필요한 다양한 과정을 조절합니다. 차별화, 신호 및 신진 대사1. 건강한 ECM은 정상적인 조직 기능의 유지에 필수적인 역할을하지만, 기능 장애 ECM은 여러 질병에 연루되어있다2.
지방 조직은 신진 대사 질환의 발병기전에 중요한 역할을합니다. 비만은 과도한 지방세포 비대 및 세포 저산소증, 지방세포 세포 대사의 결함, 지방 조직 산후 염기 및 산화 스트레스 및 염증과 관련이 있습니다. 제대로 이해하는 동안, 이러한 복잡한 과정은 지방 조직 영양소 버퍼링 용량을 손상공모, 지방 조직에서 영양 오버플로로 이어지는, 여러 조직의 독성, 및 전신 대사 질환3,4 ,5. 지방 조직 실패의 기초가 되는 사건 그리고 특정 기계장치의 순서는 제대로 이해되지 않습니다, 그러나 지방 조직 ECM에 있는 변경은 연루되었습니다. ECM 조성물은 인간 ....
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프로토콜
지방 조직은 기관 검토 위원회 승인하에 선택적인 bariatric 수술을 받고 인간 과목에서 조달됩니다.
1. Preadipocyte 격리 및 배양 시약 준비
- 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 2% 소 혈청 알부민(BSA)을 준비합니다. 필터 멸균, 4 °C에서 저장합니다.
- 타입 II 콜라게나아제 준비: 1x PBS에서 2% BSA에서 2 mg/mL. 사용하기 직전에 준비하십시오.
- 적혈구 (RBC) 용해 용액을 준비 : 1.5 M NH4Cl, 100 mM NaHCO3,탈이온수에서 10 mM 디 소듐 EDTA (DI / H2O). 4 °C에서 보관하십시오. 사용 직전에 DI/H2O의 10x 스톡 솔루션에서 1x RBC 용해 솔루션을 준비합니다.
- 성장 매체 준비: 15% 태아 소 혈 청 (FBS), 1% 항생제 항 균제 용액 (ABAM) 덜베코의 수정 된 독수리 매체에: 영양 혼합물 F-12 (DMEM/F12). 필터 멸균, 4 °C에서 저장합니다.
- Preadipocyte 동결 솔루션을 준비 : 10 % 디메틸 설폭사이드, DMEM / F12 미디어에서 15 % FBS. 필터 멸....
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결과
지방 조직 ECM의 준비, preadipocytes와 파종, 성숙한 지방 세포로 시험관 내 분화는 프로토콜 전반에 걸쳐 진행의 시각적 평가를 허용하는 조직에 명확한 순차적 형태 변화를 초래(그림 1) . ECM을 종하는 데 사용되는 Preadipocytes는 별도의 VAT 샘플로부터 콜라게나아제 소화를 사용하여 분리됩니다(그림2). 처리의 각 단계에서 ECM-adipocyte 구성의 주사 전자 현미경은 ECM의 탈세포화 및 재종 및 분화 시 지질 함유 지방세포의 후속 재캡을 밝혀냅니다(그림 3). 비세포화된 ECM의 콜라겐 1특이적 면역조직화학은 콜라겐 미세아키텍처의 유지를 밝혀내고, 오일 레드-O 염색은 살아있는 3D ECM-adipocyte 구조가 지질 함유지방세포(그림 .......
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토론
ECM-지방세포 배양 모델은 궁극적인 조직 표현형을 지시하는 ECM 및 세포의 개별적인 역할을 해부하기 위한 귀중한 공구를 제공합니다. ECM 격리 프로토콜은 매우 재현 가능하지만 탈세포화 과정의 가변성이 관찰될 수 있습니다. 3일째 삭제 단계는 프로토콜의 중요한 지점입니다. 하룻밤 추출이 완료되면 매트릭스는 노란색으로 변하는 극성 용매 용액에 의해 입증되어야하며, 매트릭스는 손상되지 않은 지방 조직의 노란색 - 주황색 특성에서 반투명 / 흰색(그림 1)을참조하십시오. 이러한 색상 변경이 발생하지 않으면 삭제가 완료되지 않을 수 있습니다. 지질 효율성에 있는 환자 간 가변성은 일반적입니다, 그러나 현재까지 우리는 대상 DM 상태, 나이, BMI, 또는 그밖 임상 변수를 가진 삭제의 효율성의 어떤 상관관계도 관찰하지 않았습니다. 큰 샘플 (20g 이상)은 효율적인 지질 검사를 받지 않습니다. 처리 샘플 <20 g는이 문제를 방지 할 수 있습니다. 3일차 이후에 시료가 완전히 제.......
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공개 사항
저자는 상충하는 이해관계를 선언하지 않습니다.
