Een menselijke 3D-extracellulaire matrix-Adipocyte cultuur model voor het bestuderen van matrix-cel metabole Overspraak
Summary
We beschrijven een 3D menselijke extracellulaire matrix-adipocyte in vitro cultuur systeem dat het mogelijk maakt dissectie van de rollen van de matrix en adipocytes in bij te dragen tot vetweefsel metabole fenotype.
Abstract
De extracellulaire matrix (ECM) speelt een centrale rol bij het reguleren van weefselhomeostase, het betrekken van Overspraak met cellen en het reguleren van meerdere aspecten van cellulaire functie. De ECM speelt een bijzonder belangrijke rol in de vetweefsel functie bij obesitas, en veranderingen in vetweefsel ECM afzetting en samenstelling zijn geassocieerd met metabole ziekte bij muizen en mensen. Tractable in vitro-modellen die een dissectie van de rollen van de ECM mogelijk maken en cellen die bijdragen aan het wereldwijde weefsel fenotype zijn schaars. We beschrijven een roman 3D in vitro model van menselijke ECM-adipocyte cultuur die het mogelijk maakt studie van de specifieke rollen van de ECM en adipocytes in het reguleren van vetweefsel metabole fenotype. Humaan vetweefsel is decellularized te isoleren van ECM, die vervolgens wordt herbevolkt met preadipocytes die vervolgens worden gedifferentieerd binnen de ECM in volwassen adipocytes. Deze methode creëert ECM-adipocyten constructies die metabolisch actief zijn en kenmerken van de weefsels en patiënten waarvan zij afkomstig zijn, behouden. We hebben dit systeem gebruikt om ziekte-specifieke ECM-adipocyten overspraak in menselijk vetweefsel aan te tonen. Dit cultuur model biedt een hulpmiddel voor het ontleden van de rollen van de ECM en adipocytes in het bijdragen aan wereldwijd adipeus weefsel metabole fenotype en maakt studie van de rol van de ECM in het reguleren van vetweefsel homeostase.
Introduction
De extracellulaire matrix (ECM) biedt niet alleen een mechanische steiger voor weefsels, maar houdt ook in complexe Overspraak met cellen die erin wonen, reguleren van diverse processen die nodig zijn voor weefselhomeostase, met inbegrip van celproliferatie, differentiatie, signalering en metabolisme1. Terwijl gezonde ECM een essentiële rol speelt bij het behoud van de normale weefsel functie, is disfunctionele ECM betrokken bij meerdere ziekten2.
Vetweefsel speelt een belangrijke rol in de pathogenese van metabole ziekten. Obesitas wordt geassocieerd met overmatige adipocyte hypertrofie en cellulaire hypoxie, defecten in adipocyte cellulaire metabolisme, en vetweefsel endoplasmisch reticulum en oxidatieve stress en ontsteking. Terwijl slecht begrepen, deze complexe processen samenspannen te beschadigen vetweefsel nutriënten buffercapaciteit, wat leidt tot nutriënten overloop van vetweefsel, toxiciteit in meerdere weefsels, en systemische metabole ziekte3,4 ,5. De opeenvolging van gebeurtenissen en specifieke mechanismen die ten grondslag liggen aan vetweefsel falen zijn slecht begrepen, maar wijzigingen in adipeus weefsel ECM zijn betrokken. De samenstelling van de ECM is veranderd in vetweefsel in menselijke en muriene obesitas, met verhoogde afzetting van ECM-eiwitten samen met kwalitatieve biochemische en structurele verschillen in de vetweefsel-ECM geassocieerd met menselijke metabole ziekte, waaronder type 2 diabetes en hyperlipidemie6,7,8,9,10,11.
Ondanks deze observaties, de rol van adipeus weefsel ecm in bemiddelen vetweefsel dysfunctie is niet goed gedefinieerd. Dit is deels te wijten aan een gebrek aan Tractable experimentele modellen die een dissectie van de specifieke rollen van ECM en adipocytes in de regulering van Ultimate adipeus weefsel functie toestaan. ECM-adipocyten cultuur simuleert beter de in vivo omgeving van native vetweefsel in ten minste twee opzichten. Ten eerste biedt de ECM-cultuur een moleculaire omgeving die lijkt op inheems vetweefsel, inclusief inheemse collagens, Elastinen en andere matrix proteïnen die afwezig zijn in de standaard 2D-cultuur. Ten tweede is de cultuur op 2D-plastic aangetoond dat het adipocyten metabolisme verandert via mechanische effecten als gevolg van een verminderde elasticiteit van kunststof substraat12, die de ECM-cultuur elimineert.