감사의 글
다니엘 버거, 마릴린 우드럽, 시몬 코레아, 레타 가이스에게 연구 조정에 도움을 주신 것에 감사드립니다. SEM은 미시간 대학 현미경 검사법 및 이미지 분석 실험실 생물 의학 연구 핵심 시설에 의해 수행되었습니다. 이 프로젝트는 NIH 보조금 R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), 재향 군인 업무 공로 그랜트 I01CX001811 (RWO), 미시간 당뇨병 연구 센터 (NIH 그랜트 P30-DK020572)에서 파일럿 및 타당성 부여 (RWO), 재향 군인 관리 VISN 10 스파크 파일럿 그랜트 (RWO). 미시간 대학 현미경 검사법 및 이미지 분석 실험실 생물 의학 연구 핵심 시설에 의해 수행 된 주사 전자 현미경 검사법. 이 원고의 그림 4는 원래 베이커 외, J 클린 엔도 Metab 2017에 게시되었습니다; 3월 1;102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, 옥스포드 대학 출판부 [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]의 허가에 의해 복제되었습니다. 이 자료를 재사용할 수 있는 권한을 받으려면 http://global.oup.com/academic/rights 방문하십시오.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 트립신-EDTA | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#25200056 | |
| 1.5mL 극저온 튜브 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#02-682-557 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#89370-094 | |
| 100 µ m 나일론 메쉬 필터 | Corning Inc., Corning, NY, USA | Cat#352360 | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#D8375 | |
| 2 nM 3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T6397 | |
| 24웰 조직 배양 플레이트 | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-700 | |
| 3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX) | Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스 | Cat#I5879 | |
| 96웰 조직 배양 플레이트 | VWR International LLC., 미국 펜실베이니아주 래드너 | Cat#10861-666 | |
| 항생제-항진균 용액(ABAM) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#15240062 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스 | Cat#B4639 | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | Sigma-Aldrich, Inc., 미국 미주리주 세인트루이스 | Cat#A8806 | |
| Buffer RLT | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#79216 | |
| Ciglitizone | Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스 | Cat#C3974 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]- | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | Cat#NET328A250UC | |
| 소 췌장에서 추출한 디옥시리보뉴클레아제 I, 유형 II-S | Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스 | Cat#D4513 | |
| 덱사메타손 | Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스 | Cat#D4902 | |
| 디메틸 설폭사이드 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP231 | 가연성, 가성 |
| 이나트륨 EDTA | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA 미국 | Cat#BP118 | |
| D-판토텐산 헤미칼슘염 | Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스 | Cat#21210 | |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#11320033 | |
| Ethanol | Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA | Cat#DSP-MD.43 | Flammable |
| EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., 미국 매사추세츠주 월섬 | Cat#10437028 | |
| 글루타르알데히드 | Sigma-Aldrich, Inc., 미국 미주리주 세인트루이스 | Cat#G5882 | 가성 |
| 헥사메틸디살리잔 | Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스 | Cat#440191 | 가연성 가성인간 |
| 인슐린 용액 | Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스 | Cat#I9278 | |
| 이소프로판올 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A415 | 가연성 |
| 이소프로테레놀 | Sigma-Aldrich, Inc., 미국 미주리주 세인트루이스 | Cat#I5627 | 가연성 |
| KCl | Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스 | Cat#S25484 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스 | Cat#P5655 | |
| 돼지 췌장에서 추출한 리파아제, 유형 VI-S | Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스 | Cat#L0382 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스 | Cat#230391 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스 | Cat#S5136 | |
| NaCl Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스 | Cat#S3014 | ||
| NaHCO3 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#S233 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A661 | |
| 최적 절단 온도(OCT) 화합물 | Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK | Cat# AGR1180 | |
| Oil Red-O Solution (ORO) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#O1391 | |
| Oil Red-O Stain Kit | American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA | Cat#KTORO-G | |
| Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스 | Cat#201030 | Caustic |
| 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF) | Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스 | Cat#93482 | 가성 |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SH3025601 | |
| 소 췌장에서 추출한 리보뉴클레아제 A, III-A형 | Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스 | Cat#R5125 | |
| RNAEasy 섬유 조직 MiniKit | Qiagen, 독일 힐덴 | Cat#74704 | |
| 섬광 유체 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., 미국 매사추세츠주 월섬 | Cat#SX18 | |
| 섬광 카운터 | |||
| 가위, 집게, 멸균 | |||
| Sorensen의 인산염 완충액 | Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ | CAS #: 10049-21-5 | |
| T-150 배양 플라스크 | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10062-864 | |
| TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스 | ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#4369016 | |
| 온도 제어 궤도 쉐이커 | |||
| 조직 균질화기, BeadBug 마이크로튜브 균질화기 | 벤치마크 Scientific | Cat#D1030 | |
| 트랜스페린 | Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스 | Cat#T3309 | |
| 트리글리세리드 측정 키트 | Sigma-Aldrich, Inc., 미국 미주리주 세인트루이스 | Cat#TR0100 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Type II collagenase | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#17101015 | |
| Whatman Reeve Angel 여과지, 등급 201, 150mm | Sigma-Aldrich, Inc., 미국 미주리주 세인트루이스 | Cat#WHA5201150 |
참고문헌
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Trayhurn, P.
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