Methoden om biologische steigers te engineeren door isolatie van ECM uit decellularized vetweefsel en andere weefsels zijn bestudeerd in de context van regeneratieve en reconstructieve geneeskunde en weefsel engineering13,14, 15,16,17,18. We hebben eerder de methodologie gepubliceerd waarin we deze methoden hebben aangepast om een in vitro 3D-model van humane ECM-adipocyten cultuur te ontwikkelen, met behulp van ECM en adipocyten stamcellen (preadipocytes) afgeleid van humane viscerale vetweefsels11. In dit artikel beschrijven we deze methoden in detail. De decellularisatie procedure voor menselijk vetweefsel is een vierdaags proces waarbij mechanische en enzymatische behandelingen worden uitgevoerd om cellen en lipide te verwijderen, waardoor een biologische steiger blijft die kenmerken van het weefsel behoudt waaruit het is afgeleid. Decellularized ECM ondersteunt adipogenic differentiatie van menselijke preadipocytes, en wanneer gereconstitueerd met adipocytes, onderhoudt microarchitectuur en biochemische en ziekte-specifieke kenmerken van intact vetweefsel en houdt zich bezig met metabole functies die kenmerkend zijn voor inheemse vetweefsel. Deze matrix kan alleen worden bestudeerd of herplaatst met cellen, het toestaan van studie van interacties en overspraak tussen de cellulaire en extra-cellulaire componenten van vetweefsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
De ECM-adipocyte cultuur model biedt een waardevol hulpmiddel voor het ontleden van de individuele rollen van ECM en cellen in het dicteren van Ultimate tissue fenotype. Het ECM-isolatie protocol is vrij reproduceerbaar, maar de variabiliteit in het decellularisatie proces kan worden waargenomen. De dag 3 delipidation stap is een cruciaal punt in het protocol. Bij de voltooiing van de nachtelijke extractie, moet delipidatie van de matrix worden aangetoond door de polaire oplosmiddel oplossing geel te worden, terwijl de m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa en Retha Geiss voor hulp bij studie coördinatie. SEM werd uitgevoerd door de Universiteit van Michigan microscopie & beeldanalyse laboratorium biomedisch onderzoek kern faciliteit. Dit project werd gesteund door NIH grants R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans affaires Merit Grant I01CX001811 (RWO), pilot en haalbaarheids subsidie van het Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Veteranen Administratie VISN 10 SPARK pilot Grant (RWO). Scanning elektronenmicroscopie uitgevoerd door de Universiteit van Michigan microscopie & beeldanalyse laboratorium biomedisch onderzoek kern faciliteit. Figuur 4 van dit manuscript werd oorspronkelijk gepubliceerd in Baker et al., J Clin Endo Metab 2017; Mar 1; 102 (3), 1032-1043. DOI: 10.1210/JC. 2016-2915, en is gereproduceerd met toestemming van Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Voor toestemming om dit materiaal te hergebruiken, gaat u naar http://global.oup.com/academic/rights.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#25200056 | |
| 1.5 mL cryovial tube | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#02-682-557 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#89370-094 | |
| 100 µm nylon mesh filter | Corning Inc., Corning, NY, USA | Cat#352360 | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#D8375 | |
| 2 nM 3,3’-5,Triiodo,L-thyronine sodium salt (T3) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T6397 | |
| 24-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-700 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I5879 | |
| 96-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-666 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#15240062 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#B4639 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#A8806 | |
| Buffer RLT | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#79216 | |
| Ciglitizone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#C3974 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]- | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | Cat#NET328A250UC | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4513 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4902 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP231 | Flammable, caustic |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP118 | |
| D-pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#21210 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#11320033 | |
| Ethanol | Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA | Cat#DSP-MD.43 | Flammable |
| EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#10437028 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#G5882 | Caustic |
| Hexamethyldisalizane | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#440191 | Flammable, caustic |
| Human insulin solution | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I9278 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A415 | Flammable |
| Isoproterenol | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#I5627 | Flammable |
| KCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S25484 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#P5655 | |
| Lipase from porcine pancreas, type VI-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#L0382 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#230391 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#S233 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A661 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK | Cat# AGR1180 | |
| Oil Red-O Solution (ORO) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#O1391 | |
| Oil Red-O Stain Kit | American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA | Cat#KTORO-G | |
| Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#201030 | Caustic |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#93482 | Caustic |
| Phosphate Buffered Saline Solution (PBS) | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SH3025601 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#R5125 | |
| RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#74704 | |
| Scintillation Fluid | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SX18 | |
| Scintillation Counter | |||
| Scissors, forceps, sterile | |||
| Sorensen's phosphate buffer | Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ | CAS #: 10049-21-5 | |
| T-150 culture flask | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10062-864 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#4369016 | |
| Temperature-controlled orbital shaker | |||
| Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer | Benchmark Scientific | Cat#D1030 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T3309 | |
| Triglyceride Determination Kit | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#TR0100 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Type II collagenase | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#17101015 | |
| Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#WHA5201150 |
References
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).
- O’Rourke, R. W., Lumeng, C. N. Obesity heats up adipose tissue lymphocytes. Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).
- Engin, A. The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).
- Dankel, S. N., et al. COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size. Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).
- Divoux, A., et al. Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss. Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).
- Lackey, D. E., et al. Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).
- Muir, L. A., et al. Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity. Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).
- Spencer, M., et al. Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).
- Baker, N. A., et al. Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).
- Pellegrinelli, V., et al. Human adipocyte function is impacted by mechanical cues. Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).
- Flynn, L. E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Porzionato, A., et al. Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine. European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).
- Tebyanian, H., et al. A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering. Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
- Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O’Rourke, R. W. Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes. Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).
- O’Rourke, R. W., et al. Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia’s effects on lipid metabolism in human adipocytes. PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Tchoukalova, Y. D., et al. Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans. Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).
